survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

survivin启动子的克隆及在HeLa细胞中控制GFP特异性表达

目的: 扩增survivin基因启动子并构建带有survivin启动子的pEGFP-N1真核表达载体 ,检测survivin基因启动子在HeLa细胞中的特异表达活性.方法: ①以HeLa细胞基因组DNA为模板,PCR 扩增survivin启动子,回收扩增产物并插入pGEM-TEasy载体(T/Surp),测序鉴定.②分别双酶切 T/Surp载体和不含CMV启动子的pEGFP-N1载体,回收survivin启动子酶切片段及pEGFP-N1酶切线性化片段,连接回收产物构建携带survivin启动子pEGFP-N1真核表达载体(pEGFP-N1/ Surp),酶切鉴定 .③转染HeLa细胞及正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下观察GFP的表达.结果: 酶切及测序证实成功扩增survivin基因启动子,并构建了携带有survivin基因启动子的pEGFP-N1真核表达载体.转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见HeLa细胞发出较强的绿色荧光,而在ECV304细胞未见绿色荧光. 结论: 成功克隆的肿瘤特异性survivin启动子在HeLa细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础.     

携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体,检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,构建分别携带Survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pSurp-EGFP和pCMV-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Adeno-SP-EGFP和Adeno-CMV-EGFP,分别转染BIU87及SV-HUC-1,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP,其转染BIU87及SV-HUC-1后,在荧光显微镜下可以观察到BIU87细胞呈现出较强绿色荧光,而SV-HUC-1细胞中仅有散在少量绿色荧光。结论成功制备的携带有Survivin启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,为下一步进行肿瘤特异性的基因治疗研究奠定了基础。     

不同活性的survivin基因启动子片段的克隆及鉴定

目的 检测survivin在成体干细胞等细胞中的表达差异,克隆并比较3种不同片段长度survivin启动子的活性.方法 取成纤维母细胞10T1/2、成肌母细胞C2C12、真皮多能干细胞DMSC、人骨髓间充质干细胞BMSC、结肠腺癌细胞HT29、人胚肾母细胞293FT进行培养.用RT-PCR和免疫细胞化学染色检测survivin在成体干细胞和肿瘤细胞中的表达;用基因组DNA PCR和分子克隆等方法,构建不同长度的survivin基因启动子驱动荧光素酶报告基因表达的载体,经脂质体转染293FT细胞,测定相对荧光素酶活性以反映启动子活性.结果 survivin基因在正常成体干细胞中低表达,在成肌母细胞中中度表达,在结肠腺癌细胞HT29中高表达.克隆了不同片段长度的survivin基因启动子,并连接到荧光素酶cDNA 上游.在293FT细胞中,987 bp和160 bp的 survivin基因启动子活性高于270 bp的survivin启动子的活性.结论 survivin基因启动子由于肿瘤特异性和泛肿瘤表达的特点,可通过载体构建应用于监控和治疗移植后干细胞的恶性转化.用高活性survivin基因启动子构建的载体可能会提高其在监控和治疗中的效果.     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的：构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法：采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体, PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP -CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果：PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论：构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒

目的 构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法 应用PCR扩增出CD和TK基因，经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK。经酶切线性化后。转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌，获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒。滴度测定后，体外感染血管内皮细胞ECV304。结果 PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒，为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论 应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统，方法更简便、成功率更高、实验周期更短。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

pGenesi1-1-EGFP-shRNA／survivin真核表达载体构建及其表达验证

目的构建用survivin启动子驱动增强绿色荧光蛋白（EGFP）的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin并验证其在宫颈癌Caski细胞中的表达。方法用有活性的survivin启动子取代pGenesil-1-EGFP-shRNA／U6载体中的u6启动子从而获得新的shRNA真核表达载体pGenesil-1-EGFP—shRNA／survivin;将pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin转染到宫颈癌Cash细胞及正常人脐静脉内皮HuVEC细胞,观察EGFP在两种细胞中的表达变化。结果成功构建pGenesil-1-EGFP-shRNA／survivin载体,分别转染Caski及HuVEC细咆,在Caski细胞中观察到较少的绿色荧光蛋白表达,而在HuVEC细胞中观察到较多的绿色荧光蛋白表达。结论survivin启动子能驱动shRNA在宫颈癌Caski细胞中特异性表达,而在正常HuVEC细胞中不表达。     

hTERT基因启动子调控HSV-tk/GCV系统对HeLa细胞杀伤作用

目的:研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦(HSV-tk/GCV)系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法:构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/hTERT-tk,分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞(ECV304),新霉素(G418)筛选阳性克隆扩增. 用RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况;给予前药更昔洛韦(GCV),用流式细胞术检测hTERT调控的HSV-tk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果:hTERT启动子调控下的HSV-tk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用,使36.7%的细胞凋亡;而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论:hTERT启动子调控的tk基因治疗是一种具有肿瘤特异性的治疗方法,有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.     

重组腺病毒介导hCGPx转染致血管内皮细胞产生抗氧化损伤作用的研究

目的 研究重组腺病毒介导的人胞浆型谷胱甘肽过氧化物酶（hCGPx）转染对血管内皮细胞ECV304氧化损伤保护作用。方法 将含hCGPx cDNA的质粒pGEM-T-hCGPx和重组腺病毒载体pACCMV-pLpA穿梭质粒进行基因重组,构建成pACCMV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建成重组腺病毒AdCMV-hCGPx。用AdCMV—hCGPx转染体外培养的ECV304细胞并分为转染24、48和72h组,以转染空载体的细胞为对照组,检测转染细胞的基因表达水平。各组ECV304细胞经H2O2氧化损伤处理后,分别对细胞的活力和凋亡进行检测分析。结果 各转染组细胞转染基因表达率均显著高于对照组（P〈0．01）。经H2O2氧化损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞活力较对照组明显增强,凋亡受到抑制。结论 重组腺病毒介导的hCGPx转染可保护ECV304细胞抵抗氧化损伤,具有明确的细胞保护作用,其具体保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。     

低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

目的：构建携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF）,观察其在内皮细胞中的表达。 方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1α cDNA 设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。 结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为（48.93±3.86）ng/mL。 结论：本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。     

Ad-VEGI151对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用.方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达.X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达.结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法.Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质.结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法.     

eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响

目的设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelium-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1, eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响.方法设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ-HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上;转染重组质粒到ECV304细胞,通过定量RT-PCR实验检测靶基因的抑制情况;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV304细胞能够抑制靶基因eola1的表达;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后,细胞生长周期延长.结论成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV304细胞增殖的作用.     

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.