银杏叶提取物影响臂丛撕脱后运动神经元NOS表达及其存活

目的:观察EGb761对脊神经根撕脱后前角运动神经元的保护作用和对NOS表达的影响。方法:成年Sprague-Dawley雌性大鼠80只, 行脊髓C5-T1神经根撕脱术后, 治疗组每天腹腔注射1mLEGb761, 25mg·kg^-1·d^-1;对照组注射等量生理盐水。治疗后1周、2周、4周和6周分别处死动物, 取脊髓C7节段行NADPH-d组化和中性红染色, 计数各组动物损伤侧前角NOS阳性和中性红阳性的运动神经元数目, 比较组间差异显著性。结果:脊神经根撕脱后受损运动神经元NOS表达从1周开始, 2周达高峰, 4周-6周逐渐下降。运动神经元死亡以4周-6周最明显。EGb761能减少以上各时点NOS阳性运动神经元的数目, 提高各时点运动神经元的存活。结论:EGb761能下调运动神经元NOS基因表达, 提高受损运动神经元的存活。     

天然抗氧化剂减少神经根撕脱诱导的一氧化氮合酶表达和运动神经元死亡

为了研究抗老年性痴呆 990 1号和 TA990 1+银杏叶标准提取物合剂对臂丛神经根撕脱后前角运动神经元的神经元型一氧化氮合酶 ( n NOS)表达和存活的影响 ,用成年 SD雌性大鼠进行右侧臂丛 C5～ T1 神经根撕脱术后 ,随机分为撕脱组、撕脱 +TA990 1组以及撕脱 +TA990 1和 EGb761合剂组。对此三组每天分别进行腹腔注射 1ml生理盐水、0 .5 % TA990 1、0 .5 %TA990 1和 EGb761合剂。治疗 5 d、1、2、4和 6周后处死动物并进行 NADPH-d染色及中性红复染。定量比较各组 n NOS阳性和存活的运动神经元数量。结果证明 ,神经根撕脱后 5 d受损运动神经元开始表达 n NOS,2周时达高峰 ,随后下降至 6周。受损运动神经元的死亡从 2周开始 ,4～ 6周最明显。抗氧化剂治疗组 n NOS表达规律与对照组相似 ,但是阳性程度和阳性细胞数量均少于对照组 ,存活的运动神经元数量则明显多于对照组。撕脱后 4～ 6周 ,TA990 1治疗组抑制 n NOS表达和提高运动神经元存活的效果均明显优于 TA990 1和 EGb761合剂组。结论 :天然抗氧化剂可有效地减少臂丛神经根撕脱后 n NOS表达 ,提高受损运动神经元的存活。 TA990 1抑制 n NOS表达的作用强于 EGb761。     

TA9901配伍EGb761对神经根撕脱后脊髓运动神经元的影响

目的　观察植物抗氧化剂TA990 1配伍EGb76 1对臂丛神经根撕脱后C7前角运动神经元c jun、NOS表达和存活的影响。方法　成年SD雌性大鼠 12 0只 ,随机分为撕脱组和治疗组。行C5～T1神经根撕脱术后 ,两组动物每天分别给予腹腔注射 1ml生理盐水或 0 5 % (TA990 1配伍EGb76 1)溶液。治疗后 4h、12h、1d、3d、5d、1周、2周、4周和 6周处死动物 ,行c jun免疫细胞化学、NADPH d组织化学和中性红复染。比较两组动物c jun阳性、NOS阳性和存活的运动神经元的数目。结果　臂丛神经根撒脱 4h后c jun开始表达 ,1d达高峰 ,随后下降至 6周。nNOS表达从 5d开始 ,2周时达高峰 ,以后逐渐下降至 6周。运动神经元的死亡开始于 2周 ,以 4周和 6周最明显。TA990 1配伍EGb76 1提高c jun表达的效果随治疗时间延长而增强、其抑制NOS表达作用则以 2周点最强。结论　TA990 1配伍EGb76 1能增强神经根撕脱后运动神经元c jun的反应 ,抑制NOS的表达 ,提高受损运动神经元的再生能力     

神经根撕脱后脊髓运动神经元的病理表现

目的:观察神经根撕脱后脊髓前角运动神经元的病理表现,探讨在该条件下运动神经元死亡的神经生物学机制。方法:选择成年SD雌性大鼠20只,体重200-300g,撕脱右侧臂丛C₅-T₈神经根,术后动物存活3d、5d、1周后取C₅-C₈节段脊髓,对冰冻切片行NADPH-d组化、c-jun免疫组化、中性红和HE染色。观察神经元的形态,计数脊髓前角NOS阳性运动神经元及存活运动神经元数目,以非损伤侧的前角运动神经元数目为100%,计算百分比。结果:神经根撕脱3d、5d、1周后,损伤侧脊髓前角NOS运动神经元平均阳性率分别为:0.74%±0.59%、24.83%±6.73%、51.16%±8.67%。神经元平均存活率分别为93.00%±4.32%、93.67%±5.27%、89.83%±2.65%;c-Jun从撕脱术后3d就有表达,5d后表达开始减少。运动神经元形态变化不明显。1周时偶见前角运动神经元的胞核偏位,但核膜清晰,核仁尚存,染色体固缩。结论:脊神经根撕脱1周内,脊髓前角运动神经元NOS表达递增,c-Jun表达递减,运动神经元开始死亡。NO/NOS可能通过抑制神经元损伤后的再生反应,促进脊髓前角运动神经元的死亡。     

银杏叶提取物减轻臂丛根性撕脱后脊髓运动神经元超微结构的损伤

目的：研究银杏叶提取物(EGb761)对臂丛撕脱后运动神经元超微结构的保护作用。方法：显微镜下撕脱大鼠臂丛 C_5～T_(?)神经根,术后实验大鼠腹腔注射100 mg·kg~(-1)·d~(-1)EGb761,透射电镜观察损伤 C_7节段运动神经元的超微结构。结果：神经根撕脱6～8周,运动神经元胞体体积缩小、胞核染色质裂解、浓缩异染色质增多;粗面内质网和游离核糖体减少、线粒体减少、嵴肿胀;神经髓鞘不完整、呈空泡状变性。EGb761治疗后,胞体体积基本正常,偶见浓缩异染色质;粗面内质网减少不显著;游离核糖体数量明显增多;线粒体形态正常;髓鞘完整呈同心圆包绕在轴索周围。结论：EGb761能减轻运动神经元超微结构的损伤,减少臂丛根性撕脱诱导的运动神经元凋亡。     

热休克蛋白27对臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元NOS的影响

目的:观察热休克蛋白27(Hsp27)对大鼠臂丛神经根撕脱后脊髓运动神经元一氧化氮合酶(NOS)表达的影响.方法:Wistar大鼠60只,随机分为实验组和对照组.实验组动物分别以45℃预处理热处理15 min,再置于42℃维持20min,置室温恢复24 h后,手术显微镜下进行脊髓C5～C8节段神经根撕脱术;对照组仅施行臂丛神经根撕脱术,两组分别于术后12 h、1 d、3 d、5 d、7 d处死动物.各组取C5～C8节段脊髓,行Hsp27免疫组化、NADPH-d组化染色,结合自动图象分析系统对结果进行半定量分析.结果:①实验组在12 h即有NOS大量表达,之后迅速同落;对照组伤后第5天开始大量出现NOS阳性.②两组Hsp27表达高峰均在热休克后1 d,且实验组强于对照组.结论:臂丛神经根撕脱伤后Hsp27可能通过抑制NOS神经元来发挥其细胞保护作用.     

条件性损伤的时间与频次对神经根撕脱伤后脊髓前角运动神经元死亡及NOS表达的影响

目的　探索条件性损伤 (CL)的时间和频次对神经根撕脱 (TL)后脊髓前角运动神经元一氧化氮合酶 (NOS)表达及细胞死亡的影响。方法　成年SD雌性大鼠 116只 ,体重 2 0 0～ 30 0g ,以钳夹神经干为CL ,分为两个系列。时间系列 :在CL后 1d、3d、1w、2w后进行TL ,频次系列分别在 1w和 2w内行 1次、2次、6次钳夹 ,术后不同时间点处死动物 ,以单纯撕脱臂丛为对照 ,取C5～C8节段脊髓 ,行NADPH d组化染色 ,中性红复染。定量观察前角运动神经元NOS表达及神经元数目。结果　单纯撕脱组术后第 5d脊髓前角运动神经元开始表达NOS ,术后 3wNOS阳性神经元数达到高峰 ,随后逐渐下降并伴有神经元丢失。时间系列 :撕脱后 3d和 2w ,CL与TL间隔 1d组的NOS表达和神经元数目与对照组无显著性差异 ,但 3d、1w、2w组的NOS细胞数及神经元的丢失均较对照组明显 (P <0 0 5P <0 0 1) ,但在撕脱后 4w各CL时间的NOS表达和神经元存活均较对照组减少 (P <0 0 5 )。频次系列 :在 1w和 2w内增加CL次数可使NOS的表达水平和神经细胞的死亡数目有显著增加 ,在撕脱后 2w和 4w等较后的时间点更为明显 ;但在一定时间内 2次与 6次钳夹之间则无显著性差异。结论　条件性损伤与二次损伤之间的间隔影响撕脱后神经元NOS表达和神经元的死亡 ,以间隔时间     

RNA干扰技术抑制nNOS基因对根性撕脱伤脊髓运动神经元的影响

目的研究神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)基因在臂丛神经根撕脱伤中的作用地位。方法设计、筛选并构建针对nNOS基因的siRNA表达载体,建立C5～T1神经根撕脱伤SD雄性大鼠模型,于撕脱后14d脊髓鞘内给予nNOS的siRNA干预,3d后用NADPH-d酶组化反应结合中性红染色评估撕脱伤脊髓运动神经元的nNOS基因表达水平和创伤神经元的存活率。结果臂丛C5～T1根性撕脱伤17d后,C7节段损伤侧前角运动神经元的存活率在siRNA组、siRNA序列对照组和生理盐水组分别为(80.51±9.16)%、(88.26±2.95)%和(89.13±3.47)%;C7节段损伤侧前角运动神经元的nNOS阳性率为(18.10±6.63)%、(42.21±2.29)%和(39.46±2.41)%。nNOS的siRNA能显著减低撕脱伤诱导的nNOS蛋白在前角运动神经元内的表达水平。虽然与对照组相比,nNOS-siRNA组撕脱伤后运动神经元存活率有下降趋势,nNOS的siRNA但并未对撕脱伤导致的运功神经元的死亡造成显著影响。结论鞘内应用siRNA技术能下调撕脱伤后大鼠脊髓运动神经元内nNOS蛋白的表达,nNOS基因有可能发挥维持撕脱伤后运动神经元存活的作用。     

外源性一氧化氮对臂丛根性撕脱伤后脊髓的影响

目的探究在根性撕脱伤早、中期应用外源性一氧化氧(NO)供体硝普钠补充NO能否改变撕脱伤诱导运动神经元的凋亡进程及其相关机制。方法成年SD大鼠,右侧全臂丛神经根撕脱后于4 d和13 d分别在蛛网膜下腔受损脊髓节段局部给予NS或5 mmol/L SNP各4μL,存活2d后处死。取C7节段脊髓应用免疫组织化学以及酶组织化学、中性红染色、Western blot等方法,定量存活运动神经元数以及nNOS蛋白在运动神经元的表达情况;同时检测i NOS、GFAP、0X-42在胶质细胞的表达情况。结果 SNP 40 mmol/L以上剂量局部应用会导致动物立刻死亡,我们选择了5 mmol/L做为最终SNP浓度;SNP会降低撕脱伤脊髓运动神经元的存活率(%)6 d时间点SNP组与NS组无显著差异;15 d时间点,SNP组(57.41±3.96)显著低NS组(81.48±2.53);撕脱伤引起的小胶质细胞和星形胶质细胞反应与NS组相比加剧。结论在早期补充NO使前角运动神经元nNOS表达时间提前;加剧损伤脊髓的胶质反应;使运动神经元死亡时间提前,死亡程度增加。     

臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根GAP-43 mRNA表达

目的：探讨臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达变化及其影响因素,为臂丛损伤的修复治疗提供理论依据.方法：本实验创立三种臂丛根性撕脱伤模型：C7前根撕脱（Ⅰ组）;C7前根撕脱＋切断同侧C5～T1后根（Ⅱ组）;C7前根撕脱＋C5和C6之间作同侧脊髓半横断（Ⅲ组）.术后2周按CBS评分标准检查动物神经缺失症状,用SYBR Green荧光定量RT-PCR方法检测脊髓腹角运动神经元胞体及其神经根GAP-43 mRNA的表达改变.结果：根据CBS评分标准,对照组计为0分,Ⅰ组计分较低、Ⅲ组计分最高.对照组C7神经元胞体和C7神经根中GAP-43 mRNA表达量相近,但三种损伤组术后2周神经元胞体内GAP-43 mRNA表达均上调,而神经根内表达却下调.结论：（1）臂丛根性撕脱伤后脊髓腹角运动神经元胞体GAP-43 mRNA表达受突触前机制的调控;（2）臂丛损伤2周时神经元胞体内GAP-43 mRNA表达呈现高峰期,此时进行神经移位术将显著提高神经修复的效果.     

败血症休克肝细胞线粒体损伤机制的实验研究

目的:探讨败血症休克肝细胞线粒体损伤的机制。方法:30只SD大鼠随机分为3组,假手术组,12h手术组,16h手术组。采用盲肠结扎穿孔术(cecalligationandpuncture)制作败血症休克模型,比较手术前后肝细胞线粒体呼吸功能和氧化磷酸化功能的变化及线粒体膜ATP酶的活性改变与大鼠死亡率和血压变化的关系。结果:12h手术组平均动脉压(9.54±1.26)kPa明显低于假手术组(14.58±1.32)kPa(P<0.05),死亡率明显高于假手术组(P<0.05),12h手术组肝细胞线粒体Ⅲ态(1.28±0.25)、P/O比值(1.67±0.34)、呼吸控制率(1.27±0.25)、线粒体膜Ca²⁺-ATP酶(58.00±2.43)、Na⁺-K⁺-ATP酶(40.80±3.45)、Mg²⁺-ATP酶(78.30±4.16)、Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶(2.70±2.25)活性与假手术组相比较,具有显著差异(P<0.05)。术后16h组更低于12h组,与大鼠死亡率增加呈显著正相关。结论:肝细胞线粒体摄氧功能和氧化磷酸化功能减弱,膜流动性降低,能量代谢功能障碍,线粒体内钙镁平衡紊乱是败血症休克肝细胞线粒体损伤的主要机制。     

人胚胎脐血间质干细胞生物学特性研究

目的:研究人中期胚胎脐血间质干细胞生物学特性,探讨其在自体宫内基因转移/治疗(IUGT)领域的应用前景。方法: 采用L-DMEM完全培养液培养中期胚胎脐血间质干细胞(MSC);流式细胞仪技术检测细胞表面标记;地塞米松/胰岛素等作为脂肪细胞诱导液,β-甘油磷酸钠/抗坏血酸等作为成骨细胞诱导液分别诱导细胞分化;将携带有绿色荧光蛋白的重组腺病毒转染MSC,荧光显微镜下检测MSC表达转基因特性;F344新生大鼠肝内注射MSC,免疫荧光检测6周后不同组织器官中人MSC存在;非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠(NOD/SCID)皮下注射MSC,病理切片检测第30 d细胞体内成瘤性。 结果:3 mL人中期胚胎脐血可以分离、培养出MSC,细胞均一地表达CD29、CD44、CD59、CD105、CD166,不表达CD34、CD45、CD80、CD86、CD42a、HLA-DR分子,体外培养中具有成脂、成骨能力;细胞表达转基因产物绿色荧光蛋白阳性率高达56.32%±3.28%;在新生大鼠体内,人中期胚胎脐血来源的MSC能向多个不同组织器官迁移,在NOD/SCID小鼠内不具有成瘤性。结论:人中期胚胎脐血MSC适合中、晚期胚胎自体IUGT靶细胞。     

人胎盘血间质干细胞分离培养

目的：分离培养人胎盘血间质干细胞（hMSC），为hMSC探寻新来源。方法：采用羟乙基淀粉（HES）方法分离、富集胎盘血有核细胞；DMEM培养液体外培养、纯化、扩增hMSC；流式细胞仪检测细胞表面标记；地塞米松、IBMX、胰岛素和吲哚美辛定向诱导hMSC样细胞向脂肪细胞分化。结果：胎盘血来源有核细胞,在DMEM体外培养条件下，生长出具有塑料粘附特性的梭形细胞，阳性获得率29.17%（7/24），该细胞传代培养达6个月以上；流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80、CD86表达阴性；加入脂肪细胞诱导剂，细胞在形态上向脂肪细胞转化，胞内出现脂滴、脂泡，油红O阳性。结论：人胎盘血可以分离培养出hMSC，是hMSC的重要来源。     

抑制Treg联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强阿霉素治疗肝癌效果的实验研究

目的:探讨抑制调节性T细胞(Treg)联合瘤内转染Ad.GM-CSF增强阿霉素治疗肝癌效果的可行性,并对其机制进行探讨。方法:建立C57BL/6J小鼠皮下肝癌模型,待肿瘤长至100-150mm3时随机分为6组,每组12只:(1)对照组(PBS);(2)环磷酰胺组(CTX);(3)阿霉素组(DOX);(4)Ad.GM-CSF组;(5)CTX+DOX组;(6)CTX+DOX+Ad.GM-CSF组。末次治疗后第5d每组处死其中4只小鼠,取脾脏测定CTL活性;取肿瘤组织行病理检查;每组另外的8只小鼠用于观察皮下肿瘤生长和小鼠生存期。结果:CTX可以显著增强DOX对肿瘤生长的抑制作用(P0.05),延长小鼠生存期[(62.13±4.21)dvs(79.88±9.00)d,P0.05],而联合应用Ad.GM-CSF可显著增强该效果[(79.88±9.00)dvs(106.13±5.23)d,P0.01]。同其它组相比,CTX+DOX+Ad.GM-CSF组小鼠瘤体内可见大量肿瘤细胞坏死,CD8+T细胞浸润显著增加,而小鼠脾脏CTL杀瘤活性显著增强(P0.05)。结论:以阿霉素为治疗基础的化疗联合抑制Treg并瘤内转染Ad.GM-CSF的免疫治疗具有协同抗肝癌作用,免疫化疗治疗晚期肝癌具有一定的应用前景。     

钙通道阻滞剂对缺氧右心室心肌钙调神经磷酸酶活性的调控作用

目的:探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在大鼠慢性缺氧性右心室肥大中的作用以及L-型钙通道阻滞剂对其的影响。方法:将大鼠置于氧浓度为(10±0.5)%的大型玻璃舱中每天24 h缺氧持续共7 d建立大鼠慢性缺氧模型。实验大鼠分为3组,每组各20只,即正常组、缺氧组、苯磺酸氨氯地平(norvasc)处理组,缺氧组持续缺氧21 d,norvasc处理组在缺氧的同时灌喂norvasc 30 mg·k^-1·d^-1。第21 d每组取10只大鼠分离心脏称重,并测CaN活性水平,另10只取心脏测定心肌细胞[Ca²⁺]_i。结果:(1)缺氧组右室与左室加室间隔的重量比、右室重/体重均明显高于正常组和norvasc处理组(均P＜0.01) 。(2)缺氧组右心室心肌细胞[Ca²⁺]_i 明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。(3)缺氧组右心室心肌CaN活性明显高于正常组(P＜0.01),而norvasc处理组则明显低于缺氧组(P＜0.01)。结论: CaN可能参与了大鼠慢性缺氧性右心室肥大, L-型钙通道阻滞剂可能是通过降低心肌细胞内钙浓度,调控CaN活性而阻滞慢性缺氧右心室肥大。     

水飞蓟宾对非酒精性脂肪性肝病线粒体膜流动性的影响

目的:探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型中肝脏线粒体膜流动性的改变以及观察水飞蓟宾对NAFLD的防治作用。方法:采用高脂饮食建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,观察大鼠甘油三酸酯(TG)、胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肝组织HE染色、脂肪细胞染色的变化,以及肝脏线粒体膜的流动性的改变,并以水飞蓟宾抗氧化治疗,与已知有疗效的罗格列酮对比,观察其对上述指标的影响。结果:模型组血清ALT、AST、TG、TC显著升高,与空白对照组比较差异显著(P0.01)。HE染色提示肝组织呈弥散性脂质蓄积,模型组大鼠肝细胞线粒体微粘度明显高于空白对照组(P0.01)。罗格列酮治疗组TG、AST均得到明显改善(P0.05或P0.01);TC、ALT与模型组比较差异无显著(P0.05)。水飞蓟宾治疗后,TC、TG、ALT以及AST均得到明显改善(均P0.01)。两治疗组大鼠肝MDA含量、肝细胞线粒体微粘度均较模型对照组下降(P0.01),且水飞蓟宾的效果比罗格列酮显著,差异显著(P0.05)。结论:高脂饮食可诱导大鼠NAFLD发生,水飞蓟宾可以有效地防治NAFLD。稳定并维持适当的肝脏线粒体膜流动性、减轻肝脏脂质过氧化可能是水飞蓟宾肝脏保护功能的作用途径。     

Benextramine逆转神经肽Y下调人血管平滑肌细胞LDL-R的表达

目的:探讨benextramine对神经肽Y(NPY)人血管平滑肌细胞(hVSMC)低密度脂蛋白受体(LDL-R)表达影响的逆转作用。方法:应用荧光免疫组化和激光扫描共聚焦显微技术,定量检测hVSMC的LDL-R表达的变化。Benextramine(B组)浓度设为10^-5mol/L,NPY设10^-8mol/L(N1组)、10^-7mol/L(N2组)、10^-6mol/L(N3组)和10^-5mol/L(N4组)4个浓度,培养时间分别为6、12、24和48h。结果:对照组LDL-R表达的平均荧光值较高,介于2564-2649之间,且各时段间均无显著差异(P>0.05)。各NPY组LDL-R表达的平均荧光值均明显低于对照组和各benextramine组(P<0.05),介于1639-2512之间,其荧光值随NPY浓度增加而下降,N1-N4组分别平均下降15.64%、20.31%、22.58%和27.42%,呈现一定的剂量依赖效应;同时其荧光值也随NPY作用时间的延长而下降,在6、12、24和48h时间段分别平均下降11.24%、21.29%、23.04%和30.38%,亦呈现一定的时间依赖效应。各benextramine组(包括B组、B+N1组、B+N2组、B+N3组及B+N4组)的LDL-R表达荧光值介于2554-2631之间,与对照组间差异无显著(P>0.05),且与NPY作用浓度及时间无关(P>0.05)。结论:NPY能导致hVSMC的LDL-R表达下降,benextramine可逆转该作用。