小鼠原代神经元细胞狂犬病病毒滴度测定

目的探索利用小鼠原代神经元细胞测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的可行性。方法分离培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,接种100小鼠脑内接种半数致死量(MICLD50)的标准攻击强毒(CVS)毒株,通过免疫荧光和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其感染性,并在此基础上在原代神经元细胞上进行了该毒株的细胞半数感染量(CCID50)测定。结果成功制备了小鼠大脑皮质原代神经元细胞;原代神经细胞培养物接种CVS 96h后,用抗微管相关蛋白质(MAP2)抗体和抗RV阳性血清作为一抗并经荧光抗体染色后,在胞体和突起上均有神经元特异性和RV特异性着染;在共聚焦显微镜下,当相同的细胞部位上出现红色和绿色交迭时呈现粉色斑点,免疫荧光证实原代神经细胞可被CVS感染,同时RT-PCR得到1 770 bp左右的目的条带,说明其被CVS感染;该原代细胞上所测定的CVS病毒滴度为104.5CCID50/0.1 mL,而该病毒的原始滴度为104.5MICLD50/0.03 mL。结论小鼠脑原代神经元细胞上测定的CVS株的病毒滴度与通过脑内接种法测定的滴度相同。     

风疹病毒在兔脑神经细胞中的形态与形态发生

利用超薄切片电子显微镜技术,对风疹病毒(RV)地方株JR23和标准株GOS—10在兔脑神经细胞中的形态与形态发生及其引起的细胞超微结构变化进行了观察研究。结果表明,病毒感染6h后,细胞浆中开始出现病毒核心样颗粒。其特点是:电子致密度高,分布广泛,并有一定的聚集性,核周围常见。颗粒呈圆形,直径20～30nm。在这些颗粒较集中的区域可见到大量电子致密度均一、细布纹样条块状或环状结构,有时可见到其与核心样颗粒组装过程。有包膜的病毒颗粒出现较晚,呈球形,直径50～70nm。神经元中未见到完整病毒颗粒。被RV感染的细胞超微结构变化不明显,但可见到胞核胞浆比例明显增大,胞浆中可见散在的空泡。     

细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究

目的:研究甲肝病毒在细胞内快速连续传代培养病毒增殖情况,探索疫苗生产工艺改进的可能性。方法:将甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后形成带毒细胞,每7 d传代1次,检测每次收获物的甲肝病毒抗原(HAAg)滴度及感染性滴度,比较滴度的变化,同时检测一步生长曲线,分析病毒增殖特性有无变化。结果:甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后每7 d传代1次,其第1~8代抗原滴度为1 024~2 048 Eu/0.1 ml,感染性滴度为7.33~7.67 lg CCID50/ml,第9代开始下降,抗原滴度仅为256 Eu/0.1 ml,感染性滴度为6.83~7.00 lg CCID50/ml;在连续传10代内,细胞均未出现CPE现象;第10代与第1代相比,其一步生长曲线病毒增殖高峰均为20~25 d,没有明显变化。结论:甲肝病毒吕8株在KMB17细胞上每7 d传代1次,在第8代以内,其抗原滴度及感染性滴度均能达到较高的程度。经细胞内连续快速传代后,HAV吕8株生长的增殖高峰约为第20~25 d,与传代前样品没有明显差别。     

汉坦病毒感染Vero细胞病毒滴度和抗原滴度的动态观察

目的　观察汉坦病毒 (HV)在Vero细胞上的适应能力和毒株在该细胞中的增殖规律。方法　将HV感染Vero细胞 ,每隔 3d收取细胞培养液 ,直到细胞衰老 ,并观察细胞的病变情况。采用间接免疫荧光法 (IFAT)和反向被动血凝试验 (RPHA) ,观察细胞培养液的病毒滴度和抗原滴度的动态变化。结果　HV不致Vero细胞产生病变 ,病毒感染细胞第 8～ 11天时细胞培养液的病毒滴度和抗原滴度最高 ,以后逐渐降低 ,但直到细胞感染病毒 3 2d时其培养液的病毒滴度和抗原滴度仍稳定在 5 .0 0LgTCID50 /ml和 1∶2 0以上。结论　两株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。     

细胞工厂培养甲型肝炎病毒L-A-1减毒株的增殖规律

目的探讨细胞工厂培养甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）L-A-1减毒株的增殖规律,寻找最佳增殖周期。方法采用10层细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞（2BS株）,同时感染HAV L-A-1减毒株,分别于感染后的7、14、17、21、24和28d,收获含病毒的细胞,进行细胞计数,并检测抗原滴度和病毒滴度。选择病毒收获的一个最佳时间点,连续试验5批,检测HAV病毒滴度,并与培养28d结果进行比较。结果细胞感染HAV 14~21d,活细胞数量基本达平台期,随培养时间延长,细胞数量略有降低;随着培养时间的延长,抗原和病毒感染性滴度逐渐增高,培养17d时已达病毒增殖高峰,17~28d抗原和病毒滴度分别维持在1∶64~1∶128和7.00~7.50lgCCID50/ml。连续5批培养21d的病毒液病毒滴度的均值与培养28d相近,且差异无统计学意义。结论细胞工厂培养HAV L-A-1减毒株增殖高峰可缩短为21d左右。     

新疆出血热病毒在原代小鼠肾细胞上生长特性

本文报道了新疆出血热病毒能在原代小鼠肾细胞中复制及传代，细胞内的病毒滴度可达LD₅₀4.5/0.01毫升，但不出现细胞病变。细胞于种毒后三天即能观察到胞浆内嗜碱性的、多形态性包涵体和特异性免疫荧光颗粒。包涵体的分布部位与荧光颗粒一致，于种毒后5~6天达高峰。在感染的单层细胞中，培养液上清和细胞内的RPHA滴度分别为1：32~1：64和1：1024。     

3株肾综合征出血热病毒的分离和鉴定

目的了解浙江省肾综合征出血热（HFRS）流行特点及汉坦病毒（HV）型别，为防治提供科学依据。方法鼠肺HV抗原检测采用直接免疫荧光法（DFA），病毒分离采用阳性鼠肺研磨液接种幼龄长爪沙鼠，再经vero-E6细胞传代，用单克隆抗体DFA定毒株及分型。结果从捕自浙江省龙泉地区的8份阳性鼠肺中分离到3株HV，经DFA鉴定均为汉滩型（Ⅰ型）病毒，3株病毒在Vero-E6细胞中的感染滴度为10^4.75～10^5.25CCID50／ml。结论从鼠类肺组织中分离到3株汉滩型HV，毒株均能在Vero-E6细胞中较好增殖，有可能成为HFRS疫苗后备毒株。     

肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株在Vero细胞上的适应传代及其抗原性研究

〔目的〕将肾综合征出血热疫苗后备毒株适应于Vero细胞 ,观察病变情况 ,并对其抗原性和繁殖特性进行研究。〔方法〕将新分离的汉坦病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株在Vero细胞上进行连续传代 ,采用间接免疫荧光法(IFA)、反向被动血凝试验 (RPHA) ,研究传代后毒株的病毒滴度、抗原量以及细胞的病变情况 ,同时将传代后的病毒接种敏感动物 ,观察动物的发病情况和毒株的繁殖特性。〔结果〕经过 5次连续传代 ,四株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性 ,从第二代开始病毒滴度稳定在 6.0 0LgTCID5 0 ml以上 ,第五代时最高达 7.5 0LgTCID5 0 ml ,第三代毒株抗原量均已达到 1:12 8,ZJ7株抗原量最高时达 1:768,四株毒株感染Vero细胞 ,连续观察 12d不见细胞产生病变 ,第五代细胞病毒液接种敏感动物 ,9d后动物发病甚至死亡。〔结论〕四株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。     

人巨细胞病毒影响绒毛外细胞滋养细胞增殖功能的体外研究

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)对绒毛外细胞滋养细胞增殖功能的影响。方法:选择绒毛外细胞滋养细胞株HPT-8进行研究,体外培养时加入HCMV,免疫荧光法检测HCMV PP65,MTT法检测不同浓度HCMV、不同作用时间对HPT-8增殖的影响。结果:病毒感染组HPT-8细胞内可见大量红色HCMV PP65抗原信号;与正常对照组比较,10～100μl病毒液作用12 h HPT-8增殖均无异常(P>0.05),70μl和100μl病毒液作用24 h HPT-8增殖明显抑制(P<0.05),20、30、40、50μl病毒液作用48 h HPT-8增殖均明显抑制(P<0.05),10μl病毒液作用72 h HPT-8增殖明显抑制(P<0.05);其中,48 h和72 h时间点,20μl、30μl、40μl病毒液导致的细胞增殖异常差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HCMV可感染HPT-8并在细胞内复制,抑制细胞增殖。     

流行性出血热病原学研究:用A-549细胞从疫区黑线姬鼠肺单层细胞中分离出血热病毒

用疫区黑线姬鼠肺制备单层细胞,经KHF阳性血清作IFA法检查,将10份KHF荧光阳性(卅以上)的单层细胞培养物接种A-549细胞,发现5株可以在A-549细胞中连续传代的EHF相关因子。以其中ALC96株感染的A-549细胞制作抗原片,检查125份血清,67份EHF患者恢复期血清中66份免疫荧光阳性(98.5%),58份正常人及其它疾病病人血清全部阴性。10例EHF患者双份血清抗体滴度均有4倍以上升高。与呼肠孤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及类环状病毒抗血清免疫荧光阴性,与EHF病毒A₁、A₅,A₉株(A-549细胞适应株)抗血清为阳性,其感染性可被EHF病人恢复期血清中和,证明此相关因子是EHF病毒。病毒可通过450nm孔径滤膜。对5-碘脱氧尿嘧啶核苷不敏感,不耐酸(pH≤3.0),对脂溶剂敏感,这些与KHF病毒相似。     

肾综合征出血热疫苗后备毒株的分离和生物学特性研究

目的从肾综合征出血热(HFRS)疫区阳性鼠肺中分离汉坦病毒(HV),并对分离到的病毒进行型别鉴定和生物学特性研究,为HFRS疫苗后备毒种库的建立打下基础。方法疫区阳性鼠肺研磨液接种长爪沙鼠分离病毒,并将分离到的HV经乳沙鼠脑内连续传代,采用直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验,检查毒株的型别,研究传代后毒株的繁殖特性、病毒滴度和抗原滴度。结果从疫区32份阳性鼠肺中分离到9株HV,经单克隆直接荧光血清检查6株为汉滩病毒株,3株为汉城病毒株,经乳沙鼠脑内连续传代,其中4株毒株的病毒滴度和抗原滴度较高,汉滩和汉城毒株的病毒和抗原滴度最高分别达106.50、106.00和1∶5120、1∶5120。结论4株毒株的病毒滴度和抗原滴度均较高,可作为HFRS疫苗后备毒种的筛选毒株。     

抗黄热病病毒多克隆荧光抗体的实验研究

本文报道应用免疫荧光技术制备抗黄热病病毒的多克隆荧光抗体,经初步鉴定对感染黄热病毒的鼠脑切片和细胞抗原片均能显示特异性荧光反应。     

柯萨奇病毒A24变异株引起的急性出血性结膜炎快速诊断的研究

用免疫荧光试验检査感染组织培养细胞中的病毒抗原。5天内就可得出分离定型结果。进而用免疫荧光法直接检査眼结膜细胞涂片中柯萨奇病毒A24变异株(简称CA24v)病毒抗原,阳性率为81.3%。     

甲型肝炎减毒活疫苗生产中病毒释放的最低方法探索

目的：探索甲肝炎减毒活疫苗（简称甲肝活疫苗）生产中感染细胞释放病毒的最佳方法。方法：采用超声波细胞粉碎仪、－70℃及液氮冻融3种方法粉碎细胞,对细胞破碎情况、病毒抗原滴度和感染性滴度进行了比较。结果：超声波连续粉碎 3次（90秒／次）、－70℃反复冻融粉碎4次和液氮冻融粉碎6次,细胞破碎率分别为94％、82％和81％;病毒抗原滴度和感染性滴度均达高峰;抗原滴度均为1：256,感染性滴度（logCCID50/ml)分别为8．67、6．5和6．0。继续超声和－70℃冻融粉碎细胞,病毒抗原滴度和无感染性滴度基本不变,而液氮冻融至第10次时,抗原滴度无明显变化,感染性滴度下降2．0lgCCID50/ml。结论：超声波破碎率最高,细胞碎片最小病毒充分释放,且不损伤病毒;－70℃和液氮冻融破碎率较低,细胞碎片较大,病毒释放效率低,病毒损伤以液氮冻融为重。     

10株水痘带状疱疹病毒分离鉴定与生物学特性研究

用Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞从１２例水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到１０株病毒，分离阳性率为８３．３％。１０株病毒均可使感染细胞圆缩融合、脱落等典型的ＶＺＶ局灶性细胞病变（ＣＰＥ）特点，ＣＰＥ随着传代次数增加而加快。用带状疱疹恢复期病人血清作间接免疫荧光染色镜检可见典型的感染细胞核内荧光块。１０株病毒感染细胞制成的抗原片检测５例带状疱疹病人急性期及恢复期血清荧光抗体滴度均有４倍以上增高。ＶＺＶ对Ｖｅｒｏ细胞敏感；对沙鼠肾，胎兔肾，胎豚鼠肾、肺、脾原代单层细胞不敏感；对乳小白鼠不敏感。毒种在－２０℃保存一周内死亡，但在３０％脱脂牛奶，２０％小牛血清及１０％山梨醇Ｅａｇｌｅ′ｓ液中，液体或真空冰冻干燥－１００℃可保存二年以上。     

柯萨奇病毒YY157株在不同细胞系中的增殖特性

目的 了解柯萨奇病毒A16型(Cox A16)YY157株在多种细胞系中培养的增殖特性,为疫苗研制提供参考.方法 把YY157株接种于非洲猴肾细胞(Vero)、人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5或KMB17进行适应性传代培养,观察细胞病变情况,检测病毒感染性滴度,绘制增殖曲线.结果 Cox A16 YY157株在3种细胞中培养均产生细胞病变,在Vero细胞中病变早,增殖快,滴度达8.5 lgCCID50/mL;在MRC-5细胞中,此毒株增殖速度比在Vero细胞中慢,滴度达7.5 lgCCID50/mL;在KMB17细胞中,此毒株增殖最慢,滴度只有7.0 1gCCID50/mL.结论 Cox A16型YY157株均可感染Vero、MRC-5和KMB17细胞并增殖,但敏感性和增殖速度有差异.     

肠道病毒71型快速培养鉴定方法的建立和应用

目的:建立肠道病毒71型(EV71)快速培养鉴定方法,并应用于EV71感染的早期诊断。方法:1.以不同滴度的EV71临床分离株,低速离心接种于人横纹肌肉瘤细胞(RD)96孔板内,设定时间梯度培养后用间接免疫荧光技术检测EV71早期抗原,以优化快速培养鉴定方法的条件。2.采集上海地区2010年手足口病例患者的咽拭子、大便标本50份,以EV71快速培养鉴定方法检测,并与病毒分离培养比较。结果:病毒滴度为106TCID50/0.1 ml的EV71临床分离株系列稀释后培养3 d,至最高稀释度10-10能100%检测到病毒抗原。检测咽拭子标本5份、大便标本45份,病毒分离检测阳性26份,出现CPE平均时间为9.8d±2.098,阳性率为52.0%;快速培养鉴定方法3 d检出阳性30份,阳性率为60.0%。结论:在96孔板上开展离心培养结合免疫荧光技术应用于EV71感染的早期诊断,缩短了病原体检出时间、敏感性高、特异性强,操作更为简便,是快速诊断EV71感染的可靠方法。     

用乳大白鼠肺原代细胞分离出EHF病毒

采用哈尔滨市郊区暴发的流行性出血热(EHF)宿主动物鼠肺组织悬液,接种乳大白鼠肺组织原代细胞(简称Rn1细胞)分离出可连续传代的EHF病毒株,编号为A-483株进行了系统鉴定。A-483株在Rn1细胞能稳定传代,不产生病变。用A_(64)、A_(163)、R_(294)、S_(23)殊免疫血清进行了交叉免疫荧光检查,结果证明所分离株与国内其他省的抗原相近,其特异免疫血清抗体滴度为1∶20～1∶1280以上。该株对哈市郊区8对EHF病人双份血清间接免疫荧光抗体增长动态均为4倍以上:急性期1∶20～1∶320、恢复湖1∶80～1∶1280之间。该株与牡丹江地区10名EHF病人的急性期血清间接免疫荧光抗体滴度为1∶80～1∶320,恢复期为1∶80～1∶1280。该抗原与10份正     

汉坦病毒Vero细胞灭活疫苗候选毒种筛选

目的将肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株适应于Vero细胞，并对其抗原性和免疫原性进行研究。方法将新分离的4株汉坦病毒接种敏感动物，在乳沙鼠脑内连续传代。比较脑内病毒抗原的含量以及乳鼠的发病情况；在Vero细胞中传代，比较培养液中的病毒滴度和抗原滴度以及细胞的病变情况；利用筛选出的毒株研制Veto细胞灭活疫苗。研究疫苗的免疫原性。结果4株病毒经乳沙鼠脑内传代，鼠脑悬液的病毒滴度和抗原滴度分别达7．00～7．75LgCCID50／ml和1：3201：1280；4株毒株经Vero细胞连续传5代，培养液病毒滴度和抗原滴度分别达6．50～7．50LgCID50／ml和1：160～1：768；疫苗免疫家兔2针后，其中出血热病毒株Z34与ZJ5株疫苗免疫血清对同型毒株的中和效价达到1：10。结论ZJ4与ZJ5两毒株已适应于Vero细胞，且具有病毒滴度高和免疫原性良好的特性，适合用作Vero细胞肾综合征出血热疫苗理想的候选毒株。     

乳鼠轮状病毒感染疗效模型的建立

目的建立乳鼠轮状病毒(rotavirus,RV)感染疗效模型,探讨应用感染性腹泻模型在筛选抗RV药物中的可行性。方法采用灌胃法感染乳鼠,然后用不同剂量的jn219药物加以治疗,通过比较病毒对照组和疗效模型组的腹泻症状、病理学改变和病毒抗原在肠黏膜的表达,评价jn219抗RV的效果。结果疗效模型组的腹泻程度、死亡率明显轻于病毒对照组,经比较两组乳鼠的体重增长(P<0.01)和死亡率(P<0.05)均有显著性差异,其肠黏膜病变程度及RV抗原的表达均明显弱于病毒对照组。结论用上述方法能成功地制作RV感染的疗效模型。