阻断ICOS对小鼠移植胰岛功能影响的实验研究

目的：在小鼠胰岛移植模型基础上，通过阻断可诱导共刺激分子（ICOS）。探讨ICOS单克隆抗体（ICOSmAb）对移植胰岛功能的影响。方法：供体为近交系昆明小鼠，受体为C57小鼠。受体小鼠随机分成5组，每组10只。假手术组：受体小鼠仅行开腹手术，不行胰岛移植；对照组：单纯胰岛移植，不给ICOS mAb；实验1、2、3组：分别于胰岛移植后1、3、5d腹腔内注射ICOSmAb50、100、200μg/kg。观察小鼠胰岛移植后移植物存活时间和移植胰岛病理改变，流式细胞仪检测ICOS在T淋巴细胞上的表达。结果：实验2组小鼠移植胰岛存活时间和实验3组相同，统计学分析无显著性差异，而较对照组及实验1组明显延长（P〈0．05）。ICOS在移植术后7d受体小鼠T淋巴细胞上表达明显上调。结论：ICOS分子在小鼠同种异体胰岛移植排斥反应中表达上调。参与了排斥反应的发生。ICOSmAb通过阻断ICOS共刺激信号途径，诱导小鼠同种异体胰岛移植免疫耐受，减轻排斥反应，延长移植胰岛有功能存活时间。ICOS mAb的最佳给药剂量为100μg/kg。     

Cy7.SE标记ICOS-Ab荧光示踪技术评估小鼠心脏移植术后急性排斥反应

目的 探讨以T细胞活化表达的可诱导共刺激分子(inducible co-stimulatory molecule, ICOS)为基础的荧光示踪技术无创诊断小鼠心脏移植后急性排斥反应的可行性。方法 以小鼠颈部异位心脏移植为模型,分为同系移植、同种移植、同种移植+他克莫司(tacrolimus,FK506)治疗(同种移植治疗组)及同种移植治疗后停药组,分别在移植术后1、3、5、7 d,采用荧光染料Cy7.SE标记抗小鼠ICOS抗体(Cy7.SE-ICOS-Ab)经尾静脉注入移植小鼠,用荧光实时显像仪观察移植物荧光图像变化;同时用流式细胞仪检测各组小鼠脾脏T细胞表面ICOS表达,H-E染色分析心脏移植物病理改变。结果 同系移植及同种移植治疗组小鼠移植术后各时间点基本不显影;同种移植术后1 d,移植物荧光图像无明显变化,但术后3、5、7 d荧光逐渐增强,术后7 d时荧光强度最明显;同种移植治疗后停药组停药3 d移植物荧光强度逐渐增强,停药5、7 d后强度明显增强。H-E染色表明:各时间点同系移植及同种移植治疗组小鼠心脏移植物无明显排斥反应;同种移植及同种移植治疗后停药组在术后(或停药后)1 d移植物无明显排斥反应,术后3、5、7 d排斥反应逐渐出现并加重。流式细胞仪检测显示:术后1 d,各组脾脏T细胞表达ICOS水平无明显差异;同系移植及同种移植治疗组在各时间点基本不表达ICOS,但同种移植及同种移植治疗后停药组在术后(或停药后)3、5、7 d ICOS表达逐渐增加(P<0.05)。结论 ICOS表达强度与心脏移植后排斥反应强度有关,荧光标记的ICOS抗体可能有助于无创评估移植术后急性排斥反应的发生及程度。     

供体脾脏对大鼠移植胰腺细胞凋亡的影响

目的: 观察供体脾脏对胰腺移植大鼠免疫反应的影响。方法: 制作异基因大鼠胰、脾、十二指肠联合移植模型,观察供体胰腺的病理学改变,测定供体胰腺组织中细胞凋亡的变化、转化生长因子β1 (TGF β1 )mRNA的表达及CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞的变化。结果: 胰、脾、十二指肠联合移植组:术后 3 d胰腺小叶间质水肿,腺泡细胞和胰岛细胞轻度水肿;术后5 d炎细胞浸润,腺泡细胞灶状坏死;术后7 d腺泡细胞和胰岛细胞部分坏死、自溶。胰、十二指肠移植组:术后3 d胰腺腺泡细胞片状坏死;术后 5 d胰腺小叶和部分胰岛细胞坏死;术后7 d腺泡细胞大片坏死,胰岛结构消失。胰、脾、十二指肠联合移植组供体胰腺组织中凋亡细胞数和 TGF β1mRNA的表达于术后各时点均高于胰、十二指肠移植组(P<0.001);其 CD4+ 和 CD8+ T细胞数高于正常对照组,但低于胰、十二指肠移植组(P<0.001)。结论: 细胞凋亡和 TGF β可减轻受体大鼠对供体胰腺的免疫排斥反应;调高供体胰腺组织TGF βmRNA的表达是供体脾脏发挥免疫抑制作用的机制之一。     

联合阻断CD28和ICOS对移植胰岛功能影响的实验研究

目的:探讨CTLA-4Ig及可溶性B7RP-1融合蛋白联合阻断CD28和ICOS对移植胰岛功能的影响。方法:在异种胰岛移植模型的基础上48只实验动物随机分成4组,每组12只,供体为SD大鼠,受体为近交系昆明小鼠。联合处理组(A组):分别于移植后0、2、4d和1、3、5d腹腔内注射CTLA-4Ig和可溶性B7RP-1融合蛋白组;可溶性B7RP-1融合蛋白处理组(B组):移植后1、3、5d腹腔内注射可溶性B7RP-1融合蛋白组;CTLA-4Ig处理组(C组):移植后0、2、4d腹腔内注射CTLA-4Ig组;对照组(D组):单纯胰岛移植,不做CTLA-4Ig和可溶性B7RP-1融合蛋白处理组。通过观察大鼠胰岛移植后移植物存活时间和移植胰岛病理改变,并用RT-PCR方法检测IL-2和IL-10在移植组织中的表达情况。结果:联合处理组大鼠移植胰岛存活时间较对照组及CTLA-4Ig处理组和可溶性B7RP-1融合蛋白组明显延长,移植胰岛光镜检查接近正常,IL-2mRNA表达差异有显著性[(42.55±6.34)%VS(112.55±15.34)%,P<0.01],IL-10mRNA表达差异无显著性[(105.35±15.16)%VS(102.23±16.02)%,P>0.05]。结论:应用CTLA-4Ig+可溶性B7RP-1融合蛋白联合阻断CD28和ICOS,可以明显的抑制排斥反应,提高移植物的存活率。     

Th17细胞在胰岛移植中的作用

目的 研究Th17细胞在胰岛移植免疫排斥反应中的作用,探讨IL-23R抗体联合应用Anti-CD154mAb诱导胰岛移植免疫耐受的可行性.方法 体外实验分为5组:空白对照组,SD大鼠胰岛细胞单独培养;A组,大鼠胰岛细胞混合淋巴细胞培养,不加IL-23R抗体;B、C、D组,将大鼠胰岛细胞混合淋巴细胞培养,分别加IL-23R抗体0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL.作细胞甩片后,行丫啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)荧光染色、胰岛素和胰高血糖索免疫组化染色、胰岛素刺激实验.体内实验(将分离纯化的胰岛移植于小鼠左肾包膜下)分成4组:对照组,胰岛移植后不予任何干预;IL-23R抗体(200 μg)治疗组;Anti-CD154mAb(200 μg)治疗组;联合治疗组.监测移植后小鼠血糖,取移植肾作HE染色及胰岛素、胰高血糖素免疫组化染色.结果 共培养3 d后,在胰岛素刺激实验中,空白对照组的葡萄糖刺激指数为3.66±0.10,与A、B、C、D组相比升高(P＜0.05).D组刺激指数高于其他各组,达到1.95±0.75.胰岛素和胰高血糖素免疫组化染色,体外和体内实验显示各实验组移植物有功能存活明显好于对照组.移植3 d后,对照组血糖与各实验组相比升高(P＜0.05),各实验组血糖比较无明显差异.结论 Th17细胞参与了胰岛移植的免疫排斥反应.通过阻断IL-23R能有效的下调IL-17的表达,阻断效果呈剂量依赖性.Anti-CDl54mAb和IL-23R抗体联合应用能在一定程度上防止胰岛移植物的急性排斥反应,但与单独使用Anti-CD154mAb治疗相比无明显差异.     

基因转移CTLA4Ig和CD40LIg在大鼠异种胰岛移植排斥反应中的作用

目的 探讨基因转移细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白（CTLA4-Ig）和T细胞分化群40L免疫球蛋白（CD40L-Ig）在异种胰岛移植排斥反应中的作用及其机理。方法 建立大鼠-小鼠异种胰岛移植模型,用携带CTLA4-Ig和CD40L-Ig基因的重组腺病毒感染移植胰岛细胞,观察糖尿病小鼠胰岛移植后血糖变化、生存情况及移植物病理形态学改变,检测移植物CTLA4-Ig、CD40L-Ig、胰岛素的表达和移植小鼠白细胞介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平变化。结果 （1）糖尿病小鼠移植后2 d血糖降至正常,对照组(A)血糖平均在移植后8 d升高,CTLA4Ig转染组(B)、CD40LIg转染组(C)和联合转染组(D)血糖分别在24、21和68 d升高。（2）对照组、CTLA4Ig转染组、CD40LIg转染组和联合转染组的移植物存活时间分别为(8.2±0.9) d,(28.7±4.0) d,(26.6±3.2) d 和 (73.6±9.8) d,联合转染组较对照组、CTLA4Ig转染组和CD40LIg转染组显著延长（P<0.01）;CTLA4Ig转染组和CD40LIg转染组较对照组显著显著延长（P<0.01）。（3）对照组在移植后1周内,IL-2、TNF-α的水平均急剧上升,较移植前显著升高（P < 0.01）。（4） 各治疗组移植物见成片的胰岛细胞团,未见淋巴细胞浸润,可见胰岛素、CTLA4Ig和CD40LIg的表达。结论 基因转移CTLA4-Ig和CTLA4-Ig均可抑制异种胰岛移植排斥反应,二者联合效果优于单独使用。     

NKG2D mAb对自发性NOD小鼠同种胰岛移植的作用研究

目的 探讨NKG2D mAb能否单独作为共刺激信号阻断剂延长自发性非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠移植移岛的有功能存活期;NKG2DmAb和CD154mAb是否有协同作用.方法 将分离、纯化的BABL/c小鼠胰岛植入自发糖尿病的NOD小鼠左肾包膜下,移植成功的小鼠分成4组:对照组,NKG2D mAb治疗组,CD154 mAb治疗组和联合治疗组(NKG2D mAb+CD154 mAb).通过小鼠尾静脉血监测血糖,记录胰岛移植物有功能存活期;胰岛移植物所在肾脏行HE染色和CD3、CD4、CD8免疫组织化学染色.结果 NKG2D mAb治疗组移植物有功能存活期无延长(5～11 d,对照组6～11 d,两者差异无统计学意义),CD154 mAb治疗能明显延长移植物有功能存活期[20～64 d,中位期41 d,和NKG2D mAb治疗组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)],联合治疗组较CD154 mAb治疗能延长移植物有功能存活期(23～84 d,中位期51 d,但差异无统计学意义).各组发生排斥时胰岛移植所在肾脏均见淋巴细胞浸润,CD3、CD4、CD8染色结果无明显差异.结论 CD154 mAb能明显延长NOD小鼠胰岛移植物有功能生存期;单独使用NKG2DmAb治疗,不能延长胰岛移植物有功能生存期;联合治疗有效,但仍不能诱导移植物长期存活.     

探讨γδT细胞在小鼠胰岛移植排斥反应中的作用

目的 通过胰岛移植模型,观察移植后小鼠血糖及存活时间,从而探讨肠上皮γδT细胞在胰岛移植排斥反应中的作用.方法 建立小鼠胰岛移植模型,分为野生型小鼠组、γδ敲基因小鼠组和γδ敲基因回输γδT细胞小鼠组,移植后分别于1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29 d测量空腹血糖,并于术后两周取移植物观察病理情况.结果 术后野生型小鼠组和γδ敲基因回输γδT细胞小鼠组移植后血糖升高明显慢于γδ敲基因小鼠组,差异有统计学意义(P＜0.05),γδ敲基因回输γδT细胞小鼠组与野生型小鼠组差异无统计学意义(P＞0.05).野生型小鼠组存活时间(27±2)d及γδ敲基因再回输组小鼠组存活时间(24±1)d均明显长于γδ敲基因小鼠组的(17±3)d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肠上皮γδT细胞作为一种特殊的T细胞在胰岛移植排斥反应中起着重要作用.     

雷公藤多甙对小鼠异种骨移植急性排斥反应的抑制作用

目的：观察雷公藤多甙对小鼠异种骨移植急性排斥反应的抑制作用。方法：BALB/C小鼠随机分为治疗组（n=20）和对照组（n=20）,治疗组小鼠行雷公藤多甙（30 mg·kg^-1·d^-1）灌胃3 d,对照组给予等量生理盐水灌胃,将猪骨作为供体分别移植至治疗组和对照组小鼠体内,移植2周后,通过流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量,ELISA法检测2组小鼠血清中白细胞介素2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的含量,观察移植骨周围组织形态学改变,比较2组小鼠异种骨移植后发生急性排斥反应的情况。结果：骨移植2周后治疗组小鼠脾脏中的CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞数量、CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞的比值较对照组均明显降低（P<0.05）,治疗组小鼠血清中IL-2、IFN-γ和IL-4含量较对照组均明显降低（P<0.05）,治疗组较对照组小鼠移植骨周围组织中淋巴细胞浸润明显减少。结论：雷公藤多甙可以减轻小鼠异种骨移植急性排斥反应。     

IL-17参与小鼠心脏移植排斥反应的实验研究

目的 研究Th17细胞相关因子白细胞介素17(IL-17)在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义.方法 建立小鼠颈部异位心脏移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组.观察2组供心存活时间,应用RT-PCR检测移植心脏IL-17、核孤独受体γt(RORγt)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA在移植术后1、2、3、4、5、6、7、8 d的动态表达水平.免疫荧光法观察移植术后第4天移植心脏内CD4+、CD8+T细胞中IL-17的表达情况.结果 RT-PCR检测显示,在急性排斥反应组中,IL-17和RORγt mRNA的表达都早于IFN-γ,在移植术后第2天即可于移植心脏中检测到,其表达量在术后第4天均达到高峰,随后逐渐下降,并分别在术后第6天和第7天无表达.免疫荧光结果显示,急性排斥组移植心脏内有大量CD4+、CD8+T细胞浸润,细胞因子IL-17主要由CD4+T细胞分泌.结论 Th17细胞在移植排斥反应的发生发展中可能起着非常重要的作用,对移植脏器中细胞因子IL-17的检测可作为急性排斥反应早期诊断的预见性和特异性指标.     

B7特异性RNA干扰对皮肤移植的影响

目的探讨RNA干扰技术阻断B7／CD28共刺激信号对小鼠异体皮肤移植排斥反应的影响。方法设计并合成B7特异性siRNA,在脂质体的介导下转染树突状细胞,转染后72h收集细胞,用蛋白印迹法检测B7-1、B7-2蛋白的表达。在小鼠异体皮肤移植前7d,经静脉将转染B7特异性siRNA的DC输入小鼠体内（DC转染组）,同时设立同种异体移植对照组、同系移植对照组、环孢素A（CsA）治疗组（术后每日皮下注射CsA5mg／kg）和未转染DC组（移植前输注未转染DC）,观察各组移植皮瓣的存活时间和排斥反应情况,并用MTT法检测混合淋巴细胞增殖反应,术后1个月观察迟发性超敏反应情况。结果Western Blot结果显示转染72h后,siRNA1对B7-1蛋白表达的抑制率为（77.2±6.26）％;siRNA2对B7-2蛋白表达的抑制率为（73.3±5.42）％。与同种异体移植对照组和未转染DC组比较,DC转染组移植皮瓣成活时间明显延长（P〈0.01）,组织排斥反应程度较轻,混合淋巴细胞反应和DTH反应显著降低（P〈0.01）。结论聊特异性siRNA可明显抑制树突细胞B7基因的表达,以阻断B7／CD28共刺激通路,抑制小鼠皮肤移植排斥反应,为进一步研究siRNA诱导免疫耐受提供了新方法。     

黄芪在同种移植排斥中对CD4+ CD25+ T细胞及Foxp3的影响

探讨黄芪(AST)在同种移植排斥中对CD4+CD25+T细胞动态变化及Foxp3表达的影响。方法：C57BL/6和BALB/c小鼠分别为供体和受体，建立皮肤移植模型。对照组：术后注射生理盐水；AST组：术后给予黄芪注射液；AST+脾细胞(SP)组：术前输注供体鼠脾细胞，术后给予黄芪注射液，CsA+SP组：术前输注供体鼠脾细胞，术后给予环孢素A（CsA）。术后逐日观察移植皮肤存活情况及小鼠一般状况；免疫荧光染色流式细胞术检测脾组织中CD4+CD25+T细胞动态变化；RT PCR检测Foxp3mRNA表达情况。结果：与对照组相比，AST组、AST+SP组、CsA+SP组移植皮片存活时间明显延长（P＜0.05），移植后14?d，CD4+CD25+T细胞数量及Foxp3的相对表达量显著增多（P＜0.05）。结论：黄芪体内用药可延长同种移植物的存活时间，上调CD4+CD25+T细胞及Foxp3的活性。     

新鲜与短期培养胰岛细胞移植对移植胰岛存活的影响

目的 观察新鲜和短期培养后的小鼠胰岛细胞对移植后胰岛的再血管化及功能的影响.方法 C57小鼠作为胰腺供体,胆总管灌注胶原酶P溶液消化胰腺,Ficoll 400不连续梯度纯化获得胰岛细胞.接受不同胰岛细胞肾被膜下移植的受体糖尿病C57小鼠随机分成三组(n=10):A组接受新鲜胰岛细胞移植,B、C组分别接受培养1、3d的胰岛细胞移植.术后观察血糖变化并于移植后第14天取移植胰岛,分别进行HE染色和胰岛素、CD31免疫组织化学染色,并计算微血管密度.结果 胰岛细胞移植后3d内,三组小鼠的随机血糖浓度均＜11.0 mmol/L.A组小鼠在移植后第14天时的血糖浓度仍＜11.0 mmol/L,而B、C组小鼠血糖浓度在移植3d后呈现持续上升,此后各时间点的血糖浓度均显著高于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组织化学胰岛素染色结果显示:A组小鼠肾被膜下成团的细胞被染成棕褐色,B、C组类似细胞团仅有少量着色.免疫组织化学CD31染色发现,A组小鼠肾被膜下移植细胞团内部有大量细胞胞质被染成棕黄色,而B组和C组仅有少量细胞着色;A组肾被膜下胰岛内微血管密度显著高于B、C组(P＜0.05).结论 小鼠新鲜胰岛细胞移植较短期培养后胰岛细胞移植更有利于移植胰岛的再血管化及存活.     

T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究

目的体外制备供体特异性T细胞疫苗（T cell vaccine）,探讨T细胞疫苗免疫（T cell vaccination）诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的作用。方法腹腔注射链脲佐菌素诱导建立Balb／c小鼠Ⅰ型糖尿病模型,用酶消化法和密度梯度离心法无菌分离纯化Wistar大鼠胰岛细胞。制备Balb／c小鼠针对Wistar大鼠的T细胞疫苗：实验随机分为三组,G1：糖尿病小鼠对照组;G2：胰岛细胞移植组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞移植＋1640培养液（对照组）;G3：胰岛细胞移植加T细胞疫苗免疫组,糖尿病小鼠＋胰岛细胞＋T细胞疫苗（实验组）,于d1,d7,d14,d21实验组Balb／c小鼠接种TCV（1×107／mL）,对照组用1640替代。接种前和每次接种后第5d分别进行混合淋巴细胞反应。胰岛细胞移植：将Wistar大鼠的胰岛按1200。1500IEQ／kg经肝门静脉导入小鼠体内,移植后观测血糖和体重变化。结果异种胰岛细胞移植可以诱导I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且维持一段时间,对照组小鼠移植后（5．12±1．36）d即发生排斥,实验组移植物存活时间达（20．25±3．45）d。结论TCV能够有效延长异种胰岛移植物的存活时间,是一种潜在诱导异种胰岛移植免疫耐受的方法。     

M2型巨噬细胞在糖尿病小鼠同种异体胰岛移植中的抗排斥作用

目的：探讨腹膜腔来源的M2型巨噬细胞对糖尿病小鼠同种异体胰岛移植的抗排斥作用。方法：体外分 离诱导C57BL/6小鼠腹膜腔M2型和M0型细胞,流式细胞术鉴定巨噬细胞表型。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导 C57BL/6雄性小鼠的糖尿病模型作为受体,分离BALB/c小鼠胰岛细胞移植于C57BL/6糖尿病小鼠左肾包膜下。将移植 后糖尿病小鼠随机分为3组,每组8只。于胰岛移植术后1,3,7 d分别经尾静脉输注PBS(islet+PBS组)、2.5×106个M0型 巨噬细胞(islet+M0组),2.5×106个M2型巨噬细胞(islet+M2组)。移植术后取尾静脉血监测受体血糖水平的变化,记录 胰岛存活时间,并于移植后10 d每组随机抽取2只小鼠处死取左肾做病理学检查,观察移植物形态结构和胰岛素表达 水平。结果：Islet+PBS组、islet+M0组和islet+M2组移植物的中位存活时间分别为6.5(4~10),7.5(4~10)和24(>15) d;与 islet+PBS组和islet+M0组比较,islet+M2组移植物调节血糖正常水平时间和中位存活时间明显延长(P<0.01)。病理学检 查结果显示islet+M2组胰岛移植10 d后移植物结构完整,胰岛素染色阳性;而islet+PBS组和islet+M0组胰岛移植物均被 排斥,胰岛素染色阴性,局部见大量淋巴细胞浸润。结论：腹膜腔来源的M2型巨噬细胞能减轻受体对胰岛移植物的 免疫排斥反应,延长胰岛移植物的存活时间,从而提高受体对血糖的耐受能力。     

可溶性小鼠CD83-Ig对同种胰岛β细胞在糖尿病模型小鼠体内存活的影响

目的 研究可溶性小鼠CD83-Ig对NIT-1细胞在同种异基因糖尿病模型小鼠体内存活时间的影响.方法 将表达小鼠CD83胞外功能区和人IgGlαFc融合基因的真核表达载体pmcD83-hIg转染COS-7细胞,取细胞培养上清液制备CD83-Ig融合蛋白.采用链尿佐菌素(STZ)诱导法制作BALB/c小鼠糖尿病模型,并移植胰岛细胞系NIT-1进行治疗,同时在NIT-1移植的-1,1和3 d输注CD83-Ig,并观察输注CD83-Ig对NIT-1在糖尿病模型小鼠体内存活时间的影响.结果 移植NIT-1后第3天各组小鼠血糖均恢复至正常水平;移植物NIT-1细胞在输注CD83-Ig组小鼠体内的存活时间为18 d,较在输注入IgG组和PBS组小鼠体内的存活时向(均为9 d)明显延长;输注CD83-Ig组小鼠平均存活时间为(44.50±6.41)d,而输注人IgG组和PBS组小鼠存活时间分别为(29.86±4.18)d和(30.71±4.49)d.结论 CD83-Ig融合蛋白可延长小鼠胰岛β细胞在同种异基因糖尿病小鼠体内的存活时间,可能是一种用于治疗移植排斥反应的较好的免疫抑制剂.     

移植免疫耐受中调节性B细胞与调节性T细胞的依赖性关系研究

目的 探讨在联合抗Tim-1/抗CD45RB抗体诱导的移植耐受中调节性B细胞(Bregs)与调节性T细胞(Tregs)的关系.方法 建立BALB/c小鼠到C57BL/6小鼠的同种胰岛移植长期耐受模型,将长期耐受小鼠(LTS)的B细胞过继输注至接受胰岛移植的B细胞缺陷小鼠(μMT-/-)体内,或加用抗CD25抗体(PC61)去除CD25+ Treg细胞,观察移植物的存活时间,用流式细胞仪检测Foxp3+ Treg数量变化.将CD4+ Foxp3-GFP-T细胞与Bregs细胞联合过继输注RAG小鼠体内,检测Foxp3+GFP+T细胞的扩增情况.建立小鼠皮肤移植模型,在双抗体治疗的同时加用抗CD20抗体祛除B细胞,观察对Tregs数量的影响.结果 继承性转移长期耐受小鼠的Bregs可诱导83.3％的小鼠长期耐受,但加用抗CD25单抗后,胰岛移植物在较短时间(MST=20 d)内全部被排斥;继承性转移长期耐受小鼠Bregs可使Tregs数量明显增加(P＜0.01),并且可诱导CD4+ Foxp-T细胞表达Foxp3;用抗CD20抗体祛除B细胞后,双抗体诱导的皮肤移植受体小鼠体内Tregs数量明显减少(P＜0.01).结论 在双抗体诱导的移植耐受中,Bregs可能通过促进Tregs生成而延长移植物的存活.     

供体抗原特异性的CD4+CD25+Treg对心脏移植小鼠体内B细胞功能的影响

目的 观察供体抗原特异性的CD4+CD25+Treg对同种异系心脏移植小鼠受体B细胞功能的影响.方法 以Balb/c小鼠为供体、C57bl/6小鼠为受体建立小鼠心脏移植模型,于术前1 d、术后2周分别将供体抗原特异性的CD4+CD25+Treg (1×106)于尾静脉注入受体体内,术后1个月抽取小鼠外周血,分离B细胞,检测其在抗IgM抗体刺激下的增殖情况,检测小鼠外周血IgG、IgA水平,以判断应用CD4+CD25+Treg后小鼠体内B细胞功能状态.实验组:术前、术后2周使用CD4+CD25+Treg(n＝8);阳性对照组:术前、术后未使用CD4+CD25+Treg(n＝8);空白对照组:未移植小鼠(n＝8).结果 实验证实,实验组B细胞增殖水平最低,空白对照组其次,阳性对照组最高,3组差异均有统计学意义(P<0.05).外周血IgG、IgA水平检测证实,实验组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),二者明显低于阳性对照组(P<0.01).结论 经尾静脉注入CD4+CD25+Treg后心脏移植受体体内B细胞的功能可明显受到抑制,CD4+CD25+Treg可通过对B细胞的这一作用调节受体免疫状态,从而达到控制排斥反应,诱导免疫耐受的作用.     

聚乙二醇对同种小鼠胰岛移植后抗排斥治疗的影响

目的 探讨聚乙二醇(PEG)包埋小鼠胰岛细胞对同种小鼠胰岛移植物存活的影响,以及其与抗排斥药雷帕霉素共同应用对胰岛移植后抗排斥治疗的影响.方法 选取C57BL/16雄性小鼠皮下预血管化糖尿病模型,行BALB/c小鼠胰岛移植.随机分为6组:A组:正常胰岛移植组.B组:PEG包埋胰岛移植组.C组:正常胰岛移植+雷帕霉素1.5 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.D组:PEG包埋胰岛移植+雷帕霉素1.5 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.E组:正常胰岛移植+雷帕霉素3 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.F组:PEG包埋胰岛移植+雷帕霉素3 mg·kg~(-1)·d~(-1)治疗组.观察小鼠血糖变化,病理检测移植物存活情况.结果 B组胰岛存活时间(25.5±5.9)d较A组(14.7±2.6)d明显延长(P<0.01),C组胰岛存活时间(35.0±3.1)d,D、E、F组胰岛于移植后6周均存活.HE染色下B组较A组炎症反应轻,胰岛结构完整.免疫组化染色显示B组有散在染色增强细胞团而A组未见.结论 PEG包埋胰岛细胞可显著延长移植物的存活时间,并能减少免疫抑制剂雷帕霉素的用量.     

异基因造血干细胞移植后小鼠共刺激分子表达与急性移植物抗宿主病的关系

目的 探究异基因造血干细胞移植后小鼠共刺激分子表达及其与急性移植物抗宿主病（aGVHD）发病的关系。方法 供体为5只C57BL/6J（H2KD^-H2KB⁺）雄性小鼠,受体为30只CB6F1（H2KD⁺H2KB⁺）雌性小鼠。将受体小鼠随机分为单纯照射组、骨髓移植组和aGVHD组,每组10只。单纯照射组：受体小鼠接受γ射线照射后不注射任何细胞;骨髓移植组：受体小鼠接受γ射线照射后注射5×10⁶个供体来源去T淋巴细胞的骨髓有核细胞;aGVHD组：受体小鼠接受γ射线照射后,同时注射5×10⁶个供体来源去T淋巴细胞的骨髓有核细胞和3×10⁷个供体来源脾细胞。采用log-rank生存曲线分析各组小鼠移植后生存情况。分别在移植后7、14、21、28 d采用流式细胞术检测骨髓移植组和aGVHD组小鼠外周血CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞表面共刺激分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、程序性死亡蛋白1（PD-1）、可诱导共刺激分子（ICOS）和CD28的表达情况,以及移植后21 d两组小鼠脾组织CD4⁺T淋巴细胞内白细胞介素（IL）-17、γ干扰素、IL-4的表达情况,并在移植后21 d采用3,3''-二氨基联苯胺（DAB）染色检测两组小鼠结肠组织共刺激分子配体的表达情况。结果 单纯照射组受体小鼠均在γ射线照射后19 d内死亡;骨髓移植组小鼠在γ射线照射后均未出现aGVHD症状,30 d内均存活;aGVHD组小鼠在γ射线照射后出现aGVHD症状的时间为14（11~18）d,生存时间为22（13~30）d。随着时间的推移,aGVHD组小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1表达在移植后均呈下降趋势,ICOS、CD28表达均呈上升趋势。在移植后28 d时aGVHD组小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1表达均低于骨髓移植组,ICOS、CD28表达均高于骨髓移植组,差异均有统计学意义（P均<0.05）。DAB染色结果示,骨髓移植组结肠组织CD80、ICOS配体（ICOSL）、PD-1配体（PD-L1）表达均为阴性,aGVHD组结肠组织CD80、ICOSL、PD-L1阳性表达率分别为40%、80%、80%。与骨髓移植组比较,aGVHD组小鼠脾组织CD4⁺T淋巴细胞内IL-17、γ干扰素表达均增加,IL-4表达减少,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 异基因造血干细胞移植小鼠发生aGVHD后,共刺激分子CTLA-4表达随时间推移逐渐降低。CTLA-4、ICOS、PD-1均可能通过调节辅助性T细胞（Th）1、Th2、Th17等T淋巴细胞亚群分布参与aGVHD的发生、发展。