人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法     

人皮肤角质形成细胞的胰蛋白酶消化分离及无血清培养

目的 探索用DMEM—SF培养基对经胰蛋白酶两步消化分离的人角质形成细胞进行培养的方法和条件。方法 取临床整形外科手术后剩余皮肤，用0．25％的胰蛋白酶经冷和温两步消化分离后，用DMEM—SF、完全培养基于5％CO2、37℃培养，绘制生长曲线，并用单克隆抗角蛋白抗体和鼠—IgG免疫组化试剂盒进行细胞鉴定。结果 用胰蛋白酶两步消化分离的角质形成细胞在：DMEM—SF、培养基中可正常生长2周以上，生长曲线显示细胞在第4天进入对数生长期，第10天进入停滞期。鉴定显示角质形成细胞占95％以上。来源于3个不同个体的皮肤角质形成细胞经等量混合后培养与单独培养相比，细胞生长无统计学差异。结论 用胰蛋白酶对人皮肤进行冷和温两步消化分离的角质形成细胞，在DMEM—SF完全培养基中生长状况良好，其他细胞污染少，实验成本低廉，操作简单。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

人皮肤角质形成细胞无血清原代培养方法的建立

目的 建立人皮肤角质形成细胞体外无血清、无牛垂体提取物及无饲养细胞的原代培养方法.方法 应用胰蛋白酶.EDTA冷温两步消化法消化健康青年包皮皮肤,获取角质形成细胞并置于无血清、无牛垂体提取物、成分确定的角质形成细胞培养基中进行原代培养并传代.通过观察细胞形态和采用免疫组织化学方法鉴定及绘制生长曲线,分析、评价细胞质量.结果 该方法可稳定获得高纯度、活性好的角质形成细胞.原代角质形成细胞可稳定增殖2周左右,至少可稳定传代增殖5代.经免疫组织化学方法鉴定,99%以上为角质形成细胞.结论 冷温两步消化法及体外无血清原代培养技术可为科研工作提供足量高质量的角质形成细胞,是高效经济的获得人角质形成细胞的方法.     

4种品系小鼠角质形成细胞原代培养比较研究

目的 体外分离、培养并鉴定成年小鼠背部皮肤角质形成细胞(KC);对比4种品系小鼠KC的增殖与分化能力。方法 剪取4种品系成年小鼠背部皮肤,剥离皮下脂肪组织,0.25%胰蛋白酶消化获得KC;免疫荧光法鉴定KC;显微镜下观察细胞生长状况;设计不同的种板时间和密度,使用CCK-8法、EdU和高内涵法检测细胞增殖活力;通过Western blot检测4种成年小鼠KC分化情况。结果 对4种品系成年小鼠背部相同面积的皮肤组织进行胰蛋白酶消化,昆明(Kunming, KM)小鼠提取的KC数量最低,C57BL/6提取的细胞数量最多;BALB/c、KM、裸小鼠分别以8×10³个/孔的密度铺板增殖效率较高,C57BL/6以1.6×10⁴个/孔的密度铺板增殖效率较高;4种品系小鼠,BALB/c小鼠原代KC较C57BL/6小鼠原代KC增殖能力弱,分化程度差异无统计学意义。结论 采用简便易行的方法成功分离并比较4种成年小鼠背部皮肤原代KC的增殖和分化能力,为皮肤相关疾病模型小鼠的品系选择提供一定实验依据。     

人表皮细胞在三种无血清培养基中的生长与增殖

对人原代表皮细胞在无血清培养基 A、B和 C中的生长过程进行动态观察 ,并于培养第 5 d用 MTT法和3H- Td R掺入法分别测定其生长和代谢情况。结果表明 :人原代表皮细胞在无血清培养基 A中生长 (OD值 :0 .6 38± 0 .0 33)和代谢 (COM:92 8± 46 .6 9)优于无血清培养基 B(OD值 :0 .5± 0 .0 37,CPM:740 .11± 43.2 9) ,差异有极显著意义 (MTT法 :P<0 .0 1,3H - Td R掺入法 :P<0 .0 1)。在无血清培养基 B中人原代表皮细胞在培养第 12 d仍未汇合联接成片 ;而在无血清培养基 C中细胞的生长增殖与无血清培养基 A相似 (P>0 .0 5 ) ,细胞在这二种培养基中于培养第 12 d均可汇合联接成片。     

人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养

目的 探讨人皮肤角质形成细胞制备及体外培养的方法.方法 皮肤标本用胰酶、胰酶＋分离酶（dispase酶）2种方法消化,并分别以DMEM培养基、RPMI 1640培养基、限制性角质形成细胞无血清培养基（KC-FSM培养基）培养,MTT法通过比色分析测定培养48 h、72 h后细胞的光密度值（D值）,以判断不同培养基对角质形成细胞增殖的影响.结果 胰酶＋分离酶消化可获得较纯的原代角质形成细胞,细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好,培养48 h、72 h后测得的D值显著高于DMEM培养基和RPMI 1640培养基（P＜0.05）.结论 胰酶＋分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法.     

人表皮角质形成细胞的体外改良培养

目的:探讨人表皮角质形成细胞的体外改良培养方法。方法:取皮肤标本,先用 2. 5g/L胰蛋白酶 4℃浸泡 22h(冷消化法),以便于表皮真皮分离;分离后刮除真皮面 (真皮刮除法 )以获取基底细胞;收集表皮及基底细胞并混合,制成细胞悬液进行培养。培养至第 5d,采用人工纯化法去除成纤维细胞。其他操作同人表皮细胞常规培养法。培养结束后,以台盼蓝染色法检测细胞存活率,观察细胞生长状态,并与传统培养方法相比较。实验重复 3次。结果:改良组 3次培养细胞存活率分别为 87%, 91%和 95%,均高于对照组 ( 82%, 82%和 85% ) (P<0. 05)。改良组生长速度亦较快。结论:采用人工纯化法、冷消化法和真皮刮除法等改良方法可提高体外培养的人表皮角质细胞存活率及生长速度。     

长波紫外线对无血清培养人角质形成细胞增殖的影响

目的建立人角质形成细胞无血清培养方法;观察长波紫外线对无血清培养的人角质形成细胞增殖活性的影响．方法采用两步消化法分离角质形成细胞,并用K-SFM无血清培养液培养,观察细胞形态并行角蛋白K19免疫组织化学染色鉴定;采用0、3．07、6．14、12．29、24．58J／cm2剂量的长波紫外线（UVA）照射细胞,以改良四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性．结果免疫组织化学鉴定结果示,细胞阳性率接近100％;随UVA剂量的增加,其损伤率分别为0％、7．27％、32．73％、72．73％及95．45％,引起半数细胞损伤的UVA剂量为8．09J／cm2．结论体外无血清培养可获取较多高纯度的角质形成细胞,是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法;在此体系中,UVA对角质形成细胞的损伤作用与剂量相关．     

含AB型血清培养体系人角质形成细胞培养

目的：探讨人体角质形成细胞的培养技术，观察人角质形成细胞生长的过程，为培养角质形成细胞膜片提供新的方法。方法：采用改良后的含胎牛和人AB型血清培养体系进行人角质形成细胞的培养。结果：含人AB型血清培养体系培养的角质形成细胞5d融合达70％，9d达90％，11d完全融合，细胞分裂指数高峰在9d左右，可达1．1％，而不合AB型血清组培养的细胞5d后即出现退化样生长，不形成细胞膜片。进一步对含A13型血清的不同培养系统进行培养，将增殖高峰期培养的角质形成细胞应用MTT比色法测细胞增殖活性，进行比较，P〉0．05，表明添加F12、TC199、1640后对培养的角质形成细胞增殖作用无差异。结论：人AB型血清能够对体外培养的角质形成细胞生长起到刺激作用。     

rCHO细胞无血清适应及悬浮培养

考察了血清对rCHO(C28)细胞生长与产物(HBsAg)表达的影响,发现φ血清<0.01时细胞出现明显的代谢转换;考察了微量元素、氢化可的松、混合脂类与短多肽混合物(TL混合物)对细胞的影响,建立了适于rCHO(C28株)生长的无血清培养基MT-SFM;在将细胞从有血清转到无血清状态时,阶段性降血清比直接降血清更有利于rCHO(C28)细胞的无血清适应;当细胞适应了MT-SFM无血清培养基后,批培养中细胞的最大平均比生长速率可达0.65d-1,产物HBsAg的滴度在32～64之间。     

血小板活化因子受体在人皮肤角质形成细胞中的表达及其调控

目的:观察血小板活化因子受体(PAF-R)在正常人皮肤角质形成细胞中的表达调控特征.方法:应用免疫组织化学法检测PAF-R在正常皮肤组织及HaCaT细胞中的表达,采用RT-PCR法检测PAF-R在HaCaT细胞基因水平的表达特征,并用流式细胞术定量检测刺激因素作用下HaCaT细胞中PAF-R的表达调控情况.结果:PAF-R在正常人角质形成细胞中有强烈的表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质.PAF-R在HaCaT细胞转录水平有表达,且组织型mRNA产物高于白细胞型mRNA产物.PAF-R在HaCaT细胞膜内外均有阳性表达,细胞内表达量约是膜表达量的4.82倍.IFN-γ、维甲酸可以上调PAF-R在HaCaT细胞的膜表达量.结论:皮肤角质形成细胞在细胞、蛋白及基因水平均有PAF-R强烈表达,而且这种表达可被炎症因子调控,提示PAF系统可能在皮肤炎症中起重要作用.     

小鼠肝脏细胞分离和原代培养技术研究进展

肝脏是机体主要的消化、代谢器官,同时也是重要的免疫器官;获得肝脏细胞[肝细胞(hepatocytes,HCs)、肝血窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)、肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSCs)和枯否细胞(kupffer cells,KCs)等]并进行成功的原代培养,将有助于为研究肝脏的生物学特性(药物代谢、免疫及生理功能等)和人工肝工程等提供实验工具和材料;故探索和研究肝脏细胞的分离和原代培养技术具有重要意义.     

改良大鼠肝星状细胞的分离和原代培养

肝脏星状细胞 (hepatic stellate cell,HSC)又称贮脂细胞 (FSC) ,lipocyte或 Ito细胞 ,是在肝纤维化时及正常情况下肝脏中细胞外基质 (ECM)的主要来源细胞。现已证明 ,HSC在体内的活化、增殖及胶原产生的增加是肝纤维化发生发展的中心环节。因此 ,分离和培养 HSC对于从体外研究肝纤维化非常重要。1　材料与方法1.1　材料 :1雄性清洁级 Sprague- Dawdey大鼠或Wistar大鼠 1只 ,体重 4 0 0 g以上。 2主要试剂 : 型胶原酶、蛋白酶 E(美国 Sigma公司 ) ,DMEM培养粉、IMDM培养粉 (美国 Gibco公司 ) ,Metrizamide(上海Sangon公司 ) ,…     

皮肤细胞原代培养技术用于实验教学初探

本探讨了皮肤细胞原代培养技术应用于细胞培养实验课教学，具有较好的教学效果，既可以使学生观察到上皮型和成纤维型两种形态的细胞，更有助于提高学员的实验技能。     

胎鼠肺细胞的分离纯化及原代培养

目的 建立一套可靠的胎鼠肺细胞分离、纯化和培养技术，用于体外研究肺发育和早产儿肺部疾病。方法 采用胰酶和胶原酶消化19d胎鼠肺组织块，经差速离心和反复贴壁法，分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞(AECⅡ)和肺成纤维细胞(LF)，并进行原代培养。用细胞角蛋白(cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)免疫细胞化学染色和透射电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果 该方法所得细胞产量大、纯度高。免疫细胞化学鉴定，AECⅡ细胞cytoker—atin染色阳性，vimentin染色阴性，LF则相反。透射电镜观察AECⅡ，可见细胞内板层小体。结论 该方法是一种可靠的胎鼠肺细胞的分离纯化培养技术，可用于体外研究肺发育与早产儿肺部疾病。     

大鼠胰岛β细胞分离与原代培养方法探讨

目的 探索胰岛B细胞分离纯化方法和适宜的原代培养条件.方法 正常Wistar大鼠,胶原酶消化及网筛过滤初步纯化胰岛,双硫腙染色及葡萄糖刺激实验鉴定胰岛及其活性.胰岛以胰蛋白酶和DNA酶消化成单细胞悬液,在2.8 mmol/L葡萄糖条件下,用荧光激活流式细胞分选(FACS)β细胞.免疫组化法及葡萄糖刺激实验鉴定分选的β细胞及其活性,所分选β细胞置于不同浓度葡萄糖和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)50μmol/L浓度的Ham's F-10培养基中培养24 h,观察不同浓度葡萄糖及IBMX对β细胞活性的影响.结果 可获(550±95)个胰岛/只大鼠,活性良好.FACS后,可得约5688个β细胞/只大鼠,回收率(93.69±1.26)%,纯度(85.5±1.24)%.原代培养24 h后,10.0 mmol/L及16.0 mmol/L葡萄糖中β细胞活性较高,死亡和凋亡也较少.结论 胰岛的单细胞悬液,在外界葡萄糖浓度为2.8 mmol/L时可以FACS对β细胞进行分选纯化;原代培养24 h后,在外界葡萄糖浓度10.0～16.0 mmol/L时,β细胞有较高存活率和活性.     

新生大鼠大脑皮层神经细胞的原代无血清培养

神经细胞原代培养是研究神经组织形态结构和功能及其在缺血缺氯等各种损伤条件下的病理变化的重要方法之一，体外神经细胞培养经历了有血清培养向无血清培养的发展过程．近年来，应用无血清培养神经细胞方法比较广泛，各个实验室都有自已的经验．我们实验室对大脑皮层神经细胞原代培养进行了较长时间摸索，有些体会值得交流。