磁性激活细胞分选技术分离胃癌患者外周血、门静脉血癌细胞及临床初步应用

目的　建立一种分离血液中肿瘤细胞的磁性激活细胞分选 (MACS)技术并评价其临床价值。方法　采用胃肿瘤细胞膜表位的MG7、CEA、QY和MMP9单抗分别与溴化氰活化的Sepharose 4B磁珠交联 ,从胃癌患者外周血、门静脉血中分离出肿瘤细胞。结果　应用MACS技术从外周血中分离出肿瘤细胞的阳性率为4 9.15 % (2 9/5 9) ,从门静脉血中分离出肿瘤细胞的阳性率为 90 .32 % (2 8/31) ,两者比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。用MACS技术从外周血、门静脉血中分离出肿瘤细胞的阳性率与患者临床分期无关。结论　MACS技术是一种有效分离肿瘤细胞的可靠方法 ,可从胃癌患者外周血中分离出少量肿瘤细胞 ,有助于进一步探讨恶性肿瘤的发生、发展、浸润转移、多重耐药机制     

正负向磁性细胞分选技术纯化血小板方法的比较

目的获得纯化的血小板,为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法应用磁性细胞分选技术纯化血小板;流式法评价纯化后血小板活化率;白细胞绝对计数法评价有核细胞清除率。结果分选前血小板基础活化率为(2.39±1.10)%,负向分选后为(2.56±1.08)%,正向分选后为(16.76±4.04)%;正、负向分选的有核细胞清除率分别为(98.44±0.24)%及(98.47±0.18)%。正负向分选后血小板回收率分别为(76.5±1.49)%及(79.2±2.61%)。结论磁性细胞负向分选技术适合进行血小板纯化。     

鼠外周血中转基因胎儿细胞的检测及意义

目的 探讨仔鼠出生前后小鼠胎儿细胞在母鼠体内存在的情况，为应用循环于母血中的胎儿细胞进行基因诊断提供科学依据。方法 将非转基因的正常母鼠和以HS2、HS3元件、β-珠蛋白基因启动子指导的红系特异表达绿色荧光蛋白（GFP）基因的转基因公鼠交配，仔鼠出生前后采集母鼠的外周血用流式细胞仪检测其中表达GFP细胞的比例，并用PCR对母鼠和仔鼠的鼠尾DNA及母鼠的外周血进行检测。结果 在仔鼠出生前母体外周血中未检出表达GFP的细胞，而分娩后1～3周此类细胞含量达到峰值，4～5周后将逐步消失。PCR检测证实母鼠体内没有外源GFP基因的DNA片断，但分娩后其外周血中则存在GFP基因阳性片断，这与荧光激活细胞分选仪（FACS）的检测结果一致。结论 转基因细胞是一种良好的标记物，可以用来观察胎儿细胞在母体中存在的规律，为使用母体外周血进行基因诊断提供了依据。     

磁性分选肺腺癌始动细胞的异常miRNAs验证

目的利用磁性活细胞分选法（magnetic activated cell sorting,MACS）从人A549肺腺癌细胞中分离得到CD133＋标记细胞,通过CD133/CD326双阳性检测探讨分离效果,初步分析差异表达miRNAs对该亚群细胞的调控功能。方法将对数生长期的A549细胞离心收集,重悬于无血清培养基中,培养至第二代后利用CD133磁珠标记后分选,流式细胞术及免疫荧光验证分选后细胞的CD133/CD326双阳性率;结合前期实验miRNA芯片结果,挑选兴趣分子进行定量PCR验证。结果利用CD133磁珠分选得到的阳性细胞亚群高表达CD133/CD326分子,结合前期miRNA芯片结果,选出在CD133＋/CD326＋细胞亚群中表达上调的miR-663,miR-183,miR-125a-5p,miR-127,miR-520h及表达下调的miR-18b,miR-29ab,miR-17和miR-155行定量PCR检测证实miR-29ab,miR-155,miR-183,miR-127-3p及miR-17的表达趋势与芯片结果相符。结论利用磁珠分选方式能获得CD133＋/CD326＋高表达肺腺癌始动细胞亚群且包括miR-183等在内的6条分子与芯片结果一致,可能在肺腺癌始动细胞生物学行为的调控中发挥重要作用。     

胃癌患者外周血单个核细胞HLA基因表达研究

目的探讨胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因的表达水平及对胃癌的临床应用价值。方法设计HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测43例胃癌患者和22例健康人PBMC内基因表达水平并分析其差异。结果(1)胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G的mRNA相对表达量分别为0.71±0.26、0.61±0.37、0.91±0.33、0.90±0.38、0.77±0.27。健康组分别为1.23±0.60、1.17±0.60、1.07±0.68、1.12±0.55、0.98±0.37。与健康组相比,胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-G表达水平降低,差异有统计学意义。HLA-DP和HLA-DR则无明显差异。(2)在不同分化的胃癌患者中,HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR和HLA-G的mRNA表达水平无明显差异。胃癌Ⅰ期+Ⅱ期的HLA-G表达水平高于Ⅲ期+Ⅳ期,差异有统计学意义。不同分期的HLA-A和H...     

腹腔热灌注化疗对晚期胃癌患者外周血和腹水调节性T细胞的影响及意义

目的探讨腹腔循环热灌注化疗对晚期胃癌患者外周血和腹水CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg细胞)的影响和意义。方法 48例胃癌合并腹水患者,采用替吉奥(S-1)联合顺铂腹腔循环热灌注化疗方案治疗2周期后参照世界卫生组织(WHO)标准进行疗效评价。采用流式细胞术检测有效组和无效组化疗前后外周血及腹水中Treg细胞比例变化。结果 48例患者中,完全缓解(CR)2例,部分缓解(PR)30例,无效(NC)11例,进展(PD)5例,腹水有效控制率(CR+PR)为66.67%(32/48)。腹水的Treg细胞比例均高于外周血(P0.05)。有效组化疗后外周血和腹水中Treg细胞比例均较化疗前下降(P0.05);无效组化疗前后Treg细胞比例变化不明显(P0.05)。化疗前两组间外周血及腹水中Treg细胞比例比较,差异无统计学意义(P0.05);化疗后两组间外周血及腹水中Treg细胞比例比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论 S-1联合腹腔热灌注化疗可有效治疗胃癌合并腹水,可能主要通过杀伤肿瘤的方式,间接解除Treg细胞的免疫抑制作用。     

硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对胎儿有核红细胞富集效果的比较

目的 分析硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对胎儿有核红细胞(FNRBC)的富集效果。方法 选取2020年1月—2022年12月拟于医院产科门诊进行产前筛查的112例孕妇为研究对象,所有孕妇均采集外周肘静脉血10 mL,分别通过硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法对血液样本中FNRBC进行富集。比较两种方案富集前后细胞形态及细胞计数情况,记录两组方案对FNRBC的富集时间及富集所得FNRBC的无菌试验结果。结果 硅芯片纳米微流体技术对FNRBC的富集时间长于磁激活细胞分选法(P<0.05);两种方案的无菌试验阳性发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与磁激活细胞分选法相比,硅芯片纳米微流体技术进行FNRBC富集时所得的总细胞量较少,FNRBC量较多,FNRBC比例较高(P<0.05)。结论 硅芯片纳米微流体技术与磁激活细胞分选法进行FNRBC富集所得样本受污染风险均较低,与磁激活细胞分选法相比,硅芯片纳米微流体技术去除混杂细胞的能力较强,且获得的FNRBC数量较多,对FNRBC的富集效果较好,但所需时间较长。     

乳腺癌、胃癌及大肠癌患者外周血CK20的检测与其临床病理分期相关性研究

目的 :检测乳腺癌、胃癌及大肠癌患者外周血中细胞角蛋白 2 0 (cytokeratin2 0 ,CK2 0 )并分析其临床病理联系。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)检测乳腺癌、胃癌及大肠癌患者外周血CK2 0mRNA ,并以 6 0例健康者作为对照。结果 :6 0例健康对照组外周血CK2 0mRNA均为阴性。实验组 138例CK2 0mRNA表达阳性为 5 3/ 138,其中CK2 0mRNA表达阳性分别为乳腺癌 16 / 4 4 ,胃癌 2 2 / 5 7及大肠癌 15 / 37。CK2 0mRNA表达阳性在TNM及Dukes(大肠癌 )分期中分别为 :I期 (乳腺癌 1/ 6 ;胃癌 2 /11) ,II期 (乳腺癌 2 / 12 ;胃癌 4 / 19) ,III期 (乳腺癌 10 / 18;胃癌 12 / 2 1)及IV期 (乳腺癌 3/ 8;胃癌 4 / 6 ) ,(P <0 .0 5 ,I,IIvsIII,IV) ;大肠癌A期 (1/ 7) ,B期 (4 / 16 ) ,C期 (7/ 10 )及D期 (3/ 4 ) ,(P <0 .0 5 ,A、B及C、D期间 )。胃癌及大肠癌病理改变在低未分化及中高分化癌间经 χ2 检验有显著差异。结论 :RT -PCR方法检测乳腺癌、胃癌及大肠癌患者外周血中CK2 0mRNA表达与其临床及病理分期相关     

胃癌患者外周血中CK20的表达及临床诊断意义

应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测182例胃癌患者和40例健康志愿者的外周血中CK20 mRNA的表达。结果胃癌组外周血CK20 mRNA阳性表达率为48.9%,健康志愿者组均表达阴性,差异具有统计学意义（P〈0.01）。胃癌患者外周血CK20 mRNA的阳性表达率与胃癌分化状态、TNM分期相关（P〈0.05）。胃癌患者外周血中CK20 mRNA的阳性表达可作为胃癌微转移的判断指标。     

STAT3信号通路对胃癌患者外周血调节性T细胞的作用机制分析

目的 分析信号转导与转录因子3(STAT3)信号通路对胃癌患者外周血调节性T细胞的作用机制.方法 回顾性纳入2017年11月至2020年11月于滨州医学院烟台附属医院进行治疗的80例胃癌患者为观察组,并纳入同期行健康检查的80例健康志愿者为对照组.比较2组外周血调节性T细胞变化及对T效应细胞(Tresp细胞)功能的影响...     

应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究

目的 研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC).方法 采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别.结果 未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC.结论 本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究.     

应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究

目的研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC)。方法采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别。结果未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC。结论本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究。     

Separation of T and B lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells using density perturbation methods

The fractionation of sub-populations of peripheral blood mononuclear cells has become an essential routine procedure and some of the main fractionation methods used today are immunomagnetic separations. We describe a less expensive method for the separation of subpopulations of mononuclear cells using density perturbation, which uses the binding of antibody-coated dense polystyrene beads to increase the density of specific sub-populations of cells. By incubating a total mononuclear fraction from human peripheral blood together with antibody-coated beads, in a commercially-available lymphocyte separation medium (Nycoprep 1.077), a depletion of 94.9 ± 1.68% of the T cells could be obtained by this procedure; a depletion of 69.7 ± 1.78% of the B cells was also achieved. These results indicate the potential for the separation of different sub-populations of peripheral blood mononuclear cells on the basis of the immunological identity of the surface of cells using density perturbation methods involving antibody-coated dense polystyrene beads.     

小肾癌的声像图征象及其临床价值

目的 探讨小肾癌（直径≤30mm)的声像图征象及其临床价值。方法 对28例经手术和病理证实的小肾癌进行超声检查。与正常肾实质和肾窦部回声比较。将肿瘤回声水平分为四级。采用灰阶超声观察肿瘤内部回声、周边低回声晕或高回声环,部分病例还进行了彩超检查。结果 本组病例中较肾实质回声强的小肾癌13例（46.43%),与肾实质回声水平相当和低于肾实质回声13例（46.43%),以囊性成分为主的2例（7.14%）。周边低回声晕或高回声环者共14例（50.00%),内部出现囊性成分者8例（28.57%)。结论 灰阶超声有助于诊断小肾癌,彩色多普勒超声和CT增强扫描的运用能够提高小肾癌的定性诊断正确率。     

骨桥蛋白mRNA在大肠癌患者外周血中的表达及其临床意义

目的检测大肠癌外周血中的骨桥蛋白(OPN)mRNA的表达,探讨其与临床病理分期及淋巴转移的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应技术检测52例大肠癌患者(大肠癌组)外周血单个核细胞中OPN mRNA的表达,并以33例大肠腺瘤患者(大肠腺瘤组)及20例健康人(健康对照组)外周血作为对照。结果 OPN mRNA在大肠癌组外周血单个核细胞中表达的阳性率为65.4%,大肠腺瘤组OPN mRNA阳性率为33.3%,健康对照组外周血中均无靶OPN mRNA表达。大肠癌组与大肠腺瘤组OPN mRNA阳性表达率均高于健康对照组(P均<0.01),大肠癌组OPN mRNA阳性表达率高于大肠腺瘤组(P<0.05)。随着大肠癌Dukes分期的升高,其外周血单个核细胞中OPN mRNA表达阳性率逐渐增高(P<0.05)。有淋巴结转移的表达阳性率高于无淋巴结转移及对照组(P均<0.01);无淋巴结转移患者与大肠腺瘤组之间差异无统计学意义。结论外周血单个核细胞中OPN mRNA阳性表达对大肠癌的淋巴转移及预后判断具有一定价值。     

用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞

目的用非整合重编程技术构建人外周血单个核细胞(PBMC)来源诱导多能干细胞(i PSC)。方法收集健康人外周血标本,分离PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC,并用无饲养层细胞的培养体系培育获得i PSC。通过细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、拟胚体形成和分化实验对i PSC细胞进行多能性验证;用核型分析和仙台病毒基因组RNA检测对其进行安全性验证。结果在仙台病毒感染后16 d后,PBMC出现i PSC样克隆。i PSC可进行传代培养,且经多能性验证实验证明其具有多能性;安全性验证结果表明,i PSC核型正常,外源性病毒基因组RNA可被完全清除。结论建立了对PBMC进行非整合重编程的诱导体系,并获得了具有多能性、核型正常且不含外源基因的i PSC。     

Density gradient isolation of peripheral blood mononuclear cells using a blood cell processor

Large numbers of mononuclear cells (MNC) are needed for hematologic reconstitution using peripheral blood stem cells. The possibility of isolating those cells by discontinuous Ficoll-diatrizoate density gradient centrifugation in two blood cell processors (the Haemonetics V50 [V50] and the Cobe 2991 [2991]) were examined. Buffy coats from peripheral blood containing 6.23 X 10(8) MNC were separated in the V50, resulting in a recovery of 75 percent. The purity of the cells, defined as the percentage of lymphocytes and monocytes among all leukocytes, was 95 percent. With larger cell loads (3 to 7 X 10(9) MNC), the yield was higher in the V50 than in the Cobe 2991 (92 versus 75%). After separation in the V50 or the 2991, the cloning efficiencies of hematopoietic progenitor cells (CFU-GM and BFUe) were not different from those of cells isolated on 5 ml Ficoll-diatrizoate gradients in centrifuge tubes. Both leukapheresis and MNC separation can be carried out with the same bowl and tubing set in the V50. With that approach, an average of 6 X 10(9) MNC were processed in 16 experiments. An average recovery of 82 percent with 95 percent purity was achieved. The authors conclude that, in terms of simplicity of operation, cost effectiveness, and maintenance of sterility, the V50 may be better suited than the 2991 for the purification of MNC from peripheral blood.