应用嵌套式PCR法检测结核杆菌DNA

应用嵌套式聚合酶链反应（ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）法检测结核菌ＤＮＡ，所用内、外两对寡核苷酸引物衍生于３７．７ｕ（３８ｋＤａ）蛋白抗原ｂ的编码（Ｐａｂ）ＤＮＡ序列。对６种抗酸分枝杆菌和１０种非分枝杆菌ＤＮＡ进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色证实，只有人型结核杆菌、牛型结核杆菌和卡介苗（ＢＣＧ）出现３２２ｂｐ特异扩增带，而其他菌种未见此种扩增。第１步和第２步ＰＣＲ分别检测到的最低限量为１０ｐｇ和１０ｆｇ的靶ＤＮＡ。采用此法检测７２份临床标本，结果显示：该技术具有特异性强、敏感性高、快速简便的优点，尤适用于肺内外结核的早期诊断。     

采用聚合酶链反应检测肺结核病患者中的结核杆菌

目的：建立一种快速，敏感及特异的早期诊断肺结核病方法。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测了６４例肺结核患者的外周血与痰标本结核杆菌－ＤＮＡ。结果：外周血结核杆菌－ＤＮＡ的阳性率为６７．２％（４３／６４），痰标本的阳性率为２９．６％（１９／６４）（Ｐ〈０．０５），结论：用ＰＣＲ技术诊断肺结核病，可提高临床检测的特异性和敏感性。     

PCR对结核性胸水诊断价值的探讨

采用ＰＣＲ技术检测６７例胸水标本中的结核杆菌ＤＮＡ，并与细菌学检查（细菌培养）进行对比观察，结果表明：用ＰＣＲ方法检测结核性胸水中结核杆菌ＤＮＡ阳性的检测率达５２．２４％（３５／６７）；胸水细菌培养出结核杆菌者１３．４６％（７／５２），两者相比具有高度显著性（ｐ＜０．０１）。对３例大量的结核性胸水患者进行动态观察，经抗痨治疗２～３周后复查胸水ＰＣＲ仍为阳性。认为ＰＣＲ是敏感、快速、特异性的方法，对结核性胸水诊断和治疗具有实用价值。     

聚合酶链反应技术检测临床标本中军团病杆菌

探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测临床标本中军团病杆菌（ＬＤＢ）对军团菌病的诊断价值。用ＰＣＲ技术对３１例ＬＤＢ培养和（或）血清学阳性、临床诊断为军团菌病患者急性期的临床标本，军团菌巨噬细胞感染增效基因（ｍｉｐ ｇｅｎｅ）６３０ｂｐ片段进行ＤＮＡ扩增，并与军团菌培养和血清血诊断（间接荧光抗体检查法）比较。结果：ＰＣＲ技术诊断军团菌病的阳性率为９０．３％９２８／３１），比培养的阳性率（６２．６％，１     

PCR检测结核分枝杆菌DNA中不同细菌裂解方法结果观察

目的：寻找适合于临床ＰＣＲ检测结核杆菌ＤＮＡ简单、快速、有效、经济的细菌裂解方法。方法：采用１１种细菌裂解剂对相同数量的结核分枝杆菌进行裂解，裂解上清液直接用于ＰＣＲ扩增，结果：１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１％ＮＰ４０，１％Ｔｅｗｅｅｎ２０、和１％ＯＰ四种裂解剂的裂解液可直接扩增出结核分枝杆菌ＤＮＡ；ＳＤＳ，ＮａＯＨ，十二烷基肌酸钠等裂解剂的裂解液直接用于ＰＣＲ扩增均为阴性。结论：１％的Ｔｒｉｔｏｎｘ－１００，ＮＰ４０、Ｔｅｗｅｅｎ２０和乳化剂ＯＰ裂解细菌效果好，又不抑制ＰＣＲ反应，适合于作为临床ＰＣＲ检测结核杆菌的裂解剂。     

原位PCR技术检测肝中HBV—DNA的应用

目的：探讨原位ＰＣＲ技术在ＨＢＶ低水平感染中的意义。方法：用原位ＰＣＲ方法检测４２例肝炎患者石蜡包埋肝组织的ＨＢＶ－ＤＮＡ并与原位杂交技术检测结果进行比较。结果：原位ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为５０％，明显高于原位杂交法（１９％，Ｐ〈０．０１），肝组织中ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率与临床诊断无关。阳性杂交信号均位于肝细胞浆，呈簇状和弥散状分布。结论：原位ＰＣＲ检测肝组织ＨＢＶ－ＤＮＡ具有快速、灵敏、     

结核杆菌特异性重复DNA序列的PCR扩增检测

结核杆菌特异性重复ＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增检测徐华梅，巫绪芳，潘理明，吴竞生，王祖贻结核杆菌染色体ＤＮＡ中有一段多次重复出现的核甙酸序列，以此基因片段作为靶ＤＮＡ，利用ＰＣＲ技术进行扩增，为结核病人快速诊断，及时治疗提供依据。本文摘要报告我们的研究结果...     

聚合酶链反应监测人巨细胞病毒感染

应用ＰＣＲ技术对疑为先天性ＨＣＭＶ感染的患儿及其母亲血、尿标本分别进行了ＨＣＭＶ－ＤＮＡ检测。开展了稳定的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ检测方法。患儿及其母亲尿标本经基因扩增后均测到１５１ｂｐＨＣＭＶ－ＤＮＡ片段，考虑患儿为先天性ＨＣＭＶ感染。     

聚合酶链反应检测泌尿系结核患者尿中结核杆菌

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对３４例泌尿系结核病人的２４小时尿液标本进行结核杆菌染色体中３３６－ｂｐ重复序列ＤＮＡ片段的扩增检测，阳性率为９４．１％。ＰＣＲ检测２４小时尿样中结核杆菌比尿沉淀物涂片法找抗酸杆菌（阳性率５６％）及结核杆菌快速培养法Ｂａｃｔｅｃ培养结核杆菌（阳性率７０．６％）更敏感。我们还用ＰＣＲ、涂片法、Ｂａｃｔｅｃ培养法检测了１０例非泌尿系结核者中结核杆菌，阳性结果分别为０、０、３     

应用PCR快速诊断小儿结核性脑膜炎的研究

作者报道特异性寡核苷酸引物引导聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ。所用引物来自于编码结核杆菌的６５ＫＤａ蛋白质抗原基因，产生特异的３８３ｂｐ片段。对１０倍连续稀释的人型结核杆菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ，可检测出１ｐｇ结核杆菌ＤＮＡ，相当于１０～１００个细菌。应用ＰＣＲ检测４２例结脑脑脊液，阳性率为５７．１４％，直接涂片镜检和细胞培养阳性率分别为７．１４％和１４．２８％；４６例非结脑脑脊液中，３种检测结果均阴性。研究结果表明，ＰＣＲ检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ有较高的敏感性和特异性，它快速、简便，有望成为一种临床常规检测结核杆菌方法。     

高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系

目的：探讨EB病毒感染上皮细胞的机制。方法：大规模培养绒猴淋巴细胞B958系，从中提取并浓缩EB病毒，用胎儿脐带血淋巴细胞滴定后，以高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系，提取Hacat细胞基因组DNA，PCR扩增EB病毒基因组特异性核酸序列Bam HIw片段，Southern blotting及原位杂交验证感染结果。结果：PCR，Southernblotting及原位杂交结果证实高浓度EB病毒能够感染Hacat细胞，但是感染率非常低，结论：EBV对上皮细胞存在CR2或多聚IgA受体介导之外的未知感染途径。     

检测人巨细胞病毒抗原的原位免疫PCR技术

目的：建立用于诊断ＨＣＭＶ活动性感染的原位免疫ＰＣＲ方法。方法：ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株感染的人胚肺成纤维细胞或先天畸形胎儿肾组织石蜡切片,依次加入抗ＨＣＭＶ单抗,生物素化二抗,链霉亲合素以及作为指示元件的生物素化ＤＮＡ,随后进行原位ＰＣＲ扩增,经酶显色反应判断结果。结果：应用本法检测ＨＣＭＶ感染的细胞可于感染后８ｈ清晰检出阳性信号;检测先天畸形胎儿肾组织ＨＣＭＶ感染,阳性率显著高于免疫组化法。结论     

基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的 探讨基于特异常规引物（即引物不需折叠成特定二级结构）靶向恒温扩增重复DNA序列的方法，并测试其检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的可能性。方法 以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板，用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果 合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步，Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs）可用其特异常规引物对（即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R）或单引物（即Ⅱ_MIRU-F）进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株，Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高，且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论 常规引物可恒温扩增重复DNA序列（包括Mtb Ⅱ型MIRUs）；Mtb Ⅱ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。     

结核杆菌感染外周血单个核细胞对细胞免疫功能的影响

目的 :探讨结核杆菌感染外周血单个核细胞 (PBMC)对细胞免疫功能的影响及在结核病转归中的作用。方法 :用PCR检测结核病患者PBMC中结核杆菌DNA(TB DNA) ,用生物素 链霉亲和素 (BSA)系统同步检测其T细胞亚群及经植物血凝素 (PHA)诱导前后膜白介素 2受体 (mIL 2R)水平。结果 :结核病患者T细胞亚群及mIL 2R水平与对照组相比均显著降低(P <0 .0 5～P <0 .0 1)。其中PBMC内TB DNA(+)组与TB DNA(- )组相比 ,CD3+ 、CD4+ 百分率及CD4+ /CD8+ 比值降低 ,CD8+ 百分率增高 (P <0 .0 5 ) ;PHA诱导前后mIL 2R水平较对照组相比均低下 ,差异均有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :结核病患者体内细胞免疫功能低下 ,结核杆菌感染PBMC后可加重患者细胞免疫功能紊乱 ,抑制其mIL 2R表达。     

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

了解线粒体ＤＮＡ大片段缺失突变及其意义。方法采用６种方法提取人外周血细胞ＤＮＡ,,其中１种方法先分离线粒体,再抽提线粒体ＤＮＡ。以得到的人外周血细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,其产生经琼脂糖凝胶回收后与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接、转化、测序。结果６种方法抽提ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,产物电泳行为相同,发现人血细胞线粒体ＤＮＡ存在１３１６２ｂｐ特大片段缺失突变。结论此缺失首首发现的,经测序证明为人线粒体ＤＮ     

慢性乙肝患者血清及外周血单个核细胞中HBV DNA的研究

利用国产生物素交联光敏补骨酯素(Biotin—Psoralen)标记核酸探针,建立了外周血单个核细胞(PBMC)的原位杂交方法,同时应用聚合酶链反应技术(PCR)检测了血清中的HBV DNA,结合PBMC的原位杂交结果,对HBV DNA在PBMC中存在的状况和意义进行了初步探讨。     

神经酰胺对人γδT细胞和αβT细胞的诱导凋亡作用

目的: 观察神经酰胺对人γδT细胞和αβT细胞的诱导凋亡作用。方法: 用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)和CD3单抗(CD3mAb)分别刺激正常人外周血单个核细胞,获得Mtb-Ag激活的T细胞(γδT细胞为主)及CD3mAb激活的T细胞(αβT细胞为主);用不同浓度的神经酰胺(C2-Cer)分别作用于γδT细胞和αβT细胞,培养3 h后收获细胞,应用Annexin-V-FITC/PI染色,流式细胞术检测不同亚群T细胞的凋亡,应用四甲基噻唑氮蓝(MTT)比色法检测T细胞的活性。结果: Mtb-Ag激活的T细胞中γδT细胞比例可达70%~90%,CD3mAb激活的T细胞中αβT细胞比例>90%;与对照组比较,低浓度的C2-Cer (≤ 10 μmol/L)对人γδT细胞和αβT细胞的诱导凋亡作用和细胞活性抑制作用均不明显(P>0。05);而高浓度的C2-Cer对γδT细胞和αβT细胞的诱导凋亡作用和细胞活性抑制作用存在显著差异:100 μmol/L的C2-Cer诱导γδT细胞、αβT细胞凋亡比例分别增加10。4%(P>0。05)及73。5%(P<0。01),活细胞区(R1区)的细胞比例分别为对照组的88。1%(P>0。05)和7。8%(P<0。01);而500 μmol/L时诱导γδT细胞和αβT细胞凋亡比例分别增加71。9%和73。8%(P<0。01),R1区的细胞比例分别为对照组的36。5%和2。7%(P<0。01)。结论: 神经酰胺能诱导活化的人γδT细胞和αβT细胞发生凋亡,诱导γδT细胞发生凋亡所需的C2-Cer浓度明显高于诱导αβT细胞所需浓度。     

高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系

目的探讨EB病毒感染上皮细胞的机制。方法大规模培养绒猴淋巴细胞B958系,从中提取并浓缩EB病毒,用胎儿脐带血淋巴细胞滴定后,以高浓度EB病毒感染人永生化上皮细胞Hacat系。提取Hacat细胞基因组DNA,PCR扩增EB病毒基因组特异性核酸序列BamHIw片断,Southernblotting及原位杂交验证感染结果。结果PCR、Southerblotting及原位杂交结果证实高浓度EB病毒能够感染Hacat细胞,但是感染率非常低。结论EBV对上皮细胞存在CR2或多聚IgA受体介导之外的未知感染途径。     

流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌的方法学探讨

目的：建立流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）的方法。方法：用不同浓度荧光素（FITC）标记Mtb,流式细胞术检测FITC对Mtb的标记率。健康人外周全血与FITC标记Mtb（FITC-Mtb）于37℃共孵育10~120 min,溶解红细胞,洗涤后加台盼蓝淬灭未吞噬的FITC-Mtb的荧光,流式细胞术检测FITC阳性单核细胞的数值,计算单核细胞对Mtb的吞噬率。FITC-Mtb与佛波醇酯（PMA）激活分化的THP-1细胞以10∶1的比例共孵育1~6 h,或以1∶1~100∶1的比例孵育1 h和2 h,用同样的方法检测吞噬率。结果：FITC（50μg/ml）与Mtb作用2 h的标记率达92%。人单核细胞对FITC-Mtb的吞噬率从10 min的34.68%增加至120 min的79.90%。THP-1细胞对FITC-Mtb的吞噬率从1 h的30%增加至6 h的81%。FITC-Mtb与THP-1细胞以100∶1比例孵育1 h,吞噬率达平台（81%）;以50∶1的比例孵育2 h,吞噬率达平台（82%）。未加台盼蓝淬灭时,单核细胞在10 min和120 min对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比,分别增加29%和6%;而未加台盼蓝淬灭时,THP-1细胞在1 h和6 h对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比分别增加1%和7%。结论：流式细胞术检测人单核巨噬细胞吞噬FITC标记Mtb是测定单核巨噬细胞对Mtb吞噬活性的简便、快速和重复性好的方法。