Vasostatin基因对胰腺癌细胞和血管内皮细胞增殖的影响

目的研究Vasostatin转基因对胰腺癌细胞、血管内皮细胞的作用,探讨其对胰腺癌生长抑制的作用机制.方法应用腺病毒载体将Vasostatin基因转入人胰腺癌细胞SW1990、人脐静脉血管内皮细胞ECV304,应用MTT方法检测转基因后细胞的生长活力.同时,应用小管形成实验研究Vasostatin对血管内皮细胞ECV304体外血管生成的影响.结果 Vasostatin转基因对人胰腺癌SW1990细胞生长无显著影响.Vasostatin转基因(MOI分别为25和50)对人脐静脉血管内皮细胞ECV304作用72 h后,Ad-Vasostatin组的ECV304细胞数目显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P < 0.05).小管形成实验结果显示,Ad-Vasostatin组内皮细胞数目较少,细胞排列连续性差,可见条索状的细胞链,但中空闭合的管状结构缺如.结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,抑制其体外血管生成,而对人胰腺癌肿瘤细胞SW1990的体外细胞增殖无明显影响.     

Vasostatin基因对胰腺癌细胞和血管内皮细胞增殖的影响

目的研究Vasostatin转基因对胰腺癌细胞、血管内皮细胞的作用，探讨其对胰腺癌生长抑制的作用机制。方法应用腺病毒载体将Vasostatin基因转入人胰腺癌细胞SW1990、人脐静脉血管内皮细胞ECV304，应用MTT方法检测转基因后细胞的生长活力。同时，应用小管形成实验研究Vasostatin对血管内皮细胞ECV304体外血管生成的影响。结果Vasostatin转基因对人胰腺癌SW1990细胞生长无显著影响。Vasostatin转基因（MOI分别为25和50）对人脐静脉血管内皮细胞ECV304作用72h后，Ad-Vasostatin组的ECV304细胞数目显著少于PBS组和Ad-lacZ组（P〈0．05）。小管形成实验结果显示，Ad-Vasostatin组内皮细胞数目较少，细胞排列连续性差，可见条索状的细胞链，但中空闭合的管状结构缺如。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖，抑制其体外血管生成，而对人胰腺癌肿瘤细胞SW1990的体外细胞增殖无明显影响。     

载体肝干细胞分泌表达的Endostatin对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的观察携带内皮抑素基因的载体肝干细胞分泌表达的内皮抑素蛋白（Endostatin，ES）对血管内皮细胞体外增殖和凋亡的影响。方法体外扩增培养本室构建的携带内皮抑素基因的载体肝干细胞WB-ES，收集合有分泌型Endostatin的上清液。将人脐静脉内皮细胞ECV304体外增殖培养，加入不同浓度的含倍比稀释Endostatin的上清液，在不同的作用时间（24、48、72h），通过四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞生长抑制率。采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，分析载体肝干细胞WB—ES分泌表达的Endostatin对ECV304的增殖和凋亡的影响。结果载体肝干细胞胞外表达的Endostatin对人脐静脉内皮细胞ECV304生长有显著抑制作用，48h作用达到高峰，随浓度增加抑制作用增强；Endostatin作用的实验组，G1期细胞比例增加，s期细胞数下降，抑制细胞生长的机制可能主要是通过对细胞增殖的影响（P〈0．05）；实验组细胞存在细胞凋亡增加现象，但与对照组比较凋亡率差异无统计学意义。结论携带内皮抑素基因的载体肝干细胞WB-ES胞外表达的Endostatin在体外可有效抑制血管内皮细胞增殖，载体肝干细胞WB-ES有望成为靶向抗肿瘤血管生成的肝癌基因治疗载体细胞。     

胰腺癌血管内皮细胞生物学特性的实验研究

目的 研究胰腺癌血管内皮细胞的形态学特征、种属来源、遗传学特征、体外血管形成能力、增殖能力等生物学特征.方法 将人胰腺癌肿瘤细胞接种于裸鼠胰腺内,获取胰腺癌血管内皮细胞.体外培养胰腺癌血管内皮细胞,记录传代次数和传代速度,光学显微镜下观察每代细胞的形态学特征.用染色体核型分析技术研究胰腺癌血管内皮细胞的种属来源及遗传学特征,经小管形成实验观察胰腺癌血管内皮细胞的体外血管生成能力.以人脐静脉血管内皮细胞为对照,采用MTT比色法定量分析胰腺癌血管内皮细胞的体外增殖状况.对数据进行单因素方差分析及两两比较.结果 在适合的培养条件下,胰腺癌血管内皮细胞每2至3d传代1次,达融合状态时呈单层生长,呈现“铺路石”样特征.胰腺癌血管内皮细胞的种属类型为人,可见大量多倍体细胞、非整数倍染色体细胞、核内染色体缺失、错位及无法分析的片段.胰腺癌血管内皮细胞能在体外形成中空的管状结构.在体外培养48和72 h后,胰腺癌血管内皮细胞组的吸光度分别为0.581±0.014和1.082±0.033,显著高于人脐静脉血管内皮细胞组[0.379±0.038(t=8.720,P=0.001)和0.604±0.026(t=19.883,P＜0.01)].结论 胰腺癌血管内皮细胞的种属来源与人胰腺癌细胞相同,具有血管内皮细胞的典型形态特征和体外血管生成能力,具有遗传不稳定性和活跃的增殖能力.     

Canstatin基因转染对体外培养血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨电转染Canstatin基因对体外培养人脐静脉内皮细胞生长的影响。方法将Canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS-PAGE电泳检测Canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果Canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中表达并分泌至上清液中,Canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率（16.90%）高于空载体组（1.47%）和亲代细胞组（2.85%,P<0.01）,转染细胞生长明显受抑。结论Canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

不同浓度葡萄糖对人血管内皮细胞的影响

目的研究高浓度葡萄糖对人血管内皮细胞的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中分别加入5.5、20、40 mmol/L葡萄糖,作用24~72 h。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法观察细胞增殖情况,倒置相差显微镜观察细胞形态,透射电镜观察内皮细胞V304凋亡情况;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果高浓度葡萄糖能明显抑制血管内皮细胞的增殖,诱导培养的内皮细胞发生凋亡,细胞凋亡率增加,并随浓度的增高、时间的延长作用明显。结论高浓度葡萄糖能抑制培养的人血管内皮细胞增殖,促进细胞凋亡。     

内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对同型半胱氨酸致人血管内皮细胞损伤的拮抗作用

目的探讨内皮抑素(ENDO)-血管内皮细胞抑制因子(VEGI)重组腺病毒对同型半胱氨酸(Hcy)致人血管内皮细胞损伤的拮抗作用。方法应用内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子融合蛋白重组腺病毒(Ad-hENDOVEGI151)转染Hcy损伤的人血管内皮细胞ECV304,用免疫印迹法检测受染细胞融合蛋白的表达,用自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,用台盼蓝染色法计算细胞存活率,用ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达。结果制备的重组腺病毒具有较高的转基因效率,Ad-hENDO-VEGI151重组腺病毒能够在ECV304细胞中表达41 kDa大小的融合蛋白,Hcy(0.1~1.0 mmol/L)呈浓度依赖性地增加细胞LDH漏出量和降低细胞存活率,重组腺病毒能够有效地拮抗Hcy对人血管内皮细胞的损伤作用(P0.05)。结论内皮抑素-血管内皮细胞抑制因子重组腺病毒对Hcy致人血管内皮细胞损伤有拮抗作用,为治疗高同型半胱氨酸血症等疾病提供新的思路。     

葛根素对同型半胱氨酸损伤内皮细胞的影响

目的探讨葛根素对同型半胱氨酸损伤血管内皮细胞的保护作用。方法建立同型半胱氨酸（homocysteine，Hey）诱导的人脐静脉内皮细胞株（ECV304细胞）损伤模型，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测不同浓度鹞根素对ECV304细胞增殖的影响。结果HCY明显抑制ECV304细胞增殖，葛根素浓度为10-500μ/ml时，细胞活力较模捌组有明显改善；其中当葛根素浓度为100μg／ml时细胞活力最好（P〈0．001）；但与正常组比较仍有显著性差异（P〈0．001）。当葛根索浓度为20mg／ml时，细胞活力较模型组低。结论葛根索在一定浓度范围对内皮细胞有保护作用。     

Vasostatin基因对胰腺癌内皮细胞迁移的影响

目的 观察Vasostatin基因表达对胰腺癌内皮细胞迁移能力的影响.方法 应用不同浓度的载有Vasostatin基因的腺病毒(Ad-vasosiatin)感染胰腺癌内皮细胞,以Ad-lacZ感染及磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组.应用损伤修复、Transwell小室、小管形成3种不同方法观察胰腺癌内皮细胞迁移能力的变化及其与感染病毒的量效关系.结果 培养48 h后,PBS组与Ad-lacZ组的划痕损伤区域几乎完全恢复;而Ad-vasostatin组的划痕损伤区域无明显恢复.以MOI 1、2、5感染细胞,Ad-lacZ组的迁移率分别为(84.7±2.6)％、(80.7±1.7)％和(81.3±4.0)％;Ad-vasostatin组为(77.7±2.1)％、(67.3±2.1)％和(38.8±2.1)％,Ad-vasostatin呈剂量依赖性抑制细胞迁移率,MOI=5时的细胞迁移率大幅度降低(F=180.88,P＜0.05).以MOI1、5、10感染时,Ad-lacZ组的小管形成数分别为(118±6)、(120±6)、(82±5)个;Ad-vasostatin组为(65±4)、(21±4)、(4±1)个,Ad-vasostatin呈剂量依赖性抑制胰腺癌内皮细胞的小管形成,在MOI=10时已很难形成管状结构(F =300.85,P＜0.05).结论 Vasostatin基因能显著抑制胰腺癌内皮细胞的体外迁移能力,且呈剂量依赖性.     

复方丹瓜方对培养ECV 304增殖及形态影响的研究

目的探讨体现痰瘀同治法的中药复方丹瓜方对培养人脐静脉内皮细胞（ECV304）增殖及形态的影响,以揭示丹瓜方在防治糖尿病高血糖致血管内皮细胞损伤中的作用。方法以标准的M199培养液、高糖（22.22mmol/L）培养液、不同浓度的丹瓜方培养液、高糖加不同浓度丹瓜方培养液培养ECV304,观察内皮细胞生长情况及显微形态变化。结果①不同浓度丹瓜方对培养ECV304细胞的增殖、形态都具有明显影响,浓度越高对细胞增殖的抑制作用越明显;②不同浓度丹瓜方均具有促进培养的ECV304多形性及“伪足样”结构形成作用,适当丹瓜方浓度（如1/450）作用显著;③过高糖（22.22mmol/L,相当于临床重度高血糖的糖尿病病人）对培养的ECV304也具有抑制作用;④丹瓜方和过高糖对细胞的抑制作用不形成叠加。结论丹瓜方对培养的ECV304具有明显的抑制增殖作用,对细胞形态也有明显的影响。     

Treatment of pancreatic carcinoma by adenoviral mediated gene transfer of vasostatin in mice

BACKGROUND: Tumour growth is angiogenesis dependent and antiangiogenesis therapy may represent a promising therapeutic option. AIMS: To evaluate the inhibitory effect of vasostatin gene mediated by a replication deficient recombinant adenovirus (Ad) on human pancreatic cancer in vivo and to investigate the mechanism of action of vasostatin. METHODS: Human umbilical vein endothelium derived ECV304 cells were infected with Ad-vasostatin and Ad-lacZ, and compared with phosphate buffered saline (PBS). MTT (3,-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was used to estimate the proliferation of ECV304 cells; tube formation assay and choriallantoic membrane assay were used to evaluate angiogenesis in vivo and in vitro. Xenografted nude mice with pancreatic cancer were established to observe in vivo tumour growth suppression. Microvessel density revealed by CD31 immunohistochemical staining was measured. RESULTS: Growth and tube formation of ECV304 cells infected with Ad-vasostatin were suppressed significantly compared with cells infected with Ad-lacZ or cells treated with PBS. Neovascularisation in the Ad-vasostatin group was less than that in the PBS and Ad-lacZ groups, based on chorioallantoic membrane results. Volumes of pancreatic tumours in the Ad-vasostatin group were significantly smaller than those in the PBS and Ad-lacZ groups at the end of the treatment period. Microvessel density in the Ad-vasostatin group was significantly lower than that in the Ad-lacZ and PBS groups. CONCLUSION: The vasostatin gene mediated by adenovirus is efficient for gene therapy for pancreatic carcinoma. Suppression of vasostatin on proliferation of vascular endothelium cells and angiogenesis may account for its effect.     

溶血磷脂酰胆碱诱导内皮细胞表达血管内皮生长因子及丹酚酸B的抑制作用

研究溶血磷脂酰胆碱对内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响以及丹酚酸B的保护作用。在人脐静脉内皮细胞株ECV30 4培养基中加入溶血磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰胆碱 +丹酚酸B ,用酶联免疫吸附试验检测各组内皮细胞培养上清液中血管内皮生长因子蛋白含量 ;用原位杂交检测血管内皮生长因子mRNA的表达。结果显示 ,培养的ECV30 4中未见血管内皮生长因子mRNA的表达 ,溶血磷脂酰胆碱刺激后可见血管内皮生长因子mRNA的高表达 ,加入丹酚酸B后阳性反应明显低于溶血磷脂酰胆碱组。酶联免疫吸附试验结果显示 ,溶血磷脂酰胆碱可使ECV30 4细胞条件培养基中血管内皮生长因子蛋白表达明显增加 ,丹酚酸B可明显降低其含量。以上结果提示 ,溶血磷脂酰胆碱能诱导ECV30 4表达高水平的血管内皮生长因子 ,丹酚酸B可明显降低其含量     

氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990侵袭转移能力的影响

目的 探讨氧化苦参碱对人胰腺癌细胞株SW1990体外迁移及侵袭能力的影响及其作用机制.方法 体外培养人胰腺癌SW1990细胞株,用氧化苦参碱处理SW1990细胞后,采用MTT法检测细胞增殖;通过细胞黏附实验、细胞划痕实验及Transwell小室检测细胞的黏附、迁移及侵袭能力;RT-PCR法检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达;ELISA法检测细胞VEGF蛋白的含量.结果 氧化苦参碱呈剂量和时间依赖性抑制SW1990细胞的增殖.2 mg/ml氧化苦参碱处理SW1990细胞1 h后,细胞的体外黏附抑制率为(35.23 ±8.56)%;处理24 h后,细胞的过河时间为(65.46±4.25)h,较对照组的(34.50±4.12)h显著延长(P<0.05);穿膜细胞数为(91.9±9.6)个,较对照组的(144.2±17.2)个显著减少(P<0.05);细胞VEGF、MMP-2 mRNA的表达及VEGF蛋白的分泌量均显著下调[0.515 ±0.063比0.817±0.054,0.343±0.072比0.650±0.068,(265.50 ±5.45)pg/ml比(441.06±16.70)pg/ml,P值均<0.05].结论 氧化苦参碱可能通过抑制MMP-2和VEGF表达进而抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭能力.     

脂氧合酶对胰腺癌细胞增殖和凋亡的调节作用

目的观察5-脂氧合酶（LOX）及12-LOX在人胰腺癌中的表达，并初步探讨LOX的作用底物——多不饱和脂肪酸（PUFA）及LOX抑制剂对胰腺癌细胞增殖及凋亡的调节作用。方法用免疫组织（细胞）化学、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法研究5-LOX及12-LOX在胰腺癌组织和细胞株SW1990中的表达，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）还原法及溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记法研究不饱和脂肪酸包括花生四烯酸（AA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）以及5-LOX抑制剂MK-886和12-LOX抑制剂Baicalein对SW1990细胞增殖的影响；并用末端脱氧核苷酰转移酶介导的d-UTP-生物素缺口末端标记法（TUNEL）及流式细胞术方法研究上述物质对SW1990细胞凋亡的影响。结果5-LOX及12-LOX在胰腺癌组织和SW1990人胰腺癌细胞呈高表达，显著高于人正常胰腺组织对照。AA促进胰腺癌细胞株SW1990的增殖，且呈剂量依赖性；而DHA及EPA抑制SW1990细胞增殖，均呈剂量依赖性，DHA及EPA尚可促进SW1990细胞凋亡。MK-886及Baicalein均能抑制胰腺癌细胞株SW1990的体外增殖，并呈剂量依赖性，两者均可促进SW1990细胞凋亡，作用24h后凋亡细胞比例增高。结论5-LOX及12-LOX在胰腺癌中表达上调，PUFA对胰腺癌细胞增殖与凋亡存在调节作用，并且不同脂肪酸作用存在差异。从促进胰腺癌细胞增殖，而DHA及EPA抑制其增殖，促进其凋亡。LOX抑制剂体外可抑制胰腺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡。LOX可能是胰腺癌生物化学治疗的新靶点。     

Calreticulin and calreticulin fragments are endothelial cell inhibitors that suppress tumor growth.

Several angiogenesis inhibitors are fragments of larger proteins that are themselves not active as angiogenesis inhibitors. Vasostatin, the N-terminal domain of calreticulin inclusive of amino acids 1-180, is an angiogenesis inhibitor that exerts antitumor effects in vivo. In the present study, we examined whether the full-length calreticulin molecule shares the antiangiogenic and antitumor activities of vasostatin. Similar to vasostatin, calreticulin selectively inhibited endothelial cell proliferation in vitro, but not cells of other lineages, and suppressed angiogenesis in vivo. When inoculated into athymic mice, calreticulin inhibited Burkitt tumor growth comparably with vasostatin. Calreticulin lacking the N-terminal 1-120 amino acids inhibited endothelial cell proliferation in vitro and Burkitt tumor growth in vivo comparably with vasostatin. An internal calreticulin fragment encompassing amino acids 120-180 also inhibited endothelial cell proliferation in vitro and angiogenesis in vivo comparably with calreticulin and vasostatin. These results suggest that the antiangiogenic activities of vasostatin reside in a domain that is accessible from the full-length calreticulin molecule and localize to calreticulin N-terminal amino acids 120-180. Thus, calreticulin and calreticulin fragments are inhibitors of angiogenesis that directly target endothelial cells, inhibit angiogenesis, and suppress tumor growth. This information may be critical in designing targeted inhibitors of pathological angiogenesis that underlies cancer and other diseases.     

Galectin-3在人胰腺癌细胞株SW1990增殖浸润中的作用

目的 研究Galectin-3（GAL-3）在人胰腺癌细胞株SWl990增殖、浸润中的作用。方法 体外培养人胰腺癌细胞株SW1990和人胰腺星状细胞（PSC），收集细胞培养上清液。ELISA、RT—PCR和Westernblot检测PSC和SW1990细胞GAL-3的表达。四唑氮蓝还原法（MTT）和流式细胞仪检测不同培养液对SW1990细胞和PSC的增殖的影响。体外侵袭试剂盒检测PSC上清液和GAL-3抗体对SW1990细胞浸润的影响。结果SW1990细胞表达GAL-3，PSC培养上清能增强其GAL-3的表达。SW1990上清液通过GAL-3促进PSC增殖，不同的培养上清液影响PSC细胞的S期比例。PSC培养上清促进SW1990细胞的增殖和浸润，加入GAL-3单抗后，这种促进作用被部分抑制，不同的培养上清液影响SW1990细胞的S期和Gz＋M期的比例。结论 GAL-3参与SW1990的增殖和浸润。     

TMPRSS4基因沉默对胰腺癌SW1990细胞生长及侵袭的影响

目的 观察TMPRSS4基因沉默对人胰腺癌SW1990细胞体外生长增殖和侵袭的影响.方法 体外合成4个靶向TMPRSS4基因和阴性对照的真核表达载体,瞬时转染到SW1990细胞,实时定量PCR法检测转染细胞的TMPRSS4 mRNA表达.以干扰效率最高的真核表达载体转染SW1990细胞,G418筛选出稳定的TMPRSS4基因沉默的细胞株,蛋白质印迹法检测稳定细胞株TMPRSS4蛋白抑制效率,CCK-8法检测细胞生长抑制率,Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 成功构建了稳定下调TMPRSS4表达的细胞株SW1990/psi-TMPRSS4,细胞转染效率为82.9%.与亲本SW1990细胞比较,TMPRSS4 mRNA和蛋白水平分别下调了80.1%、60%.SW1990/psi-TMPRSS4组穿膜细胞数为(118.6±13.4)个,显著低于阴性对照组的(157.4±12.9)个和亲本细胞组的(157.0±9.5)个(P值均<0.01).SW1990/psi-TMPRSS4组细胞的侵袭抑制率为24.5%.但各组细胞增殖无明显变化.结论 成功筛选出稳定下调TMPRSS4表达的细胞株.下调TMPRSS4表达能有效抑制胰腺癌SW1990细胞的侵袭能力,但对细胞增殖无影响.     

EEF1A2基因对胰腺癌细胞生长和增殖的影响

目的 探讨EEF1 A2转基因对胰腺癌细胞SW1990生长和增殖的作用.方法 应用腺病毒载体将EEF1A2基因转染人胰腺癌细胞SW1990,采用MTT法检测细胞的增殖,软琼脂克隆形成试验检测细胞的生长,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果 带EEF1 A2的腺病毒感染SW1990细胞后,EEF1 A2 mRNA表达增加,72 h的A750值为1.2996±0.2091,培养6 d的细胞数为81250±1767,14 d的克隆形成率为82%,均较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05);G1期细胞比例为28.5%,S期细胞比例为60.9%,前者较空载体腺病毒组和PBS组显著减少,后者较空载体腺病毒组和PBS组显著增加(P<0.05).结论 EEF1 A2基因可以显著促进人胰腺癌细胞SW1990的生长和增殖.     

斑蝥素诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨斑蝥素（Cantharidin）对人胰腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法采用MTT法观察斑蝥素对人胰腺癌细胞株SW1990细胞增殖的抑制作用。采用Hoechst33258染色、TUNNEL染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变，并以RT—PCR和Westernblot检测凋亡调节基因p53和Bcl-2、Bax的表达。结果 5mol／L斑蝥素能明显抑制人胰腺癌SW1990细胞的生长，呈现凋亡特征。RT—PCR和Westernblot检测可见Bax、p53基因表达显著增加，而Bcl—2基因表达减少。结论 斑蝥素能诱导人胰腺癌细胞凋亡，其作用可能与上调p53、Bax基因和下调Bcl-2基因有关。