HGF和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞成骨活性的联合诱导

目的观察肝细胞生长因子(HGF)和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨活性的诱导作用。方法采用HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导兔BMSCs后检测其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨钙素和胶原蛋白I、II的含量并观察其成骨分化特性的变化。结果HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导的兔BMSCs的ALP活性、骨钙素水平和胶原蛋白I、II在细胞中表达水平均明显高于对照组细胞。结论HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导作用可以促使兔BMSCs明显表现出成骨分化特性。     

HGF和1,25-(OH)2VitD3对兔骨髓基质干细胞成骨活性的联合诱导

目的 观察肝细胞生长因子(HGF)和1,25-(OH)2VitD3 对兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)成骨活性的诱导作用.方法 采用HGF和1,25-(OH)2VitD3 联合诱导兔BMSCs后检测其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性、骨钙素和胶原蛋白I、II的含量并观察其成骨分化特性的变化.结果 HGF和1,25-(OH)2VitD3 联合诱导的兔BMSCs的ALP活性、骨钙素水平和胶原蛋白I、II在细胞中表达水平均明显高于对照组细胞.结论 HGF和1,25-(OH)2VitD3联合诱导作用可以促使兔BMSCs明显表现出成骨分化特性.     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

兔骨髓基质干细胞诱导成骨的实验研究

目的:研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法:使用密度梯度法分离骨髓基质细胞并进行培养,传2代后运用成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠(β-Gp)、L-坏血酸(AA)进行诱导,测试骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果:形态学表明骨髓基质细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,诱导后细胞生长较前明显减慢,逐渐变为立方形、锥形或梭形。汇合时细胞呈铺石状重叠生长,进而形成“钙结节”样表现。染色及电镜观察可见细胞诱导前后有明显区别,细胞增殖吸光度(OD值)及细胞碱性磷酸酶测试表明,随着时间的延长,细胞增殖变慢,但分化能力增强(P<0.05)。结论:骨髓基质细胞作为构建组织工程骨的种子细胞在地塞米松、β-甘油磷酸、L-坏血酸诱导下成骨具有可靠的重复性。     

合成成骨生长肽对大鼠骨髓基质干细胞的促成骨作用

目的研究合成成骨生长肽（sOGP）对体外培养的大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的作用，并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比。方法取大鼠股骨骨髓，贴壁法分离骨髓基质干细胞进行体外培养，加入不同浓度的sOGP，观察细胞形态变化，细胞增殖率，细胞内碱性磷酸酶（ALP）的表达，RT—PCR法检测3种主要成骨标志物（ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素）的表达，组织化学染色检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达及钙质的沉积并进行图像分析。结果sOGP对BMSCs增殖的影响随浓度不同呈现双向作用。sOGP和地塞米松在mRNA和蛋白水平均能促进各成骨标志物的表达，定量分析结果显示，sOGP在10^-9mol／L浓度组促成骨的作用最强，明显高于对照组和地塞米松组。结论sOGP能明显促进大鼠BMSCs向成骨方向转化。这种促成骨能力与其浓度密切相关，以10^-9mol／L浓度下促成骨能力最强。     

成骨生长肽对大鼠骨髓基质细胞增殖分化的影响

目的 研究成骨生长肽(osteogenic growth peptide, OGP)在体外对骨髓基质细胞增殖和成骨向分化的影响.方法 在体外培养的大鼠骨髓基质细胞中加入不同浓度的OGP(10-11～10-7 mol/L),用MTT法检测细胞增殖,酶联免疫法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的表达,RT-PCR法检测细胞内核心结合因子1(Cbfa1) mRNA的表达.结果 OGP对骨髓基质细胞增殖有促进作用(P《0.05),最大效应浓度为10-9 mol/L;能增加细胞内ALP活性(P《0.05),最大效应浓度为10-8 mol/L;可诱导Cbfa1 mRNA的表达(P《0.05).结论 OGP可促进骨髓基质细胞的增殖,并通过诱导其内Cbfa1 mRNA的表达促进其成骨向的分化.     

兔骨髓基质干细胞体外培养的实验研究

目的：探讨兔骨髓基质干细胞的体外培养技巧，观察免骨髓基质干细胞的体外生长特性，为用于骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：自兔髂骨抽取骨髓，分离骨髓基质干细胞，分别采用常规培养液及含矿化液的培养液进行培养，绘制细胞生长曲线，对细胞行碱性磷酸酶染色，计算细胞碱性磷酸酶染色阳性率，观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果：第1-3代细胞生长曲线基本相同，加入矿化液后细胞生长速度明显减慢，但细胞表现出成骨细胞特性，其碱性磷酸酶染色阳性率大大提高，在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论：兔骨髓基质干细胞在体外适当的培养条件下可以向成骨细胞方向分化，可作为骨组织工程的种子细胞．     

骨形态发生蛋白对人骨髓基质细胞的体外成骨分化影响

目的 提取牛骨形态发生蛋白，并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用，为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的缺损修复研究提供实验依据。方法 从小牛骨中的提取骨形态发生蛋白，配制条件培养液，并作用于培养状态的人骨髓基质细胞，染色检测细胞碱性磷酸酶，I型胶原表达情况，放免法测定培养液中骨钙素含量。结果 人骨髓基质细胞经衣导培养后，碱性磷酸酶，I型胶原，骨钙素表达明显增加。结论 体外培养时，天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化。     

BICC1对骨髓基质细胞定向分化的调控作用研究

目的:探讨BICC1在骨髓基质细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化过程中的作用。方法:构建Bicc1过表达质粒Bicc1-pcDNA3.1,以pcDNA3.1为对照,分别转染小鼠骨髓基质细胞ST2。对两组细胞进行成脂和成骨诱导,在成骨诱导14 d时碱性磷酸酶染色检测成骨分化情况,在成脂诱导5 d时利用油红O染色检测脂滴形成情况;采用qRT-PCR及Western blot技术检测细胞Bicc1过表达对成骨及成脂相关因子的影响。结果:酶切及测序结果显示Bicc1过表达质粒构建成功,将其转染到ST2细胞后,Bicc1 mRNA表达水平较对照组升高15.23倍（P＜0.05）。成骨诱导条件下,Bicc1过表达组ST2细胞碱性磷酸酶染色增强,成骨相关因子Osterix、碱性磷酸酶、Osteopontin、Runt相关转录因子2（Runx2）和骨钙素的mRNA和/或蛋白表达水平显著上升（均P＜0.05）。成脂诱导条件下, Bicc1过表达组ST2细胞中脂滴形成减少,油红OD520较对照组明显降低（P＜0.01）,成脂相关因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪酸结合蛋白（FABP4/aP2）和adipsin的mRNA及蛋白表达水平显著下降（均P＜0.05）。结论:BICC1可促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化。     

乙烯雌酚诱导兔骨髓基质干细胞向成骨分化的实验研究

目的观察乙烯雌酚（Diethylstilbestrol）对兔骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）成骨分化的影响,探讨乙烯雌酚对骨髓基质干细胞的成骨调节及其对骨骼系统的影响。方法用不同浓度（0,10-（-10）～10-（-5） mol/L）乙烯雌酚干预1周龄新西兰长耳白兔的骨髓基质干细胞,并设地塞米松10-（-8） mol/ L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、维生素C 50mg/L为阳性对照,在干预不同时间分别用茜素红染色鉴定钙化结节形成、全自动生化仪测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性。结果10-（-8）mol/L乙烯雌酚干预25天后开始出现钙化结节 10-（-8）、10-（-7）mol/L乙烯雌酚干预组ALP在14、21天时显著增加。结论乙烯雌酚能促进兔骨髓基质干细胞的成骨分化,并能通过成骨细胞的数量来发挥骨骼系统的保护作用。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

人Ad-BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞对其Ⅱ型胶原和碱性磷酸酶表达的影响

目的：用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（Ad-BMP-2）转染兔骨髓基质干细胞（BMSC）,观察Ad-BMP-2转染对细胞分化的影响。 方法：将Ad-BMP-2转染体外培养的兔BMSC,7 d后利用原位杂交和免疫组化方法检测细胞内BMP-2及Ⅱ型胶原的表达,同时行碱性磷酸酶染色。 结果：BMP-2和Ⅱ型胶原原位杂交法显示实验组细胞胞浆中有棕黄色阳性杂交信号,对照组阴性。BMP-2和Ⅱ型胶原免疫组化法显示实验组细胞胞浆棕黄色阳性着色,胞核阴性表达,对照组阴性;碱性磷酸酶染色见实验组细胞胞浆呈棕黑色阳性着色,可见细小的棕黑色颗粒,对照组染色阴性。结论：Ad-BMP-2可高效转染BMSC,且促进其向成骨细胞和软骨细胞方向转化。     

腺病毒介导的BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞及对其增殖、成骨分化的影响

目的: 用骨形态发生蛋白-2(BMP-2)腺病毒表达载体(Ad-BMP-2)转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),研究转染对其增殖、成骨分化的影响.方法: 用Ad-BMP-2转染兔BMSCs,利用免疫细胞化学法、原位杂交染色和蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达.流式细胞仪观察细胞周期的变化,分析转染对BMSCs增殖的影响.酶标法检测ALP活性;免疫荧光检测骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原表达,分析转染对BMSCs成骨分化的影响.结果: BMP-2基因在转染细胞内mRNA水平和蛋白水平均有较高表达,蛋白印迹法检测到培养液中有BMP-2蛋白阳性表达.流式细胞仪检测G1期、S期细胞比例与空白对照组无差异.ALP活性明显增高,骨钙素、Ⅰ型胶原免疫荧光检测,见胞浆内有大量显绿色荧光的阳性物质.结论: 在腺病毒载体介导下BMP-2基因成功导入BMSCs,细胞增殖未因转染而受影响,并可持续表达基因产物,向成骨细胞分化.     

pSG5-Cbfa1转染兔皮肤成纤维细胞及其瞬时表达

目的　探讨外源性小鼠Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞中获得瞬时表达的可行性。方法　在阳离子脂质体介导下 ,将含外源性小鼠Cbfa1基因的 pSG5 Cbfa1真核表达质粒导入原代培养的第 2代兔皮肤成纤维细胞内。采用RT PCR及Western Blot法检测Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞内的瞬时表达。同时采用RT PCR法检测细胞内骨钙素及碱性磷酸酶基因的表达情况。结果　转染pSG5 Cbfa1真核表达质粒的兔皮肤成纤维细胞内有大量小鼠Cbfa1mRNA转录及蛋白瞬时表达 ,同时诱导骨钙素mRNA及碱性磷酸酶mRNA大量表达。结论　在阳离子脂质体介导下 ,小鼠Cbfa1基因能够导入兔皮肤成纤维细胞内并获得瞬时表达 ,同时诱导细胞内成骨特异性骨钙素基因及碱性磷酸酶基因的转录     

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞
过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2 的拮抗剂noggin 及Smad1 小干扰
RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt
相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增
高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化
Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到
高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表
达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。
     

BMP-7诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的初步研究

目的 探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元细胞分化的作用.方法 以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs;流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44及成脂诱导以鉴定大鼠BMSCs; MTT法检测浓度分别为25、50、75、100 ng/ml的BMP-7对大鼠BMSCs增殖的影响;第3代细胞贴壁后随机分为三组:阴性对照组、阳性对照组(β-巯基乙醇)、BMP-7诱导组;倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化;诱导2 h后进行免疫细胞化学实验,检测各组细胞神经元标志物神经丝蛋白-200(NF-200)及神经突触素-1(SYN-1)的表达情况.结果 体外培养的第3代大鼠BMSCs形态呈长梭形,"鱼尾纹"状聚集生长;CD29、CD44阳性表达,阳性率分别为99.44％、 99. 17％;成脂诱导28 d后油红0染色阳性;不同浓度的 BMP-7均具有促进大鼠BMSCs增殖的作用,以75 ng/ml最为显著;75 ng/ml BMP-7诱导大鼠BMSCs 2 h后可见形态典型的神经元细胞,NF-200及SYN-1为阳性.结论 BMP-7体外具有诱导大鼠BMSCs向神经元细胞分化的作用.     

组织工程技术修复犬牙槽骨缺损的实验研究

目的　研究以犬骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSC)为种子细胞 ,利用组织工程技术修复水平型牙槽骨缺损的可行性。方法　抽取成年犬骨髓 ,用梯度离心法获取单个核细胞 ,经条件培养液体外诱导培养后 ,进行组织化学、免疫细胞化学、扫描电镜检测 ,并将培养的第 3代细胞与藻酸钙形成复合物。在犬双侧下颌第 3、4前磨牙和第 1磨牙颊侧制备冠根向深 5mm的水平型牙槽骨缺损 ,用以下方法进行治疗 :(1)细胞 藻酸钙复合物修复组 ;(2 )藻酸钙对照组 ;(3)空白对照组。4、12、2 4周后经组织学检查骨缺损修复情况。并比较 12周时实验组与对照组的修复效果。结果在体外经诱导培养的BMSC可表达AKP、cbfa1、Ⅰ型胶原等 ,表现出成骨细胞活性 ;4、12、2 4周细胞 藻酸钙复合物修复部位显示逐渐有骨形成 ;第 12周时 ,实验组牙槽嵴高度可增高 2 4mm± 0 9mm ,达到原来的 4 8 5 9% ,空白对照组增高 0 8mm± 0 8mm ,达到原来的 15 76 % ,材料对照组增高 1 0mm± 0 9mm ,达到原来的 19 74 % ,实验组的牙槽嵴增高度和修复率与两对照组均有显著性差异(P <0 0 1)。结论　能以BMSC为种子细胞 ,以藻酸钙为支架材料 ,利用组织工程技术部分修复水平型牙槽骨缺损。     

骨形态发生蛋白-2对软骨寡聚基质蛋白在软骨细胞内表达的影响

目的 :定量研究骨形态发生蛋白 (BMP 2 )对软骨寡聚基质蛋白 (COMP)基因在人软骨细胞及ATDC5 5细胞内表达的影响。方法 :原代培养成人及胚胎的关节软骨细胞 ,经BMP 2刺激后 ,利用real timeRT PCR定量分析COMP基因的表达情况 ;采用静息期不表达COMP基因的鼠源性成软骨细胞株ATDC5 5作为研究对象 ,给以BMP 2刺激 ,通过RT PCR检测COMP表达的变化 ;将COMP基因的全长启动子克隆到报告基因Luciferase的上游并转染入ATDC5 5细胞 ,分别给以 5 0 0 μg·L-1的BMP 2和 /或 10 μg·L-1的Noggin刺激 ,测定其对Luciferase活性的影响。结果 :BMP 2使成人软骨细胞内的COMP基因表达提高近 3倍 ,而对胚胎软骨细胞的作用较弱 ,提高了1.5倍 ;COMP基因在胚胎软骨细胞内的基础表达量约是在成人软骨细胞内的 2倍 ;经BMP 2刺激后ATDC5 5细胞株明显表达COMP基因 ,并且BMP 2的这种效应能够被其拮抗剂Noggin所抑制 ;BMP 2明显促进了Luciferase的活性 ,约提高了 5倍 ,且Noggin特异性的抑制了BMP 2的这种作用。 结论 :BMP 2能够明显促进COMP基因在人关节软骨细胞及鼠源性成软骨细胞株ATDC5 5内的表达。     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7（BMP-7）的骨髓基质干细胞（BMSCs）,并与纳米羟基磷灰石胶原（nHAC）材料复合培养体外构建组织工程骨。方法用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察eGFP表达,判断感染效率;以四唑盐（MTT）实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶（ALP）活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果慢病毒24h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异（P〉0.05）;RT-PCR检测到BMP-7表达,在1300bp处出现特异性条带;ELISA检测24hBMP-7蛋白含量为（150.2±18.3）pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好。结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨。     

鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系

目的：观察鹿茸Ⅰ型胶原（VACTⅠ）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及细胞周期的影响，探讨其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系。方法：选取健康雄性4周龄SD大鼠，差时贴壁法提取BMSCs并传代培养。实验分为空白对照组、转化生长因子β3（TGF-β3）（10μg·L^-1）组和不同浓度（1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g ·L^-1）VACTⅠ组，CCK-8法检测各组BMSCs增殖率，ELISA法检测各组细胞上清液中骨形态生成蛋白4（BMP-4）和转录因子Sox9水平，流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率，RT-PCR法和Western blotting法分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA和蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较，2.50~20.00 g·L^-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01）；ELISA法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；流式细胞术，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率差异无统计学意义（P>0.05）；RT-PCR法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；Western blotting法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：VACTⅠ可促进BMSCs释放BMP-4和Sox9，提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平，抑制BMSCs增殖，是一种潜在的成软骨分化诱导剂。