大肠杆菌poly(A)化mRNA cDNA文库的构建与鉴定

目的构建和鉴定大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库。方法应用限制性显示PCR技术构建大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选、收集cDNA片段,并进行测序。根据测序结果进行初步的生物信息学分析和结果验证。结果构建了大肠杆菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库,并对其中66个基因片段进行了分析。结论所构建的大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库片段重复性低,质量高。     

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因片段的RD-PCR克隆

目的研究大肠杆菌(E.coli)中哪些基因mRNA3'端存在poly(A)化。方法利用E.colimRNA中可能存在的poly(A)尾,以oligo(dT)-cellulose进行mRNA的纯化,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,应用限制性显示-聚合酶链反应(RD-PCR)分离不同组别的基因片段并进行克隆。结果成功克隆100多个基因片段,并对其中30个进行了测序分析。结论细菌mRNA的poly(A)化可能不是偶然和个别的现象。     

大肠杆菌poly（A）化mRNA基因片段的RD—PCR克隆

目的 研究大肠杆菌（E.coli）中哪些基因mRNA3′端存在poly(A）化。方法 利用E.colimRNA中可能存在的poly（A）尾，以oligo(dT）－cellulose进行mRNSA的纯化，并以oligo(dT）18为引物逆转录合成cDNA，应用限制性显示－聚合酶链反应（RD－PCR）分离不同组别的基因片段并进行克隆。结果 成功克隆100多个基因片段，并对其中30个进行了测序分析。结论 细菌mRNA的poly（A）化可能不是偶然和个别的现象。     

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析

目的：利用限制性显示(RD)技术对丙型肝炎病毒1b亚型(HCV-1b)基因片段进行克隆与分析。方法：用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV-1b cDNA，所得的限制性内切酶片段物进行RD-PCR扩增，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。结果：得到20个大小均一(200—1000bp)的限制性片段，测序结果表明，属于HCV-1b基因。结论：RD技术能快速收集大量长度适宜、大小相对均一的病毒基因片段，能很好地用于建立cDNA文库及制备诊断芯片探针。     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

构建特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库的方法和意义

目的：构建青少年特发性脊柱侧弯椎间盘终板抑制消减cDNA文库，以研究特发性脊柱侧弯的基因表达变化间的内在联系及规律。方法：从来源于一位特发性脊柱侧弯患者顶椎椎间盘终板凸凹侧软骨组织分离poly(A)^ RNA，经反转录后，利用抑制消减杂交(SSH)方法，通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果：挑取300个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段，结果显示其中248个克隆有插入片段，片段大小范围为250-750pb。结论：应用消减杂交的方法，再经适当的改进，在去除相同遗传背景的条件下，可以建立较特异性脊柱侧弯椎间盘终板cDNA消减文库，该文库为进一步批量筛选特发性脊柱侧弯发生的相关基因群并克隆特发性脊柱侧弯相关表达基因，研究其特发性脊柱侧弯发生的分子机理与生物学特性间的关系奠定了基础。     

杜氏盐藻cDNA文库的构建及KCBP基因的克隆

目的：构建杜氏盐藻cDNA文库并从该文库中筛选类驱动蛋白钙调素结合蛋白（KCBP）基因cDNA序列。方法：取对数生长期的杜氏盐藻细胞,提取总RNA并分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,连接到pAP3neo载体上,采用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B。计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。运用PCR法筛选含有KCBP基因特异片段的质粒。结果：文库滴定度为5.6×106pfu/mL,重组率在90%左右,插入片段长度在0.4～6.0kb,平均长度为1.9kb。利用PCR法从该文库中筛选到了含有新基因KCBP特异片段的单菌落,经测序与cDNA末端快速扩增（RACE）-PCR获得的杜氏盐藻KCBP基因cDNA序列相符,此序列属于kine-sin-14家族。结论：成功构建杜氏盐藻cDNA文库,并从该文库筛选出一个kinesin样cDNA序列。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1的反式调节基因筛选

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP1反式激活的相关基因,从分子生物学的角度研究HCV致病机制。方法:以NS5ATP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照组,从中分别提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果:成功构建NS5ATP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后将阳性克隆经菌落PCR分析,得到90个200～1000bp的插入片断。挑选含插入片段的30个克隆进行测序,通过生物信息学分析得到3种已知序列的基因(Ras癌基因家族成员RAN、DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ多肽C、核糖体蛋白L2)和1个未知功能的序列(推测为新基因)。结论:筛选得到的cDNA基因全长序列包括一些与...     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡反义cDNA文库的构建和效应基因的初步筛选

目的 构建曲古霉素A诱导人乳腺癌细胞凋亡反义cDNA文库,以筛选曲古霉素A抗肿瘤的效应基因.方法 收集经曲古霉素A处理不同时间点的人乳腺癌细胞MCF-7,提取poly(A)+RNA,将逆转录合成的cDNA反向插入载体PCEP 4中以构建反义cDNA文库.文库DNA随机转入人宫颈癌细胞HeLa中,以转染PCEP 4卒载体细胞为对照组,用200 nmol/L曲古霉素A和200μg/ml潮霉素同时筛选,至对照组细胞全部死亡,文库组仍有存活细胞时停止曲古霉素A筛选.存活克隆扩增后提取Hirt DNA并转化感受态细胞,获得的转化克降扩增后进行酶切鉴定并测序,得到多个EST片段,经生物信息学分析后选择感兴趣的EST片段进行初步功能验证.结果 构建的反义cDNA文库含有2 × 106重组子,重组效率>90%;经DNA测序和生物信息学分析提示第27号存活克隆是锌转运蛋白LIV1,该克隆在功能验证时表现出对曲古霉素A非常显著的抵抗效应.结论构建的反cDNA文库容量较大,质量较高;基因LIV1可能是曲古霉素A抗肿瘤的效应基因之一.     

应用70 mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库的构建

目的构建高凝状态(prothrombotic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因反向清减cDNA文库．方法用高淀粉饲料喂养制备大鼠PTS模型,从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取poly A^ mRNA,分别以1．5 μg poly A^ mRNA起始,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成平均大小为400-600 bp的片段。以PTS大鼠cDNA作为Driver,对照大鼠cDNA为Tester。将Tester分为两组,分别连上不同的接头,与Driver进行两次消减杂交和两次抑制性PCR。将第二次PCR产物cDNA克隆至pMD18-T载体上,然后转化细菌,转化后的细菌接种于含50 μg／ml ampicillin、IPTG、和X-gal的LB琼脂平板上,将克隆计数。结果获得的克隆78％为白色克隆,成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库．结论以1．5 μg poly A^ mRNA起始,采用抑制性清减杂交,构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因反向消减cDNA文库。     

骨肉瘤cDNA文库的构建和筛选

目的 研究骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在骨肉瘤发生、发展中的作用,构建SAOS-2细胞cDNA文库,寻找与BMP-2相关作用蛋白.方法 从骨肉瘤细胞系SAOS-2中提取总RNA,进而分离poly(A) RNA,用poly(A) RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组.通过文库片段,线形化的pGADT7-Rec和诱饵质粒pGBKT7/HA-BMP-2共转化酵母AH109菌株在文库构建的同时进行与BMP-2相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线形化的pGADT7-Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选.最后用Far-Western blotting法进一步从体外论证BMP-2相互作用蛋白.结果 构建了具有基因多样性和库容量足够大的骨肉瘤cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000 bp.共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105.接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106.筛选到四个与BMP-2相互作用的阳性克隆.结论 此文库的多样性和库容量均符合筛选需求.可用于骨肉瘤相关基因的进一步筛选.     

巢式PCR法构建人细胞色素P4501A1基因cDNA全长T载体

目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM -T载体。方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM- 000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与T载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定, 再行测序分析。结果重组质粒PCR扩增得到1568 bp的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%。结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的T载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法, 可用于基因的检测和载体的构建。     

舌鳞癌干细胞相关差异表达cDNA文库的鉴定与分析

目的对构建的舌鳞癌干细胞相关差异表达cDNA文库进行初步鉴定及分析。方法将差异表达cDNA文库中的cDNA片段转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,正反向文库各随机挑取120个白色克隆进行PCR鉴定并测序。将测序所得序列提交GenBank进行Blast同源性分析。利用PubMed数据库检索已报道的与干细胞相关的差异基因并进行生物信息学分析。结果 PCR鉴定显示挑取的克隆均为阳性克隆,测序获得224个EST片段。经同源性分析得到62个已知基因,其中9个已有相关文献报道与干细胞生物特性相关,可归类于细胞分化调节、低氧应答、细胞凋亡调节等。结论对前期构建的干细胞相关差异表达cDNA文库进行克隆分析得到一些干细胞相关基因。     

抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库

目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100～600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。