逆转录病毒双顺反子策略有效转导和共表达ALDH1基因与mdr1基因的研究

目的研究含内在核糖体进入位点(IRES) 的逆转录病毒双顺反子载体介导的醛脱氢酶基因(ALDH1)与多药耐药基因(mdr1)转导和共表达.方法以携带ALDH1与mdr1基因的重组逆转录病毒双顺反子G1Na-ALDH1-IRES-mdr1(G1Na-AIM)为载体,电穿孔法转导双嗜型包装细胞PA317,长春新碱筛选;所得病毒生产细胞PA317/ AIM与单嗜型包装细胞GP+E86乒乓感染提高病毒滴度;以重组病毒上清转染K562细胞,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern blot检测转移基因的整合,流式细胞术(FCM)及MTT分析基因表达,集落培养法测定转导效率.结果双嗜型病毒上清滴度达1.0×105cfu/ml.基因修饰细胞K562/ AIM经PCR 和Southern blot证实双基因稳定整合至基因组,对4-氢过氧化环磷酰胺(4-HC)及长春新碱(VCR)耐药 (提高3～10倍),FCM及集落法检测基因转导效率为62%～70%.结论逆转录病毒IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达,可用于扩大耐药范围,进行体内显性选择.     

mdr—1和DHFR双基因共转染入CD^＋34细胞拓宽造血细胞耐药谱的体外研究

目的：探讨将多药耐药基因（mdr-1)和二氢叶酸还原酶基因（DHFR)同时导入人CD^ 34细胞,以拓宽造血细胞耐药谱,改善骨髓耐受联合化疗的可行性,方法：将以造血细胞中高表达的逆转录病毒载体FMCF为基本结构骨架,通过引入IRES序列构建获得含mdr-1和DHFR（L22Y）双耐药基因的塑转录病毒载体pSF－DIM,通过脂质体介导包装,单嗜性和双 包装细胞上清交叉感染提高病毒滴度,低温离心病毒上清转染人脐血CD^ 34细胞,用流式细胞仪检测P－gp的表达,基因组PCR检测外源性耐药基因的整合,CFU－GM培养药性变化,结果：逆转录病毒载体pSF-DIM转人脐血CD^ 34细胞后,P-gp的表达较未转基因组增加了10．98％,基因组PCR同时检测到两种外源性药基因的整合,与未转基因组比较,在48nmol/L甲氢蝶呤和10ng/ml及12ng/ml紫杉醇（商品名Taxol）浓度水平,CFU－GM集落形成显著培养（P＜0．05）。结论：重组双耐药基因逆转录病毒载体pSF-DIM可度水平,CFU－GM集落形成显著增加（P＜0．05）,结论：重组双耐药基因逆转录病毒载体pSF-DIM可以有效介导mdr-1和DHFR双耐药基因进入人脐血CD34^ 细胞并获得共表达,拓宽了造血细胞药谱。     

mdr-1和DHFR双基因共转染人CD34+细胞拓宽造血细胞耐药谱的体外研究

目的　探讨将多药耐药基因 (mdr 1)和二氢叶酸还原酶基因 (DHFR)同时导入人CD3 4 细胞 ,以拓宽造血细胞耐药谱 ,改善骨髓耐受联合化疗的可行性。方法　将以造血细胞中高表达的逆转录病毒载体FMCF为基本结构骨架 ,通过引入IRES序列构建获得含mdr 1和DHFR(L2 2Y)双耐药基因的逆转录病毒载体pSF DIM ,通过脂质体介导包装 ,单嗜性和双嗜性包装细胞上清交叉感染提高病毒滴度。低温离心病毒上清转染人脐血CD3 4 细胞 ,用流式细胞仪检测P gp的表达 ,基因组PCR检测外源性耐药基因的整合 ,CFU GM培养观察耐药性变化。结果　逆转录病毒载体pSF DIM转导人脐血CD3 4 细胞后 ,P gp的表达较未转基因组增加了 10 .98% ;基因组PCR同时检测到两种外源性耐药基因的整合 ;与未转基因组比较 ,在 48nmol/L甲氨蝶呤和 10ng/ml及 12ng/ml紫杉醇 (商品名Taxol)浓度水平 ,CFU GM集落形成显著增加 (P <0 .0 5 )。结论　重组双耐药基因逆转录病毒载体pSF DIM可以有效介导mdr 1和DHFR双耐药基因进入人脐血CD3 4 细胞并且获得共表达 ,拓宽了造血细胞耐药谱     

双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究

目的　探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH3)和多药耐药基因 (mdr 1)的人脐血CD3 4 细胞能否同时增强对活性环磷酰胺 (4 HC)和mdr 1基因靶药的抗性。方法　构建含ALDH3和mdr 1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH3 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染包装细胞 ,采用含 4 HC和长春新碱 (VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染 ,将含ALDH3和mdr 1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统 (MACS)纯化后的人脐血CD3 4 细胞 ,用PCR、RT PCR、Southernblot、Northernblot、FACS和MTT等方法检测外源ALDH3与mdr 1基因在CD3 4 细胞中的转移和表达。结果　MACS分离纯化后的人脐血CD3 4 细胞纯度平均达 91% ,回收率为 72 % ,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为 6 .5× 10 5CFU/ml,应用集落计数、PCR和FACS方法测定基因转导效率分别为 18.0 %、2 0 .0 %和16 7% ,未检测到辅助病毒存在 ,有P170功能的细胞占 16 0 % ,经双耐药基因修饰的脐血CD3 4 细胞对 4 HC的IC50 较对照组提高 3.5倍 ,对VCR和柔红霉素的IC50 较未转染细胞分别高 6 .8和 5 .5倍。结论　逆转录病毒载体介导双耐药基因转导脐血造血干 /祖细胞获高效共表     

新型逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因转移小鼠造血干／祖细胞

为探讨逆转录病毒介导的外源基因转导对骨髓造血重建的影响,我们以人多药耐药基因(mdr-1)为报告基因,采用包含Friend脾灶形成病毒(spleen focus-forming vims)和鼠胚胎干细胞病毒序列的新型逆转录病毒载体SF-MDR,以病毒包装细胞与小鼠造血细胞体外共培养法进行基因转染,并对基因转导后造血细胞的体外耐药能力及体内造血重建能力进行了观测。结果表明,该载体可有效地介导mdr-1基因转导,明显提高小鼠骨髓造血细胞对秋水仙素及紫杉醇的耐受能力,对细胞体内造血重建能力没有影响,体内移植8个月后经紫杉醇体内筛选,7/7的小鼠可于外周血细胞基因组DNA中检出外源mdr-1基因的存在。     

含内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体介导多药耐药基因的高效表达

为研究内部核糖体进入位点(IRES)引导多药耐药基因(MDR1)的表达效率,利用pSXLC/pHa载体系统构建双顺反子载体pHa-IRES-MDR1(HaiMDR),其中的MDR1基因翻译由脑心肌炎病毒IRES控制。通过脂质体法将载体HaiMDR转染入单嗜性包装细胞GP E86而得到滴度2.0×10～5CFU/ml的病毒;用单嗜性病毒重复感染GP env Am12细胞获得滴度约6.5×10~5CFU/ml的双嗜性病毒生产细胞,并命名为Am12/HaiMDR。两种病毒生产细胞均具经典MDR表型,与未转染的细胞相比,两者对长春新碱、柔红霉素和紫杉醇产生15—358倍耐药。采用聚合酶链反应,在两种生产细胞均证实有外源性MDR1基因的整合和转录,但同时也发现有异常剪接的转录本存在。利用P-糖蛋白(P-gp)特异性单克隆抗体UIC2结合流式细胞术分析,两种耐药细胞均表达高水平的P-gp。因而,MDR1基因可在IRES控制下以帽非依赖性方式进行有效表达,其在基因治疗研究中可有两种用途:在癌症患者化疗后用于保护干/祖细胞,或在双顺反子载体中作为体内显性选择性标志用于共表达治疗性基因。     

逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的构建葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础,可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZ1)经EcoR1/BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建逆转录病毒表达载体PLX-GK,用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317,筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系,PCR鉴定。主要观察指标①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果成功构建GK基因逆转录病毒表达载体,经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;产毒细胞系的平均病毒滴度为6.8×108CFU/L,筛选出一株病毒滴度为1.8×109CFU/L稳定产毒细胞系PA317/GK,PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景：由于胰岛细胞分离技术难度较大，目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的：构建葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系，为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础，可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计：非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预：本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZl)经EcoR1／BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN，构建逆转录病毒表达载体PLX-GK，用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317，筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系，PCR鉴定。主要观察指标：①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果：成功构建GK基因逆转录病毒表达载体，经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变；产毒细胞系的平均病毒滴度为6．8&;#215;10^8CFU／L，筛选出一株病毒滴度为I．8&;#215;10^9CFU／L稳定产毒细胞系PA317／GK，PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论：成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

人微小DNA病毒B19与人类疾病

人微小ＤＮＡ病毒Ｂ１９是１９７４年偶然发现的一种不同于已知的动物微小ＤＮＡ病毒的病毒。这种平均直径为２３ｎｍ、单链线状ＤＮＡ病毒感染人后常呈隐性感染，故在发现后数年内并未引起人们的注意。直至检测该病毒特异性诊断方法的建立和应用才逐渐明确了Ｂ１９与人类疾病的关系，也才使我们对一些不明原因的疾病有了新的认识，目前已明确Ｂ１９感染可以造成:一些慢性溶血性贫血尤其是镰形细胞贫血病人发生再障危象；传染性红斑及其并发病──多发性关节炎或关节病；妊娠妇女流产、死胎或胎儿畸形。呼吸道是Ｂ１９最常见的传播途径。此外，经血和胎盘也可造成Ｂ１９感染。鉴于Ｂ１９感染范围广泛，且各国报告的流行情况无明显差异，考虑在我国也有可能存在Ｂ１９感染，故建议在我国开展该项调查。     

Human fibrinogen

The structure and physical properties of human fibrinogen and fibrin are reviewed along with methods for the detection of products of their metabolism. Interactions of human fibrinogen with thrombin, factor XIII, plasminogen, glycoprotein IIb/IIIa, and other proteins are related to their relevance to thrombosis and hemostasis. To the extent information is available, the structural determinants of these interactions are delineated, and kinetic and thermodynamic parameters associated with the interactions are listed. Individual steps in the reaction pathway for the conversion of fibrinogen to cross-linked fibrin are characterized. The altered hemostatic properties of mutational variants of fibrinogen are related to their altered structure. The structures of the genes coding for the polypeptide chains of fibrinogen are discussed along with the current state of knowledge of the control and regulation of fibrinogen synthesis. Fibrinogen catabolism and fibrinolysis are also reviewed.     

Human ehrlichioses

Human ehrlichioses represent one of the best examples of newly emergent infectious diseases in which the classic triad of host, infectious agent, and environment are intertwined closely. These pathogens have existed for eons on the planet, and some were described as veterinary pathogens decades ago. Because of dramatic increases of deer and small mammal populations in certain areas and the subsequent increased populations of particular blood-feeding ticks, the risk of developing these diseases is higher than before. Increasing human populations in suburban areas and increased immunosuppressed populations (transplant patients, human immunodeficiency virus patients, and cancer survivors) also have increased risk of developing severe forms of these diseases.     

Human insulin

Human insulin may be advantageous for certain subsets of patients, such as those with gestational diabetes and those who need insulin only during stress or surgery. To date, there is no evidence to support the use of human insulin in diabetics who are doing well on older insulin preparations.