CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

CRKL基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CBKL基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 将筛选确定的CRKL基因RNAi有效靶序列克隆到pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shCRKL慢病毒载体.通过酶切、测序验证后,用LV-shCRKL、pHelper 1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 载体片段插入正确.共转染包装细胞293T能产生高浓度的重组慢病毒LV-shCRKL.结论 成功构建了人CRKL基因RNAi病毒载体.     

ITIH4基因重组慢病毒干扰系统的构建

目的构建ITIH4基因重组慢病毒干扰系统。方法选取干扰效果最佳的siRNA片段,设计shRNA结构,退火反应形成双链后采用T4DNA连结酶与线性化慢病毒载体Psico连接,转化大肠杆菌后提取质粒,并经质粒DNA测序和PCR鉴定重组质粒构建是否成功,转染293T细胞并测定培养上液的病毒滴度。结果测序结果显示,重组慢病毒干扰载体Psico／ITIH4测序结果与设计的shRNA序列完全一致,转染293T细胞后,其病毒滴度为9．5×10^3 IU／mL。结论成功地构建了ITIH4基因的重组慢病毒系统,为今后深入研究ITIH4奠定了基础。     

雌激素受体ERbeta的克隆及重组慢病毒表达载体的构建

目的：构建含人雌激素受体ERbeta基因的重组慢病毒表达载体,为以ERbeta为干预靶点的乳腺癌相关研究奠定基础。方法：经RT-PCR扩增ERbeta基因片段,并将其连接到入门载体pENTRTM3C,然后经LR重组转入到慢病毒表达载体pLenti/V5-DEST中,进而构建含ERbeta基因的慢病毒载体,并进行基因测序鉴定和PCR鉴定。结果：pLenti-ERbeta表达载体测序结果与GenBank中ERbeta基因序列一致,并且其经PCR可扩增出ERbeta基因片段。结论：成功构建携带人ERbeta基因的重组慢病毒表达载体。     

FUS1基因慢病毒载体的构建

目的：构建FUS1基因慢病毒载体，包装病毒，体外高效感染细胞。方法：采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因，并将其接入慢病毒载体pSL6-IRES-EGFP中，经PCR、酶切和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T细胞，制备慢病毒。将病毒转染BEL7404和DLD-1细胞，观察病毒转染效果。结果：经过PCR测序鉴定，克隆了pSL6-FUS1-IRES-EGFP重组子；所包装的病毒对细胞的感染效率〉90％。结论：成功地克隆FUS1基因于慢病毒载体，制备了高效感染细胞的慢病毒。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

ILK基因RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:进一步研究整合素连接激酶(ILK)的功能,构建ILK基因RNAi慢病毒载体,并对其在肺腺癌A549细胞株中干扰效率进行鉴定.方法:针对ILK基因RNAi有效靶序列,合成4对oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切的质粒pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,用shILKi-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293 T细胞,包装产生慢病毒,以293 T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.获得重组慢病毒后感染人肺癌A549细胞,荧光显微镜观察GFP及Real-time PCR检测ILK在A549细胞中的表达.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了ILK-shRNA慢病毒载体shILKi-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度分别为6×108、6×108、5×108和4×108 pfu/mL;将病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察80％细胞表达绿色荧光,Real-time PCR检测ILK mRNA表达明显下降,其中染shILKFKD-1的A549细胞中ILK2-△△Ct值为0.058,shILKi-KD-2、3和4的ILK2-△△Ct值分别为0.162、0.072和0.119,尤以ILKsiRNA-1抑制最明显.结论:成功构建shILKi-LV病毒载体并建立了A549-shILKi细胞模型,为ILK在肺癌信号转导通路中的研究提供了工作基础.     

腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定北大核心CSCD

目的构建一种高效"沉默"碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料。方法设计、合成优选的靶向bFGF特异性siRNA序列。采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA。鉴定正确后经Pac Ⅰ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA。同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果。结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90%。结论应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0的构建

[目的]构建携带DREAM基因小分子干扰RNA（siRNA）的腺相关病毒载体包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,为进一步研究DREAM基因在癌痛基因治疗中的作用奠定基础。[方法]设计并合成包含DREAM短发夹序列（shRNA）两条互补的寡核苷酸链,退火后插入到经过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pDC316-EGFP-U6质粒的EcoRⅠ和SalⅠ位点,得到重组质粒pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6,然后以其为模板,通过PCR扩增DREAMshRNA-EGFP片段,并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物与pSANV2.0经EcoRⅠ和SalⅠ酶切后连接得到重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,转化入感受态大肠杆菌DH-5α,获得阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定。[结果]PCR、酶切鉴定以及测序结果证实,插入的片段序列和位点完全正确,重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP的构建成功。[结论]成功构建携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP。     

卵巢癌99mTc-MIBI显像与化疗疗效的相关性

 目的 探讨卵巢癌^99mTc-MIBI显像与化疗疗效的关系及临床意义。 方法 对28例卵巢癌复发患者进行^99mTc-MIBI显像,采集10 min及60 min两时相的平面像,采用感兴趣区(ROI)技术计算早期和延迟相肿瘤／非肿 瘤(T／N)比值及滞留指数(RI);采用TP方案进行化疗,并与T／N、滞留指数进行相关性分析。 结果 T/N比值及滞留指数低者,对化疗不敏感;T／N比值高、滞留指数高者,化疗有效,差异有统计学意义。 结论 ^99mTc-MIBI亲肿瘤显像能预测卵巢癌化疗敏感性,为临床个体化治疗提供理论依据。     

双启动子调控的条件复制腺病毒制备及其体外抑瘤作用

目的：构建并制备survivin及hTERT双启动子调控的条件复制腺病毒,探讨其特异性溶瘤作用。方法：PCR方法分别扩增肿瘤特异性survivin及hTERT启动子,分别克隆入腺病毒载体pXCl的两个复制必需基因E1A和E1B序列上游启动子区,构建出双肿瘤特异性启动子调控的条件复制腺病毒载体pXCl-SP—TP;脂质体法与pBHGE3骨架质粒共转染293E细胞进行重组腺病毒包装,稀释法测定腺病毒滴度;应用MTT、活细胞计数等方法观察其对肝癌细胞HepG2的特异性溶瘤作用并以正常人的血管内皮细胞ECV304作为对照。结果：测序及双酶切鉴定结果证实,成功构建了双肿瘤特异性启动子调控复制腺病毒载体;在293E细胞中获得了重组腺病毒Ad—sP—TP,滴度测定显示病毒滴度达到3．9×10^10TCID50／ml;MTT结果显示,Ad—sP—TP可有效抑制肝癌细胞增殖而对正常细胞无增殖抑制作用;活细胞计数及细胞形态观察结果显示,重组腺病毒在肝癌细胞中选择性复制并发挥溶细胞作用。结论：双启动子调控的腺病毒具有显著的溶瘤作用但对正常人血管内皮细胞不发挥溶细胞作用,实验结果为肝癌靶向治疗提供了更为良好的条件复制型病毒载体及新的治疗策略。     

p14ARF和MDM2在甲状腺肿瘤组织中的表达

目的研究甲状腺肿瘤组织中p14^ARF和MDM2蛋白的表达及临床意义。方法应用免疫组化SP法检测78例甲状腺乳头状癌（thyroid papillary carcinoma,PTC）、34例甲状腺乳头状微小癌(thyroid papillary microcarcinoma,PTMC)和45例甲状腺腺瘤中p14^ARF和MDM2蛋白的表达。结果p14^ARF和MDM2蛋白在三组中表达差异有统计学意义（P＜0.01)。p14^ARF蛋白在PTC组的阳性率显著低于腺瘤组（P＝0.002）及PTMC组(P＝0.008)。MDM2在PTC组的阳性率显著高于腺瘤组（P＝0.000）及PT-MC组(P＝0.009)。PTC组与PTMC组中p14^ARF蛋白和MDM2蛋白表达显著负相关。p14^ARF蛋白表达与PTC组的淋巴结转移显著负相关。结论p14^ARF和MDM2可能参与了PTC与PTMC的发生和发展,p14^ARF可作为临床判定PTC生物学行为的辅助指标。     

p14ARF在宫颈癌中的表达及其与p53 表达相关性的研究

 目的　探讨宫颈癌组织p14^ARF蛋白的表达及其与p53 表达的相关性。方法　应用免疫组化方法检测p14^ARF 、p53 基因在41 例宫颈癌及20 例正常宫颈组织中的表达。结果　p14^ARF在正常宫颈组织中不表达,41 例宫颈癌中35 例表达阳性,占85. 4 %。病理分级为G1 、G2 级的宫颈癌的p14^ARF阳性表达率为68. 4 % ,G3 级为100 % ,两者比较,有显著性差异( P < 0. 05) 。宫颈癌组织中p53 蛋白表达阳、阴性者中p14ARF蛋白表达阳性率分别为75. 0 %(12/ 16) 和92. 0 %(23/ 25) ,两者比较,无显著性差异,p14^ARFF与p53 表达不相关。结论　p14^ARF在宫颈癌中高表达有一定的诊断和估测预后价值,可能是宫颈癌新的肿瘤标志。     

5-Fu和α干扰素抗肿瘤血管形成协同效应的实验研究

目的: 研究fat-1基因在人乳腺癌细胞内的表达、功能及其对乳腺癌细胞增殖的影响.方法: 把fat-1 基因插入到腺病毒的穿梭载体中,与骨架载体同源重组,构建腺病毒重组载体 (Ad.GFP.fat1),将通过包装细胞系(293)产生的腺病毒感染人乳腺癌株QMR2细胞.提取细胞的总RNA,以fat-1的反义mRNA 作探针,用Northern Blot检测fat-1 基因在人乳腺癌株QMR2细胞内的表达.流式细胞仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMR2细胞增殖的影响.气象色谱仪分析n-3脂肪酸脱氢酶对人乳腺癌株QMR2细胞的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量影响.结果: fat-1 基因在人乳腺癌株QMR2细胞中能有效异源表达,2 d后检测到fat-1mRNA的条带.fat-1基因抑制了人乳腺癌株QMR2细胞的增殖,降低了20%(P<0.05);同时降低了人乳腺癌株QMR2细胞n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量降低.结论: 腺病毒介导的fat-1 基因能在人乳腺癌株QMR2细胞内有效异源表达,且抑制人乳腺癌株QMR2细胞的增殖.     

人PSMA基因重组腺病毒的构建及其在树突状细胞上的表达

  目的   构建含有人前列腺特异性膜抗原基因（prostate specific membrane antigen,PSMA）的重组腺病毒,并将其感染树突状细胞（dendritic cell,DC）后检测其在DC上的表达。   方法   设计一对含有SfiⅠ酶切位点的PSMA基因上下游引物,以质粒pCMV-SPORT6/PSMA为模板,通过PCR扩增获得PSMA基因序列。片段回收、酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-EGFP-PSMA。经SfiⅠ酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-CeuI和I-SceI双酶切处理,转移至pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-PSMA病毒质粒,线性化后经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA-GFP;感染从健康志愿者外周血来源的DC,荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,Western blot检测PSMA基因在DC上的表达。   结果   成功构建含有人PSMA基因的重组腺病毒,病毒滴度为2×1010 pfu/mL。构建好的Ad-PSMA-GFP可以在DC上高效和正确地表达。   结论   人PSMA重组腺病毒载体的成功构建及其在DC上的表达,为下一步研究奠定了基础。      

CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF THE REPLICATION-DEFI-CIENT ADENONIRUS VECTOR OF HUMAN GM-CSF

ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＨＥＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮＤＥＦＩＣＩＥＮＴＡＤＥＮＯＮＩＲＵＳＶＥＣＴＯＲＯＦＨＵＭＡＮＧＭＣＳＦＺｈａｎｇＷｅｉｐｉｎｇ章卫平ＣａｏＸｕｅｔａ曹雪涛ＴａｏＱｕｎ陶群Ｈｉｒｏｆｕｍ...     

腺病毒介导的HBsAg基因修饰树突状细胞瘤苗的制备

目的:构建含人HBsAg基因的腺病毒载体,体外转染树突状细胞,制备树突状细胞肝癌瘤苗。方法:将HBsAg基因亚克隆到pIND载体和Shuttle2载体中,构建穿梭载体Shuttle2-S。用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno-X连接,构成pAdeno-S重组腺病毒载体。其后,用重组腺病毒载体转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。通过酶切、PCR对腺病毒载体进行鉴定。包装好的重组病毒载体pAdeno-S体外感染树突状细胞制备树突状细胞肝癌瘤苗后Westernblot法检测其表达,流式细胞仪检测其能否诱导树突状细胞凋亡。结果:酶切、PCR鉴定证实,穿梭质粒插入片段为HBsAg基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒,腺病毒载体内携带HBsAg基因感染树突状细胞,经Westernblot法鉴定证实能够表达转染基因,并且不会诱导树突状细胞凋亡。结论:构建成功的含HBsAg腺病毒载体可以在树突状细胞中表达HBsAg,为DC瘤苗的进一步研究奠定了基础。