树突细胞-食管癌融合细胞体外诱导特异性抗食管癌免疫反应

背景与目的:树突细胞(dendritic cells,DC)是人体专职的抗原呈递细胞,以DC为基础的DC/肿瘤细胞融合疫苗可以有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.本研究旨在探讨成熟的DC与人食管癌细胞株ECl09细胞融合疫苗体外诱导特异性抗食管癌细胞的免疫反应.方法:从健康志愿者外周血中分离出单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),在重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor,rhGM-CSF)和白介素(interleukin-4,IL-4)作用下体外诱导DC,采用聚乙二醇(polyethylene glyco1,PEG)融合法使DC与EC109细胞融合制备DC/EC109细胞融合疫苗,四甲基偶氮唑盐(MTT)实验检测融合疫苗刺激T淋巴细胞增殖的活性,乳酸脱氢酶(LDH)实验检测融合疫苗活化的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在体外特异性杀伤EC109细胞的活性,并与对人胃癌细胞株SGC7901及人乳腺癌细胞株MCF7的杀伤作用进行比较.结果:DC与EC109细胞的融合效率最高达到22.25%.DC/EC109细胞融合疫苗能有效地刺激T淋巴细胞的增殖反应,其刺激T淋巴细胞增殖的能力显著高于DC或EC109细胞(P＜0.05).DC/EC109细胞融合疫苗活化的CTL对EC109细胞具有特异性的杀伤作用,对EC109细胞的杀伤作用显著强于对SGC7901细胞及MCF7细胞的杀伤作用(P＜0.05).结论:DC/EC109细胞融合疫苗能有效诱导抗EC109细胞的特异性免疫应答.     

氧化苦参碱对肿瘤诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨氧化苦参碱（Ｏｘｙ）对肺癌和胃癌细胞诱导血管内皮细胞（ＶＥＣ）增殖的抑制作用。方法 用ＭＴＴ法检测不同浓度Ｏｘｙ对ＶＥＣ、人肺腺癌ＳＰＣ－Ａ－１细胞、人低分化胃癌ＭＫＮ－４５细胞增殖及ＳＰＣ－Ａ－１和ＭＫＮ－４５细胞诱导ＶＥＣ增殖的抑制。结果 Ｏｘｙ浓度为２．５～１０ｍｇ／ｍｌ时,对ＶＥＣ增殖的抑制率为４．６％～３６．４％;Ｏｘｙ浓度为０．１５６～１０ｍｇ／ｍｌ时,对肺癌ＳＰＣ－Ａ－１和     

血管内皮细胞生长因子及其受体与肿瘤血管形成

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）调控血管生长特异性高，作用强，许多肿瘤细胞均有表达；仅有极少正常组织，在特定的条件下，才量表达；也只有血管内皮细胞表达细胞表达ＶＥＧＦ特异性受体，因此，可通过干预ＶＥＧＦ及其受体，抑制肿瘤血管形成，达到预防和治疗肿瘤转移和复发的目的。     

特异性血管内皮细胞表面蛋白——肿瘤的分子地址

近年来，随着亚细胞分离技术、蛋白质质谱分析技术、生物信息学技术的发展和成熟，人们逐渐认识到血液与肿瘤组织之间的天然屏障——血管内皮细胞膜表面蛋白的表达具有高度的组织特异性。越来越多的实验表明，这种肿瘤组织特异性蛋白有望成为肿瘤治疗的有效分子地址。     

肿瘤基质血管内皮细胞模型的建立及生物学特性研究

 目的 建立肿瘤基质血管内皮细胞模型并探讨其生物学特性。方法 用人卵巢癌细胞SKOV3培养上清液诱导人内皮细胞ECV304，获得能稳定生长的ECV304-SKOV3细胞。观察其形态改变，检测其生长情况，免疫细胞化学测定其增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、粘合素(TN)表达变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定其端粒酶活性，并分析其核型、蛋白合成能力、对常用抗癌药物的反应性。结果 ECV304-SKOV3细胞出现畸形核、有微绒毛的腔隙，染色体众数略有增加。细胞群体倍增时间较亲代细胞BCV304缩短；分裂指数增高；表达PCNA、bcL-2、MMP-9增强(t≥2．4671，P<0．05)，而TN减弱(t=2．2473，P<0．05)；S期细胞数增加，G0／G1期细胞数减少(x²=923．313，P<0．01)，增殖指数(PI)明显增高(x²=570．197，P<0．01)。对作用于S期或S期和M期的抗癌药物较ECV304敏感，且与SKOV3癌细胞一致(F≥24．14，P<0．01)。蛋白质合成能力增强(t=-12．2465，P<0．001)。端粒酶活性强于亲代细胞ECV304(t=-25．2990，P<0．001)。结论 DCV304-SKOV3细胞较亲代细胞DCV304增殖快，核型发生变化，存活能力强，功能活跃，某些血管形成因子表达增强，具有肿瘤基质血管内皮细胞的某些特性，可作为肿瘤基质血管内皮细胞模型用于进一步研究。     

特异性血管内皮细胞表面蛋白--肿瘤的分子地址

近年来,随着亚细胞分离技术、蛋白质质谱分析技术、生物信息学技术的发展和成熟,人们逐渐认识到血液与肿瘤组织之间的天然屏障--血管内皮细胞膜表面蛋白的表达具有高度的组织特异性.越来越多的实验表明,这种肿瘤组织特异性蛋白有望成为肿瘤治疗的有效分子地址.     

树突细胞和肿瘤免疫的临床实验研究

1971年Bumet提出了免疫监视的概念,认为机体免疫系统能够识别并通过细胞免疫机制破坏肿瘤细胞。大量支持肿瘤免疫监视的证据说明了免疫疗法或疫苗可以有效地治疗肿瘤。用杀死的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原蛋白、肽或DNA并辅以细胞因子或佐剂制备的疫苗可以产生免疫应答或临床反应。但是这种免疫反应通常比较弱,并且很少能产生彻底和持久的临床反应。     

血管内皮细胞与肿瘤转移

肿瘤转移是决定肿瘤病人预后的关键因素,也是恶性肿瘤病人的主要死因,如何阻断肿瘤的浸润转移是治愈肿瘤的关键环节.肿瘤转移是一个多步骤复杂过程,肿瘤细胞必须先脱离原发部位,侵入细胞外基质(ECM),与基底膜(BM)及ECM中一些大分子细胞蛋白成分粘附,并激活细胞合成分泌各种降解酶类,穿透血管壁进入循环系统,再穿透血管外渗到继发部位,与继发部位组织粘附形成克隆,增殖生长而形成转移灶.肿瘤细胞浸润转移与内皮细胞关系较密切.癌细胞产生的胶原酶和肿瘤生长因子(TGF)等能直接或间接引起内皮细胞活化,产生胶原酶原及血小板活化因子(PAF)使癌细胞在血管内形成肿瘤血栓.进而癌细胞产生蛋白分解酶,破坏细胞外基质和血管内皮细胞组成的基底膜,导致癌细胞的浸润及转移.肿瘤血行转移的关键步骤之一是血液中的癌细胞栓子附着在血管内皮上,血小板释放凝集素,使肿瘤细胞与内皮细胞粘附,血管内皮细胞收缩变圆,     

肿瘤患者外周血循环血管内皮细胞数量与血清VEGF水平的关系

目的：分析实体瘤患者外周血中的循环血管内皮细胞（circulating endothelial cells, CECs）及血管内皮前体细胞(circulating endothelial precursors，CEPs)，并比较与正常人的差异。方法：流式细胞法检测57肿瘤患者及15例正常人外周血中的CECs和CEPs，ELISA法检测血清中血管生成相关因子VEGF和bFGF的表达水平。结果：肿瘤患者外周血CECs及CEPs分别为(0.378±0.047)%和(0.059±0.013)%，血清VEGF，bFGF分别为(295.58±59.56) ng/L和(28.73±7.40) ng/L，均高于正常对照组（P<0.05）。血管内皮及其前体细胞的数量与血清VEGF，bFGF水平相关。结论：实体瘤患者外周血中循环血管内皮及其前体细胞、血管内皮生长因子均高于正常人；VEGF和bFGF可能参与了血管内皮干/祖细胞的动员过程。     

循环内皮细胞与肿瘤血管生成

循环内皮细胞（circulating endothelial cells,CECs）是指外周血中测得的血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VEC）。20世纪70年代,Bou—vier和Hladovec在动物试验中发现了这种细胞,并提出了CECs的概念。CECs在正常人外周血中数量极少,而在动脉粥样硬化、糖尿病、红斑狼疮等疾病中明显增加。多项研究表明,CECs数量的增加与内皮细胞受损明显相关,因此被认为是判断血管内皮细胞损伤情况的最特异而直接的指标。     

Bcap37完全细胞抗原冲击树突状细胞诱导特异性抗乳腺癌免疫实验研究

目的　研究 Bcap37完全细胞抗原冲击树突状细胞 (DC)能否诱导特异性抗肿瘤免疫 ,探索乳腺癌的免疫治疗方法。方法　从人外周血分离单核细胞 ,用 GM- CSF和 IL - 4诱导出 DC,反复冻融制备 Bcap37完全细胞抗原 ,将此抗原冲击的 DC与 T细胞共培养 ,以 7天后分离的 T细胞为效应细胞 ,与肿瘤细胞混合培养 ,MTT法测定对肿瘤细胞的抑制作用。结果　单核细胞经细胞因子诱导 8天 ,形态、表型及功能鉴定为成熟 DC;完全细胞抗原冲击 DC诱导的 T细胞对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。结论　 Bcap37完全细胞抗原冲击 DC可有效诱导特异性抗肿瘤免疫     

肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对大鼠卵巢上皮癌免疫治疗的体内研究

目的：研究树突状细胞（dendritic cells,DC）与肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞（tumor-associated antigen／dendritic cells,TAA／DC）对荷瘤大鼠的免疫治疗效果。方法：建立大鼠卵巢癌皮下移植瘤模型;于成瘤后2周分别用PBS、DC或TAA／DC进行免疫治疗,比较治疗效果。结果：TAA／DC抑制肿瘤细胞的增殖与转移,对荷瘤大鼠治疗后8周,局部肿瘤无明显增长,P=0．355,无转移灶出现;TAA／DC可明显改善大鼠免疫状况,对荷瘤大鼠治疗后3周,使已经下降的CD8^＋ T细胞百分比又明显上升,P=0．000;TAA／DC对荷瘤大鼠单次免疫治疗的效果具有时限性,在对荷瘤大鼠治疗后8周,CD8^＋ T细胞百分比再次出现明显下降,P=0．000。结论：TAA／DC可改善荷瘤大鼠的细胞免疫状态,抑制肿瘤细胞的增殖与转移。     

人肺腺癌细胞系SPC-A1 mRNA修饰的树突状细胞体外抗肿癌免疫反应

目的探讨人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的人外周血树突细胞(dendriticcell,DC)疫苗在体外诱导特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法从健康人外周血分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),在白细胞介素-4(interleu-kin-4,IL-4)和人粒细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)作用下诱导培养成DC。体外扩增、转录的方法获得人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA,并利用脂质体转染的方法导入DC,流式检测转染后DC表面标记,并与淋巴细胞共孵育,激活T淋巴细胞,MTT法检测其对人肺腺癌细胞的特异性杀伤活性。结果转染后的DC特异性表面标志及功能相关分子表达显著升高(CD8680·32±1·60;HLA-DR86·03±2·58;CD8326·97±1·62),诱导的特异性杀伤反应能力与经肿瘤细胞裂解物负载的DC、未经转染的DC及空白淋巴细胞组相比显著提高(80·34±2·71,P<0·01)。结论人肺腺癌细胞系SPC-A1mRNA转染的DC疫苗体外诱导的特异性抗肿瘤免疫能力显著增强。     

AFP与HBsAg混合多肽负载树突状细胞治疗HBV阳性肝癌的研究

目的：以AFP和HBsAg为双靶标,以树突状细胞（DCs）为抗原载体与佐剂,探讨其激发特异性（CTL）反应的能力及其在HBV阳性肝癌（HCC）患者应用的可行性。方法：采集20例HLA—A201＋HBV＋AFP＋HCC患者外周血,分离单核细胞（Mo）和外周淋巴细胞（PBLs）,将Mo诱导为成熟DCs（mDC）;人工合成AFP和HBsAg多肽,负载mDC后体外致敏,检测其体外杀伤活性;同时于患者皮内注射负载AFP和HBsAg混合多肽的DCs,监测接种前后患者外周血中细胞因子和特异性CTL水平变化,并进行DTH试验,治疗后跟踪检测患者AFP水平和乙肝两对半水平的变化。结果l患者外周PBLs经DCs致敏后,对负载AFP和HBsAg多肽的T2靶细胞杀伤率明显增高,P〈0．05。接种负载AFP和HBsAg多肽的DCs后,血清中IL-2、IL-12、IFN-γ水平较治疗前显著升高,P〈0．05,TNF-a和IL-10水平较治疗前均差异不大,P〉0．05;DTH试验阳性率为41．7％（5／12）,患者外周血中特异性CTLs比例明显上升的有4例（4／12）。治疗后有4例患者AFP水平下降,9例HBeAg阳性的患者中有3例HBeAg下降,2例患者出现血清学应答。结论：负载AFP和HBsAg多肽的Dcs体内、体外均具有激发特异性cTLs反应能力,可诱导Thl型细胞因子的分泌,有望成为一种HCC治疗的新方法。     

人肺癌组织总RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的:探讨以人肺癌组织总RNA体外转染树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymptocyte,CTL)发挥特异性抗肿瘤免疫的作用.方法:10例肿瘤组织经免疫组化测定为CEA、MUC1双阳性.一步法提取肿瘤组织总RNA和10例正常肺组织RNA.采集患者外周血单个核细胞体外诱导未成熟DCs,电穿孔法转染肿瘤和肺组织RNA,刺激DCs成熟后,部分行流式细胞仪检测,部分用于体外诱导CTL.以原代培养的肿瘤细胞和肺上皮细胞作为靶细胞,定量乳酸脱氢酶法测定杀伤率.结果:体外培养的DCs形态典型,高表达CD86、CD80、CD40、HLA-DR和CD83.转染肿瘤组织RNA DCs的CEA和MUC1表达量为(20.53±3.64)%和(65.39±9.33)%,明显高于转染肺组织RNA的DCs[(0.78±0.39)%和(18.32±4.24)%],P＜0.01.肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL可产生针对肿瘤细胞的特异性杀伤;且用自身肿瘤组织RNA转染DCs诱导的CTL对自身肿瘤细胞杀伤活性最大.结论: 以人肺癌总RNA体外转染DCs诱导CTL可以产生特异性抗肿瘤免疫,此方法构建肺癌疫苗是可行的.     

The role of dendritic cell precursors in tumour vasculogenesis

In this review, we discuss the recent identification in vivo of a population of CD11c+ cells exhibiting simultaneous expression of both endothelial and dendritic cell markers, termed vascular leukocytes (VLCs). VLCs are highly represented in human ovarian carcinomas and, depending on the milieu, can assemble into functional blood vessels or act as antigen-presenting cells. The identification of dendritic cell precursors as bipotent cells has important implications for the physiopathology and therapy of tumours. VLCs emerge as a novel therapeutic target against tumour vascularisation.     

自体热休克凋亡细胞负载树突状细胞治疗大肠癌的疗效观察

目的：探讨自体热休克凋亡细胞负载的树突状细胞（dendritic cells,DC）治疗大肠癌的临床疗效。方法：采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;对14例大肠癌患者进行4个疗程的DC免疫治疗,观察患者不良反应、敏感程度、生存质量、生存时间、癌胚抗原等临床指标。结果：DC治疗大肠癌未出现明显不良反应,5例患者的DTH检测阳性;14例患者的平均CEA水平由治疗前的99.5ng/ml降至治疗后的71.4ng/ml（P〈0.05）;治疗后血清中IL-2、IL-12及IFN-γ浓度均显著高于治疗前,具有统计学差异（P〈0.05）;所有患者均生存1年,其中1例患者出现了短暂的后腹膜淋巴结缩小,持续3个月,第2年由于肿瘤的进展生存率下降,由80%降至20%;患者的KPS评分上升,与治疗前比较有所改善（P〈0.05）。结论：自体热休克凋亡细胞负载的DC治疗大肠癌在临床治疗中具较高安全性,可改善患者免疫功能,临床观察显示患者近期临床效果明显;为大肠癌的临床综合治疗提供了一种新方法。     

自体热休克凋亡细胞负载树突状细胞治疗大肠癌的疗效观察

目的:探讨自体热休克凋亡细胞负载的树突状细胞(dendritic cells,DC)治疗大肠癌的临床疗效。方法:采用酶消化法从手术切除的14例大肠癌新鲜组织获得单细胞悬液,热休克处理后用桦脂酸诱导其凋亡制备成细胞抗原;采集外周静脉血,分离单个核细胞,经GM-CSF与IL-4体外诱导成未成熟树突状细胞,负载细胞抗原后制备成DC肿瘤疫苗;对14例大肠癌患者进行4个疗程的DC免疫治疗,观察患者不良反应、敏感程度、生存质量、生存时间、癌胚抗原等临床指标。结果:DC治疗大肠癌未出现明显不良反应,5例患者的DTH检测阳性;14例患者的平均CEA水平由治疗前的99.5ng/ml降至治疗后的71.4ng/ml(P<0.05);治疗后血清中IL-2、IL-12及IFN-γ浓度均显著高于治疗前,具有统计学差异(P<0.05);所有患者均生存1年,其中1例患者出现了短暂的后腹膜淋巴结缩小,持续3个月,第2年由于肿瘤的进展生存率下降,由80%降至20%;患者的KPS评分上升,与治疗前比较有所改善(P<0.05)。结论:自体热休克凋亡细胞负载的DC治疗大肠癌在临床治疗中具较高安全性,可改善患者免疫功能,临床观察显示患者近期临床效果明显;为大肠癌的临床综合治疗提供了一种新方法。     

黏蛋白1基因磁转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞抗膀胱肿瘤免疫效应的研究

目的：探讨黏蛋白1（mucins 1,MUC1）基因磁转染体外人树突状细胞（dendritic cell,DC）的可行性,观察其诱导的特异性抗MUC1膀胱癌CTL的免疫效应。方法：以葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）作为载体,在多聚赖氨酸（PLL）的辅助下,通过静电作用结合MUC1基因的真核表达载体pEGFP-C1-MUC1,在钕-铁-硼稀土强磁块的磁场作用下转染DC,荧光显微镜下观察及流式细胞术检测转染效率,并用RT-PCR法检测转基因DC中MUC1基因的表达;再将转染MUC1基因的DC与自体T细胞共培养,并分别用乳酸脱氢酶释放法检测所致敏的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）对MUC1特异性抗膀胱癌（膀胱肿瘤BIU87细胞系）的杀伤活性,用透射电镜观察CTL诱导靶细胞凋亡情况;ELISA法测定MUC1基因修饰后的DC刺激自体T细胞分泌IFN-γ的能力。结果：pEGFP-C1-MUC1转染效率为10%左右,荧光显微镜下可观察到明显绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法可检测到MUC1条带,转染MUC1基因的DC与自体T细胞混合培养后能诱导出MUC1特异性的CTL,对BIU87细胞的杀伤实验表明T-DC-MUC1的杀伤活性显著高于对照组T-DC-pEGFP-C1和T-DC诱导的CTL（P均〈0.05）;在透射电镜下也可观察到部分BIU87膀胱肿瘤细胞出现了细胞核核仁消失,染色质浓集于核膜周围等早期凋亡表现;基因修饰后的DC能刺激自体T细胞分泌高水平的IFN-γ,明显高于未转染的DC（P〈0.05）。结论：葡聚糖磁性纳米颗粒在固定磁场的作用下成功将MUC1基因转入DC,并可有效诱导出特异性抗MUC1膀胱癌的细胞毒性T细胞。