SiRNA抑制Wnt-1基因表达对肺腺癌脑转移的研究

目的 研究沉默Wnt-1基因表达,对A2细胞脑转移能力的影响.方法 siRNA转染A2细胞;将人血管内皮细胞贴附于Transwell膜上建立血脑屏障模型;检测沉默Wnt-1基因对A2细胞脑转移能力的影响.结果 转染siRNA后,A2细胞迁徙能力显著抑制.结论 抑制Wnt-1基因表达能够降低肺腺癌脑转移能力.     

人类醛糖还原酶类似蛋白1 siRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建人类醛糖还原酶类似蛋白1（ARL-1）siRNA幔病毒载体。方法设计针对于ARL-1Mma的siRNA,将siRNA连接于pENTRTM／U6载体,经测序确认后,通过免疫印迹和AI也-1酶活性鉴定验证ARL-1siRNA慢病毒载体的功能。结果ARL-1siRNA慢病毒载体能有效地沉默HCT8细胞内ARL-1的表达,降低HCT8细胞内ARL-1的酶活性。结论获得了能有效抑制细胞内ARL-1蛋白表达的ARL-1siR-NA慢病毒。     

斑马鱼模型在糖尿病研究中的应用

作为一种模式生物,斑马鱼具有其他动物模型所不具备的诸多优势,非常适用于进行人类疾病建模及机制研究。斑马鱼胰腺经历两次发育分化过程,其间伴有多种信号途径的活化参与。成鱼的胰腺结构与其他动物胰腺相似,能分泌包括胰岛素在内的多种激素。斑马鱼胰腺及对胰岛素敏感的肝脏、肌肉等这些与代谢调控相关的主要器官及外周组织,在进化上具有保守性,糖代谢调控机制也与其他哺乳动物相似,这使得斑马鱼非常适用于糖代谢调控研究。除利用STZ诱导胰岛β细胞凋亡造成斑马鱼糖尿病模型外,高糖溶液交替暴露及外源性干预代谢相关信号途径也可以造成斑马鱼血糖升高。成鱼血糖水平、幼鱼组织糖含量、视网膜及视网膜血管形态变化是目前斑马鱼糖尿病模型研究中的常用检测指标。     

Rac1小干扰RNA对胃肠道肿瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的 观察Rac1小干扰RNA(Rac1 siRNA)对胃肠道肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.方法 Rac1 siRNA 在lipofectamineTM 2000介导下转染胃癌SGC803细胞和结直肠癌Lovo细胞, 转染48 h后,采用半定量RT-PCR和Western blot技术分别检测Rac1 mRNA及蛋白的表达;Cell Counting Kit-8检测Rac1 siRNA转染细胞的增殖变化;损伤刮擦实验和体外侵袭实验(Transwell小室)分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力;用流式细胞仪检测转染细胞株的凋亡.结果 成功转染Rac1 siRNA的肿瘤细胞,RT-PCR及Western blot显示Rac1 mRNA和蛋白表达在相应的肿瘤细胞中都明显下降;Rac1 siRNA对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭均有显著的抑制作用并能促进肿瘤细胞的凋亡.结论 Rac1与胃肠道肿瘤细胞的恶性生物学行为密切相关.Rac1 siRNA能够部分逆转胃癌细胞SGC803和肠癌细胞Lovo的恶性生物学行为.     

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的: 观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法: 利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果: g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义（P > 0.05）;G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

沉默Wnt-1基因对人肺腺癌细胞株A2的影响

目的 抑制A2细胞中Wnt-1基因表达,探讨Wnt-1基因在A2细胞中的作用.方法 siRNA转染A2细胞,RT-PCR和West ern blotting测定Wnt-1基因表达的变化.结果 转染siRNA后,实验组(Wnt-1组)对应靶基因mRNA表达和蛋白表达均有明显降低.结论 Wnt-1特异性siRNA能有效干扰A2细胞内其相应基因的表达,细胞增殖能力下降.     

组蛋白去乙酰化酶1 siRNA对HeLa细胞生长和凋亡的影响

目的 研究组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases-1,HDAC-1)siRNA对宫颈癌HeLa细胞HDAC-1蛋白表达、细胞生长和凋亡的影响.方法 HDAC-1 siRNA沉默HDAC-1蛋白;Western blot技术检测HDAC-1蛋白;MTT法和克隆形成实验检测细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 HDAC-1 siRNA转染48 h可明显下调HeLa细胞HDAC-1蛋白表达;下调HDAC-1 表达明显降低HeLa细胞克隆形成率,抑制细胞增殖;下调HDAC-1诱导HeLa细胞凋亡.结论 HDAC-1 siRNA可能通过诱导凋亡抑制HeLa细胞生长.     

构建siRNA慢病毒载体调控人牙髓干细胞Delta1表达的实验研究

目的构建Notch配体Delta1基因慢病毒干扰载体及建立Delta1基因稳定干扰的人牙髓干细胞系。方法将Delta1基因特异性siRNA靶序列与双酶切慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,转化,挑取阳性克隆进行PCR鉴定;利用包装细胞293T获得重组的慢病毒,感染人牙髓干细胞,分为DPSCs/Delta1-RNAi组、DPSCs/vector组和DPSCs/wt组;RT-PCR和Western blot分别检测Delta1 mRNA及蛋白的表达。结果经PCR和DNA测序鉴定,成功构建Delta1特异性siRNA的慢病毒载体,并感染牙髓干细胞;经检测DPSCs/Delta1-RNAi组Delta1 mRNA及蛋白表达较DPSCs/vector组和DPSCs/wt组明显降低,DPSCs/vector组和DPSCs/wt组之间无明显差异。结论通过成功构建的Delta1特异性siRNA慢病毒载体对人牙髓干细胞的转染实现了对其Delta1 mRNA和蛋白的调控。     

hnRNP B1 siRNA对肺癌组织hnRNP B1表达干扰效果的体内研究

目的 在体内实验中观察所构建的核内不均一核糖核蛋白B1(hnRNP B1)特异性的siRNA真核细胞表达载体对肺癌组织hnRNP B1表达的干扰作用.方法 选取转染本课题组已构建并经体外实验证实有较好干扰效果的两对hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体(重组质粒A和B)的人肺腺癌细胞株A549,将其接种于BALB/C nu/nu裸鼠右前腋下,构建肺癌动物模型.分别应用RT-PCR和免疫组织化学的方法检测接种40、60 d时肿瘤组织中的hnRNP B1 mRNA和蛋白质表达水平.结果 hnRNP B1特异性的siRNA真核细胞表达载体在体内表达40 d时均能较稳定而明显地抑制肿瘤组织中hnRNP B1 mRNA的表达,免疫组织化学从蛋白表达方面也予以证实,而且重组质粒A和B两组间的表达的差异无统计学意义.但是随着时间的延长(接种60 d时),siRNA的干扰效果会逐渐减弱,与未转染A549细胞比较无明显差异.结论 hnRNP B1特异性的siRNA在体内可以稳定的表达,并且能特异、高效地抑制肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因的表达,有望成为肺癌基因治疗的合理策略之一.     

Synphilin-1 siRNA对6-OHDA诱导的帕金森病大鼠黑质神经保护作用的研究

目的:观察synphilin-1 siRNA对6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的帕金森病(PD)大鼠黑质多巴胺能神经元保护作用,从而探讨synphilin-1siRNA在帕金森病治疗中潜在的应用价值.方法:40只Wistar大鼠随机分成4组,假手术组、模型组、siRNA组、siRNA对照组,每组10只.模型组立体定向将6-OHDA注入左侧黑质制作PD模型,siRNA组、siRNA对照组立体定向将synphilin-1siRNA、阴性对照synphilin-1 siRNA分别注入到各组大鼠的左侧黑质,然后用与第一组相同的方法注入6-OHDA,假手术组注入生理盐水作为对照组,术后2周用阿朴吗啡(APO)(0.5 mg/kg)诱发旋转,进行大鼠行为学检测.术后4周取大鼠的术侧中脑黑质利用免疫组化检测synphilin-1,酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞(ir)的表达.结果:与假手术组比较,模型组synphilin-1-ir阳性细胞表达显著增加,而TH-ir阳性细胞显著减少;与模型组比较,siRNA组synphilin-1-ir阳性细胞表达显著减少,而TH-ir阳性细胞显著增加.结论:Synphilin-1在6-OHDA诱导的PD大鼠黑质神经元损伤机制中起一定作用,synphilin-1 siRNA具有神经保护作用,能为帕金森病的治疗提供新的思路和方法.     

EGF和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

目的构建能表达靶向EGF RmRNA和IGF-1 RmRNA的siRNA真核表达质粒。方法从GeneBank中搜索EGFR（NM 000875）和IGF-1 R（NM 201283）基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,并根据其序列构建真核表达质粒。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiPC。转染后分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h,以转染率高的时间点的鼻咽癌细胞做流式细胞仪检测转染率,并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达。结果质粒psiEGFR1、psiEGFR2、psiIGF-1 R1、psiIGF-1 R2和psiPC酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现：在转染48h达最高（55%～60%之间）;流式细胞仪检测转染后48h的转染率为57.45%,共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光。结论本实验构建了靶向EGFRmRNA和IGF-1 RmRNA、表达短发夹RNA（shRNA）的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞并在其中表达,能下调鼻咽癌细胞EGFR和IGF-1 R的表达。     

RNA干扰沉默Bmi-1基因观察胶质瘤细胞凋亡状况的初步研究

目的:初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞凋亡状况的影响?方法:采用siRNA技术干扰沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR法检测干扰效果,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡状况, one way ANOVA 和t检验进行统计学分析?结果:RT-PCR显示U251细胞RNA干扰组Bmi-1 mRNA凝胶电泳条带呈弱阳性, 阴性对照组和未处理组Bmi-1 mRNA条带呈强阳性,灰度比统计分析,差异具有统计学意义,siRNA可以明显降低U251细胞中Bmi-1基因的表达;流式细胞仪显示干扰组U251细胞的凋亡率为(32.53±6.33)%,高于阴性对照组的凋亡率(21.91±5.63)%,统计分析其差异具有统计学意义?结论:Bmi-1基因可以抑制胶质瘤细胞的凋亡,有可能促进了胶质细胞瘤的发生?发展?     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

干扰RNA片段对过氧化物酶体增殖物激活受体γ及内皮素-1基因表达的影响

目的:研究干扰RNA片段对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达的影响,了解PPARγ基因表达量发生变化的时候,内皮素-1(ET-1)的基因表达量有无变化,以探讨PPARγ及ET-1基因在动脉粥样硬化致病机制中的作用。方法:采用siRNA Expression Cassette方法干预体外培养的人正常脐静脉内皮细胞,通过RT-PCR、适时定量PCR(quantitative real-time PCR)及Western blot法检测PPARγ及ET-1的mRNA、蛋白质表达水平。结果:针对PPARγ基因设计的siRNA Expression Cassette 1(1 326)使PPARγmRNA及蛋白表达量下调,ET-1 mRNA表达量增多,二者之间表达量的mRNA灰度比值变化有相关性(r=0.995,P=0.042)。siRNAExpression Cassette 2,3,4片断未能发挥干扰效应。结论:干扰RNA片段siRNA Expression Cassette 1(1 326)对PPARγ的基因表达有抑制作用,可以在转录水平抑制PPARγ在人脐静脉内皮细胞的基因表达,同时使ET-1基因表达上调。     

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）沉默MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用siPORT-脂质体（1ipid）中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链siRNA人胰腺癌BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测MAT1基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条MAT1-siRNA序列中有一半可显著抑制BxPC3细胞的生长。体外转染MAT1-siRNA72h后,BxPC3细胞生长抑制率达34．9％（P〈0．01）;83．9％的BxPC3细胞滞留于G。／G,期,而空白对照组仅59．86％（P〈0．01）。体外转染MAT1-siRNA48h后MAT1-mRNA水平下调了80．12％,72h后MAT1蛋白质水平下调了50．12％,与各对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．01）。MAT1-siRNA注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组（均P〈0．05）,抑瘤率达42．53％。结论siRNA介导的MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。     

益母草碱对阿霉素致斑马鱼心脏毒性保护作用的初步研究

目的观察不同浓度的盐酸益母草碱对阿霉素所致斑马鱼胚胎心脏毒性的保护作用。方法应用发育正常受精后48h的斑马鱼胚胎作为实验模型,用盐酸益母草碱＋阿霉素（浓度为0＋30mg／L,30mg／L＋30mg／L,60mg／L＋30mg／L,120mg／L＋30mg/L）处理上述胚胎,分别于受精后60h、72h和96h时观察胚胎心脏的形态及心率的变化。结果各给药组以及对照组在给药后均出现心率减慢、心脏区域出血的胚胎心脏中毒现象。但益母草碱联合用药组的心脏毒性作用较小,且随着盐酸益母草碱浓度的升高,阿霉素的心脏毒性作用明显减小。结论阿霉素对斑马鱼胚胎具有心脏毒性作用．而盐酸益母草碱对阿霉素所致心脏毒性具有保护作用。     

发夹式siRNA对hDNMT1基因表达的抑制作用

目的研究发夹式siRNA对hDNMT1基因表达的抑制作用.方法根据hDNMT1全长cDNA序列设计和合成与其互补的发夹式siRNA序列,并以发夹式siRNA序列为模板经体外合成siRNA表达盒(SECs).SECs通过脂质体载体转染结直肠癌细胞株HCT116后,经半定量RT-PCR 法检测hDNMT1 mRNA的表达水平. 结果发夹式siRNA 可以特异性地抑制hDNMT1 基因.结论通过SECs产生的发夹式siRNAs 可以特异性抑制hDNMT1 基因的表达;本研究为通过构建表达发夹式siRNA载体抑制hDNMT1基因表达的研究奠定了基础.     

水仙醇提物对斑马鱼胚胎黑色素合成的抑制作用

目的 以斑马鱼为模型,重点研究水仙鳞茎的醇提物对斑马鱼黑色素合成的抑制效应。方法 将斑马鱼胚胎暴露在0、50、100、200、500 μg/mL不同浓度的水仙花醇提物中,观察其黑色素生成情况,并进一步测定体内黑色素合成通路关键蛋白酪氨酸酶的酶活性变化和其他标记基因的时空表达,同时以200 μg/mL的熊果苷（arbutin,Ar）处理组为阳性对照。结果 定性观察表明,随着水仙提取物处理浓度的增加,对斑马鱼黑色素合成的抑制明显增强;进一步检测黑色素合成相关基因的时空表达,证明了水仙醇提物通过抑制酪氨酸酶（TYR）、银色毛发（SILV）和Mitfa等基因的mRNA表达而抑制黑色素合成;最后,通过检测酪氨酸酶的酶活性,发现随着醇提物浓度的增加导致酶活性逐渐降低。结论 水仙醇提物能有效地抑制斑马鱼胚胎黑色素的生成,同时该研究也为斑马鱼模型在天然美白化合物筛选和产品开发的应用提供了研究基础和思路。