RHD基因第7内含子全长序列分析

目的 通过对"亚洲型"DEL基因第7内含子全长序列测序分析,探讨其Mrna含有来自第7内含子170 bp片段的分子机制.方法 根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank BN000065的RHD基因序列,设计4对特异性寡核苷酸引物,分四段分别扩增RHD基因第7内含子.测序分析1名正常Rh阳性个体和2名RhDel表型个体(携带RHD1227A等位基因)的RHD第7内含子全长序列,然后通过NCBI Basic BLAST与参考序列(GenBank BN000065)进行比对,并作相互比对.结果 发现3名个体第7内含子共观察到33处碱基变异(GenBank EU372940～2),其中8处变异相同;另有2处碱基变异仅在DEL样本中检出,在正常Rh阳性个体中未发现.结论 这些变异不足以解释以往发现的DEL Mrna存在170 bp来自第7内含子序列而正常D阳性个体却不存在的现象,但测序结果 提示该片段二侧的AG-GT可能参与这一分子事件的形成,因其正好与第7内含子二侧的GT-AG拼接位点协同将内含子一分为二,但具体机制可能十分复杂.     

浙江汉族Rh DEL表型的分子机理研究

为了研究浙江汉族Rh DEL表型的分子机理，用吸收放散的血清学方法鉴定Rh DEL表型，然后用RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性（PCR—SSP，polymerase chain reaction-sequence specific prime）和序列分析方法鉴定DEL表型RHD基因的10个外显子和外显子-内含子连接区域可能的变异。结果表明：在122例浙江汉族Rh阴性血型中共检测到35例DEL表型个体，其中RhCCdee、RhCcdee和RhCcdEe表型分别有6例（17．14％）、28例（80．00％）和1例（2．86％）。序列分析发现，Rh DEL表型个体的第9外显子都有1227G〉A突变。D杂合性试验发现，有29例（RhCcdee，28例；RhCcdEe，1例）存在RHD基因的缺失，有6例（RhCCdee）不存在RHD基因的缺失。结论：RHD1227A是浙江汉族RhDEL表型个体的重要遗传标记。     

DEL红细胞膜D抗原表位分析

目的分析Rh血型D放散型(DEL)红细胞膜D抗原表位(epitopemapping)。方法采用微量吸收放散技术通过9种抗D抗原不同表位的人抗D单克隆抗体,检测3名已知Rh表型和RH基因型的D放散型个体的红细胞膜D抗原表位,分别以Rh阳性、Rh阴性、部分D表型DVa(Hus)和DVIⅢ型样本作为对照。结果3名携带RHD1227A等位基因的D放散型个体,红细胞膜D抗原9个抗原表位均检测为阳性,而对照样本检测结果各不相同。结论携带RHD1227A等位基因的中国汉族D放散型个体红细胞膜可能表达基本完整D抗原。     

汉族DEL型孕妇可免去抗-D产前检查

目的鉴于占我国汉族Rh(D)阴性人群约25%的DEL型红细胞具有基本完整的D抗原表位,临床观察汉族DEL型孕妇妊娠Rh(D)阳性胎儿是否产生同种免疫反应。方法跟踪观察和测定207名有妊娠史的Rh(D)阴性孕妇产前和产后血清抗-D,根据RhCcEe表型和PCR检测RHD1227A等位基因鉴别DEL型和真实Rh(D)阴性表型。结果 207名Rh(D)阴性孕妇中,DEL型个体46名(22.2%)均未检测到血清抗-D,即使5名个体有2次或以上生育史,亦未见同种免疫反应。161名真实Rh(D)阴性个体中检出40例抗-D阳性(24.8%);80名有生育史的真实Rh(D)阴性孕妇中30例抗-D阳性(37.5%);20名有2次或以上生育史的真实Rh(D)阴性孕妇中12例存在抗-D(60.0%)。结论 DEL型孕妇妊娠Rh(D)阳性胎儿发生抗-D同种免疫反应的可能很小,我国Rh(D)汉族阴性孕妇中的DEL个体可免去定期的产前抗-D检测,以及免去预防性Rh免疫球蛋白的使用。     

汉族和维吾尔族D_(el)型基因型及其常见等位基因差异的研究

目的比较中国汉族和维吾尔族(维族)人群D_(el)型基因结构和遗传特点,了解二者D_(el)型常见突变类型及其基因组合情况。方法采用微柱凝胶法检测随机非血缘关系的中国222名汉族人和55名维族人的Rh D血型,Rh D(-)者用改良间接抗球蛋白试验(IAT)确认;单克隆抗体鉴定Rh表型;吸收放散微柱凝胶法检测D_(el)型;PCRSSP方法检测RHD上游、下游和杂合Rhesus盒;PCR扩增RHD第9外显子,测序验证;PCR-SSP检测RHD基因1227位点,测序验证。结果 222例随机非血缘关系汉族血清学Rh D(-)标本和55例随机非血缘关系维族血清学Rh D(-)标本分别检出43例和1例D_(el)型;汉族Rh D(-)标本中,RHD基因型为RHD-/RHD-和RHD+/RHD-、RHD+/RHD+者的比例分别为70.72%(157/222)和27.03%(60/222)、2.25%(5/222);维族Rh D(-)标本中,只有1例RHD基因型为RHD+/RHD+,其余98.18%(1/54)标本为RHD-/RHD-;汉族和维族Rh D(-)个体RHD基因型总体分布存在差异(P0.05);汉族和维族Rh D(-)个体的RHD-/RHD-基因型呈明显差异(P0.05);43例随机非血缘关系的汉族D_(el)型标本RHD基因1227位点检测:1例1227G、3例1227G/A和39例1227A,结合Rhesus box检测结果,基因组合情况分别为RHD1227G/-、RHD1227G/A、RHD1227A/-和RHD1227A/A。1例维族D_(el)型标本等位基因组合为RHD1227A/A。所有RHD-/RHD-纯合子样本均未检测到RHD基因1227位点。吸收放散试验为D_(el)型者93.02%(40/43)、等位基因为RHD1227A或A/G个体均携带C抗原。结论中国汉族和维族D_(el)型人群RHD基因型绝大部分是RHD+/RHD-杂合子,都存在RHD;中国汉族和维族D_(el)型等位基因以RHD1227A为主,且与C抗原相关联。     

发现1个新的无效RHD等位基因

目的鉴定1个疑似新的无效RHD等位基因。方法采用常规血清学方法检测1名孕妇的Rh血型抗原,间接抗球蛋白试验确认RhD抗原阴性,并用吸收放散试验排除D放散型(Del);先后分别采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析该名个体的RHD基因。结果血清学试验为Rh-dCcEe,吸收放散试验阴性;基因型检测为杂合型RHD+/RHD-;商品化试剂盒和SSP-PCR结果都显示该个体携带的RHD阳性基因与正常Rh阳性表型的基因一致。对该标本编码区全长序列分析结果显示:第1外显子的第78位核苷酸缺失1个碱基"C",至第112位氨基酸时形成终止密码子。结论经GenBank检索发现该例为1个新的无效RHD等位基因,并完成注册RHD78delC(GenBank GQ477180)。     

1例新的弱D型的鉴定

目的分析1例新的Rh血型弱D型个体的RHD等位基因及其红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,并分析D抗原表位;序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,然后分析RHD编码区全长序列,并检测RHD杂合型。结果血清学显示该个例为D抗原弱表现型,Rh因子为D+C+c+E-e+,PCR-SSP检测RHD基因显示与正常Rh(D)阳性对照相同。RHD编码区序列分析发现第9外显子存在1 212C>A碱基突变,其余外显子序列则与正常RHD基因一致(GenBank EF103573),RHD合子型鉴定为RHD+/RHD-杂合型,提示该个体基因型为CDe/cde。红细胞D抗原表位分析显示其具有基本完整D抗原表位。结论该个例为RHD1 212C>A碱基突变形成弱D72型。     

浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立

为了快速鉴定DEL表型，建立浙江汉族DEL表型的基因分型方法，根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性．聚合酶链反应（allele specific-polymerase chain reaction，AS-PCR），用于DEL表型的基因分型。用已知RHD1227A多态性的样本和已知DEL表型的样本评价基因分型方法的灵敏度和特异性。结果表明：在50例RHD1227A阳性和50例RHD1227A阴性的Rh阴性样本中基因分型方法的灵敏度和特异性都是100％；在33例DEL阳性样本和89例DEL阴性的样本中，基因分型方法的灵敏度为100％，有2例样本血清学结果为阴性而基因分型结果为阳性，重新用血清学方法和序列分析方法复核这2例样本，发现2例都是血清学漏检，因而基因分型方法的特异性是100％。结论：设计的基因分型方法可以有效地鉴定浙江汉族Rh阴性人群中的DEE表型。     

替代剪切形成多种形式的RhD mRNA

目的　探讨RHD基因转录后是否存在因替代拼接形成不同形式的mRNA。方法　采用逆转录PCR(RT PCR)技术检测 4名不同Rh表型 (CcDDEe、CCDDee、CcDDee和ccDdee)个体的RhDmRNA ,然后进行cDNA测序分析。结果　不同Rh表型的个体有相同的和复杂的RhDmRNA形式 ,均存在正常形式的RhDmRNA ,以及缺失第 7、第 9、第7和 9、第 7～ 9外显子共 5种形式的RHD转录子 ,这些缺失外显子的转录子的其余序列与正常RhDmRNA完全一致 ,显示 RHD 基因转录后存在替代剪切机制 ,且发生在第 7 8 9外显子或内含子区域。结论　 RHD 基因因为替代剪切第 7、8、9外显子形成复杂的、不同外显子组合的基因转录子 ,因此可能翻译成氨基酸C 端互不相同的多种形式的蛋白质。     

遵义地区献血人群RH基因特征的研究

目的研究遵义地区献血人群RHD基因多态性的特征。方法采用PCR-SSP技术对随机非血缘关系RhD阳性标本150例,RhD阴性标本186例和Del标本39例的RHD基因的启动子区、3～7,9,和10外显子及4内含子、Ψ假基因、第9外显子1227GA突变点进行研究。结果 RHD+/RHD+,RHD+/RHD-基因序列的标本可以测出启动子区3个多态性位点;60%RhD阴性个体完全缺乏4内含子和RHD3～7,9和10外显子,25%Rh阴性个体均检测到第4内含子和3～7,9和10外显子,15%Rh阴性个体至少缺失一个外显子,RhD阴性个体存在D(nf)Ce(无效基因);第4外显子者均有第4内含子;所有标本均未检测出RHDΨ;33/39例Del标本可以检测到1227GA突变点。结论遵义献血人群RHD基因相关结构特征符合中国人群汉族人群RHD基因相关结构特征。     

Sequencing analysis of RHD intron 7 and 9

Whole length of RHD introns 7 and 9 of one normal Rh D-positive individual and 2 DEL samples, carrying RHD1227A allele, were sequenced and aligned. Thirty-three and 27 nucleotide variants were totally observed in intron 7 and intron 9, respectively (EMBL/GenBank/DDBJ EU3729402). Among them, 8 variants in intron 7 and 7 in intron 9 were observed commonly in all 3 samples, whereas 2 variants in intron 7 and one in intron 9 were only found in 2 DEL samples, but not in the normal D-positive. The variants observed in intron 7 in DEL cannot explain enough for that DEL mRNA has one segment of 170 base pairs sequence from intron 7. But the nucleotides AG–GT at both sides of the segment may be related to this molecular even as AG–GT may cut intron 7 with its normal splicing site (GT–AG) into two “new introns” although the mechanisms are complicated in fact. We also have not found any suspicious splicing-affecting variants in intron 9 of DEL allele. However, this may make out further that the reason of whole exon 9 spliced out in DEL mRNAs may be no more than the 1227A>G mutation in DEL allele.     

RHD alleles in Brazilian blood donors with weak D or D-negative phenotypes

The RHD gene is highly polymorphic and the existence of a large number of alleles results in RhD variant phenotypes. RHD genotyping has been used to distinguish normal D antigen from D variants due to limitations of serologic methods. The purpose of this study was to determine the phenotypic frequency of RhD and RhCE antigens and to investigate the RHD alleles present in samples with the weak D or D- phenotypes from Brazilian blood donors. A total of 2007 donors were phenotyped for D, C, c, E and e antigens. Samples phenotyped as D- were genotyped by polymerase chain reaction-sequence specific primers, and exon 10 and intron 4 of the RHD gene were analysed. D- samples containing the RHD gene or samples considered weak D were further characterised using genotyping platform or nucleotide sequencing. Using serologic methods we found that 87.3% of the donors were D+, 11.9% D- and 0.8% weak D. The frequency of RHD gene in D- individuals was 9.2%. Five RHD alleles from phenotypically D- donors were characterised in six molecular backgrounds: RHDΨ, RHD-CE-D(s), RHD-CE-(2-9)-D, RHD/RHDΨ, RHDΨ/RHD-CE-D(s) and RHD-CE(2)-D. The most common weak D antigens types found were 1, 3, 4.0/4.1 and 4.2, whereas the most prevalent weak D type was 4.2 (or DAR). The RHD genotyping proved to be a necessary tool to characterise RHD alleles in donors phenotyped as D- or weak D to increase the transfusion safety in highly racial mixed population.     

四川地区汉族人群Rh(D)变异体分子机制研究

目的了解四川汉族人群中Rh血型系统中D变异体的分布特点和分子机制。方法采用血型血清学方法对102份四川汉族献血者,61份本实验室临床标本做C、c、E、e表型鉴定,并用间接抗球蛋白试验从非亲缘随机献血者中筛选弱表达的D变异体(包括弱D和部分D),用吸收放散试验检测Del型。同时采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法对RHD等位基因进行分型,对Rh(D)变异体标本进行杂合性鉴定,并采用测序法对疑难标本进行测序分析。结果血清学试验检出D抗原变异型52例,经分子生物学方法检测分析,弱D15RHD(G282D)型4例,弱D12RHD(G277E)型1例,弱DRHD(L320L)1例(型别未定),弱DRHD(G263R)1例(型别未定),部分DDVItypeⅢ型2例,DELRHD(K409K)型41例,DELRHD(M1I)型1例,此外发现新等位基因RHD(A237D)1例(基因序列号:GU998825)。RHD杂合性检测结果显示1例弱D15和9例DELRHD(K409K)型标本为RHD+/RHD+纯合子,其他均为RHD+/RHD-杂合型。结论四川地区汉族人群Rh(D)变异体有丰富的类型和不同分子机制.     

一种新的RHD等位基因的分析鉴定

目的分析新RHD等位基因的基因结构。方法采用聚合酶链式反应(PCR)技术、序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术以及DNA序列分析技术,分析1例RhD阴性个体的RHD基因。结果序列特异性引物PCR(PCR-SSP)检测个例RHD基因的第3～7、9～10外显子,结果显示所检测的外显子均为阴性;检测RHD基因第2内含子(Din2)和Rh下游盒子区Box3,结果显示,Din2为阴性,Box3为阳性;检测RHCE基因,结果显示基因型为Ccee。应用3个PCR反应检测个例RHD基因的第10内含子(Din10),结果显示为阴性。个例的RHD基因编码区全长序列分析结果显示其第1、2外显子序列与正常RHD基因一致,其余外显子缺失。结论综合分析实验结果,个例为RHD抗原阴性,RHD基因阳性的个体,携带新的RHD-CE(2-10)融合等位基因。     

An easy RHD genotyping strategy for D- East Asian persons applied to Korean blood donors

BACKGROUND: In East Asian populations RHD alleles are known to occur frequently among D- donors, requiring suitable genotyping strategies. The molecular basis of the "RHD(el)" allele previously reported in Taiwan to harbor a genomic 1013-bp deletion was questioned by several authors. STUDY DESIGN AND METHODS: The presence of the RHD gene was investigated in 126 random serologic D- blood donors from Gwangju, southwest Korea. Four donors who typed weakly positive for the D antigen were also analyzed. RH alleles were determined by polymerase chain reaction (PCR) with sequence-specific priming (PCR-SSP) or nucleotide sequencing. RESULTS: Seventy-five percent of the serologically D- samples lacked the RHD gene, 10 percent carried the hybrid RHD-CE(2-9)-D2 or RHD-CE(2-7)-D2 alleles, 13 percent represented the RHD(K409K), and 2 percent were weak D type 15 and type 17. Among the four donors typing weak D, two carried weak D type 15, one RHD(K409K), and one the novel weak D type 43. Critical molecular characteristics of RHD(K409K) and its population frequencies were indistinguishable to those reported for the RHDel allele. CONCLUSION: Korean RHD allele frequencies are comparable to Chinese and Japanese frequencies. It is concluded that the RHDel allele may actually not exist but is identical to RHD(K409K). A practical RHD genotyping strategy applicable to D- donors in all East Asian populations was devised. The strategy requires four PCR-SSP procedures only for RHD intron 4 and exon 7 as well as RHD(K409K) and non-RHD(K409K).     

中国人群RhD阴性个体中D基因多态性的研究

目的 建立RHD基因分型技术，分析中国人群RhD阴性个体的RHD基因多态性分布状况。方法 设计8对特异性引物扩增RHD7个外显子(3，4，5，6，7，9，10)和内含子4，应用PCR—SSP技术，对l15例经常规血清学试验和吸收放散试验鉴定的“Rh阴性个体”，进行D基因多态性的研究。结果 l15例RhD阴性个体，用吸收放散试验检测后分成2组，一组被确认为RhD阴性表现型共88例(76．5％)，另一组是Del(放散)表现型共27例(23．5％)。应用PCR—SSP法对l15例RhD阴性个体作RHD内含于4检查，结果Del型个体都显示有RHD内含于4；对l15例中的17例进一步作RHD的7个外显子的鉴定，其中6例Del带有完整的RHD基因，ll例经吸收放散试验确认为RhD阴性表现型的个体则显示4种情况：7例全部缺失RHD基因，2例(1例ccEe和1例Ccee)带有完整的RHD基巴，1例缺失RHD的第5外显子和1例仅携带第10外显子。结论 PCR—SSP技术可用于RHD基因的研究。常规血清学鉴定的RhD阴性中存在较高比例的Del型，且有可能带有完整的RHD基因。而被吸收放散试验确认为RhD的阴性个体有可能携带RHD基因并显示出多态性，这些个体中有Rhc抗原表达，有别于献中认为全局RhC抗原表达的报告。     

Anti-D immunization by DEL red blood cells

BACKGROUND: No data are available on the immunogenicity of extremely weak D variants called DEL. Evaluation of alloanti-D formation in a D- female patient after transfusion of apparently D- blood from an Austrian donor led to discovery of a so far unknown DEL type. STUDY DESIGN AND METHODS: Standard blood group serologic methods were applied. Molecular typing, RHD sequencing, and D epitope mapping was performed and the absolute D antigen density determined. RESULTS: After transfusion of RBCs typed D- by routine serology, the recipient developed alloanti-D. Further evaluation with an indirect antiglobulin test confirmed donor RBCs to be D-. Molecular typing, however, demonstrated the presence of the RHD gene in one donor, and RHD sequencing revealed a deletion of four nucleotides in RHD intron 5 (RHD IVS5-38del4) as the only difference compared to the normal RHD gene. Adsorption-elution techniques demonstrated a DEL phenotype without apparent loss of D epitopes. CONCLUSION: This study documents the clinical significance of the DEL phenotype in blood units that was capable of inducing anti-D in a recipient. Qualitative data are provided on D epitope expression in DEL RBCs.