一步法RT-PCR从临床样本中检测到鼻病毒基因

目的建立一步法RT-PCR检测临床样本鼻病毒基因,并对扩增产物进行测序分析。方法在鼻病毒基因组5’端非编码区选择一对鼻病毒特异性兼并引物建立一步法RT-PCR系统。对2004年春季收集的78份急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子样本进行鼻病毒基因筛测,对扩增阳性的样本进行核苷酸测序并用生物信息学软件分析。结果78份鼻咽拭子样本用一步法RT-PCR检测出鼻病毒基因阳性11份,阳性率为14．1％,其中包括临床诊断为上呼吸道感染7例、支气管炎3例、肺炎1例。11份鼻病毒阳性样本用测序引物扩增并测序,测得的核苷酸序列经blast比对,与GeneBank中鼻病毒序列同源性分别高达89．0％～95．5％;11份样本序列之间的核苷酸同源性为75．2％～91．8％,核苷酸水平变异率为8．8％～31．0％;11份样本序列在进化树中聚类为两簇;11份样本序列高度保守区基因突变多为固定位点的单个核苷酸变异。结论所建立的一步法RT-PCR系统检测鼻病毒基因有快速、简便、特异性高的优点,适用于临床检测。临床样本测序分析发现,鼻病毒基因组有高度变异的特点。     

2006-2007年苏州地区儿童呼吸道人类偏肺病毒感染的流行和临床特征

目的 了解苏州地区儿童人类偏肺病毒(hMPV)呼吸道感染的流行情况及临床特征.方法 收集2006年1月-2007年12月我院呼吸科4702例急性呼吸道感染住院患儿的呼吸道分泌物,用逆转录-聚合酶链反应法检测hMPV N基因,随机挑选部分阳性PCR扩增产物进行核苷酸测定并将所测序列在GenBank中进行比较分析.结果 4702例标本中,检测到376份RT-PCR阳性扩增产物,阳性率为8%;2006,2007年hMPV检测阳性率分别为8.4%、7.6%.hMPV检测阳性率分别在1、2、3月和11、12月呈现高峰,hMPV感染患儿的平均年龄为22.56个月,376例hMPV感染患儿中临床诊断为上呼吸道感染12例(3.2%);喉炎8例(2.1%);毛细支气管炎102例(27.1%);肺炎210例(55.9%);哮喘急性发作44例(11.7%).20份hMPV N基因部分核苷酸片断与GenBank中hMPVN基因序列同源性为99%～100%.结论 (1)苏州地区部分儿童的呼吸道感染与hMPV有关.(2)全年均存在hMPV感染,流行高峰在冬春季.(3)hMPV感染的临床特征无特异性.     

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目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测呼吸道标本人偏肺病毒(HMPV)方法;探讨HMPV感染现状及其临床特征。方法自行设计引物,建立检测HMPV荧光定量PCR的方法并与直接免疫荧光检测法(DFA)比较,对2009年12月至2010年3月浙江大学附属儿童医院623例下呼吸道感染患儿的临床标本进行检测与分析。结果 (1)建立的RT-PCR以HMPV为模板获得阳性结果,对其他常见呼吸道病毒均阴性;(2)623例样本中DFA检出HMPV感染10例,检出率1.61%,RT-PCR检出HMPV感染28例,检出率4.49%;(χ2=16.05,P<0.01);(3)DFA阳性者10份RT-PCR均阳性,595份两者均阴性,18份标本DFA阴性RT-PCR呈阳性,显示很好的相关性(r=0.59,P<0.01);(4)哮喘患儿中HMPV检出率为15.4%(4/26),显著高于肺炎组(20/515,3.9%)及气管支气管炎组(0/36,0%),差异有统计意义(χ2=11.22,P=0.011);(5)HMPV检出率与年龄有关,0～1岁阳性率2.2%(9/404),>1～3岁组13.1%(16/122),>3～6岁组3.4%(2/58),>6岁组2.6%(1/39),其中>1～3岁年龄组患儿HMPV检出率明显高于其他组(χ2=26.44,P=0.000)。结论选择HMPVN基因保守区域设计了一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HMPV荧光定量RT-PCR方法;荧光定量RT-PCR检测HMPV敏感性明显高于直接免疫荧光法;哮喘患儿中HMPV检出率明显高于肺炎患儿;HMPV感染以>1～3岁幼儿发生率最高。     

从北京地区急性呼吸道感染患儿的标本中分离到人偏肺病毒

目的 从北京患急性呼吸道感染患儿的临床标本中分离人偏肺病毒(HMPV),推动对该病毒的深入研究.方法 2008年5月至2009年4月收集门诊和病房因急性呼吸道感染患儿的标本,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测核酸和直接免疫荧光法检测抗原筛选到HMPV阳性标本后接种传代的恒河猴肾细胞(LLC-MK2),经37 ℃和33 ℃孵育后用直接免疫荧光法检测细胞内的HMPV抗原,得到阳性结果后经RT-PCR进一步确定基因型.结果 从1092例病房和门诊收集的急性呼吸道患儿标本中用RT-PCR技术检测到81例为HMPV阳性,总阳性率为7.4%(81/1092).取其中33例接种到LLC-MK2细胞进行HMPV分离,有5份标本的接种细胞中可检测到HMPV抗原,并经RT-PCR检测进一步证实,分离株与常见的呼吸道病毒抗体无交叉反应.24 h内新鲜接种的标本更易分离到病毒.分离到的毒株有4株为A基因型,1株为B基因型.结论 从北京急性呼吸道感染患儿的标本中分离到两种基因型的HMPV,将进一步推动对该病毒的研究.     

从北京地区急性呼吸道感染患儿标本中检测到新型冠状病毒NL63基因

目的了解北京地区婴幼儿急性呼吸道感染是否与一种新发现的冠状病毒——HCoV-NL63相关。方法选取2003年12月—2004年3月,从首都儿科研究所附属儿童医院收集的245份因急性呼吸道感染就诊的门诊患儿的咽拭子标本以及住院患儿的鼻咽洗液标本,进行HCoV-NL63的筛查。这些标本已经过间接免疫荧光法和病毒分离检测,常见的七种呼吸道病毒（包括RSV,甲、乙型流感病毒,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型副流感病毒和腺病毒）检测均为阴性;同时还经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测人偏肺病毒（hMPV）也为阴性。首先用位于HCoV—NL631b基因的两对引物用巢式PCR方法进行筛查,阳性者再用位于HCoV-NL63 1a基因的两对引物扩增进行复核。对用HCoV—NL63 1a基因扩增的长片段产物进行测序并与GenBank中相关序列进行比较分析。结果用HCoV-NL63 1b基因的引物经巢式PCR方法从245份标本中检测到3份阳性标本,阳性率为1．2％。3份阳性标本用HCoV-NL63 1a基因的两对引物经巢式PCR方法进行复核均得到阳性结果,这3份标本均取自住院患儿,患儿年龄分别为4个月、1岁和1岁5个月,临床诊断分别为毛细支气管炎、喉炎和支气管炎,男女比例为2：1。对其中基因扩增产量较高的BJ3140和BJ3787的1a基因长片段扩增产物（838bp）进行序列测定和分析的结果显示,这两株HCoV-NL63与GenBank公布的不同地区的HCoV—NL63的1a基因序列同源性最高,达到98％～99％。基于部分1a基因序列的系统进化分析显示,BJ3140和BJ3787属于HCoV-NL63的第一簇（group 1）。结论结果提示北京地区部分婴幼儿的急性呼吸道感染与HCoV-NL63相关。     

保定地区儿童偏肺病毒感染的研究

目的了解保定地区婴幼儿呼吸道感染与人类偏肺病毒的关系。方法采用RT—PCR方法，对收集的547例呼吸道感染常见病原体检测阴性的标本，进行偏肺病毒（hMPV）基因检测。抽取10份阳性扩增产物进行测序和比较。结果315份标本中共检测到82份阳性扩增产物，阳性率为26．0％。占总检测例数的15．0％。结论保定地区部分患儿的急性呼吸道感染与hMPV有关。     

2006—2008年苏州地区儿童呼吸道人偏肺病毒感染的流行和临床特征

目的了解人类偏肺病毒(hMPV)在苏州地区小儿呼吸系统感染中的感染情况,分析其流行病学特点;探讨hMPV感染后的临床特征。方法选取2006年1月—2008年12月苏州大学附属儿童医院6 395例急性呼吸道感染住院患儿,总结临床特征;用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测痰液中hMPV N基因,随机挑选部分阳性PCR扩增产物进行核苷酸测定,并将所测序列在GenBank中进行比较分析。结果 6 395例标本中,检测到589份RT-PCR阳性扩增产物,检出率为9.2%,其中2006年度hMPV检出率为8.4%,2007年为7.6%,2008年为12.6%。hMPV在3年的每个月份都有检出,但在2006年12月、2007年1月和2008年5月呈现年度高峰,分别为24.2%、21.6%、31.9%。589例hMPV感染患儿的平均年龄为22.21个月;临床诊断上呼吸道感染3.6%,喉炎2.0%,毛细支气管炎20.2%,肺炎61.8%,哮喘急性发作12.4%。主要临床表现为咳嗽,鼻塞流涕,发热,呼吸困难,哺喂困难,喘息。20份hMPV N基因部分核苷酸片断与GenBank中hMPV N基因序列同源性为99%～100%。结论苏州地区部分儿童的呼吸道感染与hMPV有关。全年均存在hMPV感染,流行高峰在冬春季,连续3年的检出率有较大差异。hMPV感染的临床特征无特异性。     

东莞市镇区小儿呼吸道人类偏肺病毒感染临床与分子流行病学特征

目的 了解东莞市镇区小儿呼吸道人类偏肺病毒(hMPV)感染的临床与分子流行病学特征.方法 收集2007年2-10月东莞市石碣医院儿科门诊及病房7岁以下呼吸道感染患儿呼吸道分泌物标本340例,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hMPV F基因,应用多霞PCR检测呼吸道合胞病毒A、B型(RSV A、B型).流感病毒甲、乙型(Flu-A、B型),副流感病毒l、2、3型(PIV1、2、3型).并随机挑选4例hMPV阳性者PeR产物行基因测序分析.结果 340份标本中hMPV阳性者32份(9.41%),其中在阳性标本中5例并RSV感染,2例并PIV 3型、2例并Flu-B型.2-4月份检出阳性率高于5-10月份.32例hMPV感染阳性患儿平均年龄5.97个月,临床表现以发热、咳嗽、喘息为主,hMPV感染患儿临床表现与其他常见呼吸道病毒感染者无显著性差异(P>0.05).32例hMPV阳性患儿诊断下呼吸道感染30例,占阳性标本的93.75%,急性上呼吸道感染2例(6.25%).4例PCR产物基因测序分析与GenBank序列同源性87%～99%.hMPV PCR产物基因序列进化数分析显示其属于2个不同的基因型,其中A基因型3例,B基因型1例.结论 hMPV是小儿呼吸道感染一种重要的病原体,小儿呼吸道hMPV感染发病率在2-4月份较高,其临床表现以咳嗽、发热、喘息为主.东莞地区小儿呼吸道感染中hMPV存在A、B 2个不同基因型,以A基因型较常见.实用儿科临床杂志,2009,24(10):741-744     

兰州地区冠状病毒HKU1在儿童急性呼吸道感染的研究

目的 了解兰州地区冠状病毒HKU1(Human CoV-HKU1)在儿童急性呼吸道感染中的分子流行情况和临床特点.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对2007年11月～2008年10月兰州大学第一医院301例急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物进行冠状病毒HKU1基因检测,阳性产物经克隆、测序、同源性和进化分析,阳性标本同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒和冠状病毒NL63.结果 301份标本中共检出冠状病毒HKU1阳性扩增产物15份,检出率为5.0%,氨基酸同源性在90.7%～99.3%之间,与标准株HKU1-B(DQ415911)属于同一进化簇.有11例存在混合感染,时间分布在11月至次年4月.15例阳性患儿年龄10个月(15 d～12岁),主要诊断包括上呼吸道感染,支气管炎,支气管肺炎,肺炎,细支气管炎;临床表现包括发热、咳嗽、咯痰、腹泻、呕吐、咽充血、湿啰音、哮鸣音.无死亡病例.有6例患有基础性疾病.结论 在兰州地区急性呼吸道感染患儿中检出冠状病毒HKU1,基因型为B型.临床症状及诊断无特异性.     

急性下呼吸道感染住院患儿多瘤病毒检测及临床研究

目的了解多瘤病毒WU(WUPyV)和多瘤病毒KI(KIPyV)在急性下呼吸道感染住院患儿中的感染现状及特征。方法收集2007年9月至2008年3月长沙地区773份急性下呼吸道感染住院儿童鼻咽抽吸物样本,采用巢式聚合酶链反应(nested PCR)扩增方法进行WUPyV和KIPyV基因检测,并将PCR阳性产物测序,将所测序列在GenBank中进行比较分析。结果 773例样本中,多瘤病毒阳性53例(6.8%),其中WUPyV 39例(5.0%),KIPyV14例(1.8%)。所测得的核苷酸序列与GeneBank中已知的WUPyV与KIPyV序列同源性分别在93%～100%、95%～100%。结论 WUPyV和KIPyV可能是儿童急性下呼吸道感染中较重要病原之一,且与其他病毒引起的儿童下呼吸道感染存在相关性。     

基因检测在儿童严重急性呼吸综合征疑似病例诊断中的应用

目的 通过病原学检测鉴别诊断严重急性呼吸综合征(SARS)。方法 对1例没有明确SARS接触史,入院时临床诊断疑为“支原体肺炎”的患儿进行病原学鉴别诊断。(1)对患儿的咽拭子标本进行常见呼吸道病毒(包括呼吸道合胞病毒、甲、乙型流感病毒、腺病毒和I、Ⅱ、Ⅲ型副流感病毒)的抗原检测。(2)用RT-PCR进行人类偏肺病毒、肠道病毒和鼻病毒的检测。(3)采用巢式RT-PCR方法,进行SARS病毒基因检测。根据WHO在网上公布的SARS冠状病毒复制酶基因1b区合成3对引物,其中I对为所有冠状病毒所保守的,用来进行第一次PCR,另2对为SARS冠状病毒所特异的,分别用于第二次PCR,这2对引物可分别扩增368和348bp的基因片段。结果 患儿咽拭子标本7种常见呼吸道病毒和人类偏肺病毒、肠道病毒和鼻病毒的检测结果均为阴性,而用不同引物对检测,SARS冠状病毒基因均为阳性。经测序显示,该基因片段与GenBank已公布的17株SARS冠状病毒的序列同源性为100％,而与人冠状病毒的标准株有很低的同源性。同时该患儿的恢复期血清SARS冠状病毒特异性IgM和IgG均为阳性。结论 从患儿标本中未检测到常见的7种呼吸道病毒、人类偏肺病毒、肠道病毒和鼻病毒,而检测到了SARS冠状病毒。经病原学检测,确诊患儿为SARS,,在SARS流行期间,用检测常见呼吸道病毒抗原或基因的方法,可以将儿科的急性呼吸道病毒感染与SAPS进行区别。     

北京地区急性呼吸道感染婴幼儿中人副流感病毒感染状况的研究

目的了解北京地区急性呼吸道感染患儿中人副流感病毒（HPIV）的感染状况。方法（1）根据HPIV血凝素蛋白（HA）的基因保守区序列,合成能够区分HPIV 1～4型的多重巢式PCR引物,并用多种呼吸道病毒的标准毒株确定多重PCR方法的特异性;（2）收集2003年8月-2006年4月急性呼吸道感染患儿的临床标本3519例,应用逆转录多重PCR方法,对标本同时进行HPIV 1～4的检测。（3）随机选取不同型别的HPIV基因检测阳性标本共10例,对其PCR扩增产物直接进行核苷酸序列测定,并将所测到的序列与GenBank中的基因序列进行比较。结果（1）多重PCR方法的特异性检测显示,HPIV的分离株cDNA有预期大小的扩增片段,与其他常见呼吸道病毒无交叉反应性。（2）3519例标本中多重PCR检测阳性的为349例,占本组检测标本的9．9％（349／3519）,明显高于间接免疫荧光方法和（或）病毒分离4．8％的阳性率（170／3519）;应用多重PCR方法还检测到HPIV1与HPIV3以及HPIV3与HPIV4的混合感染;在上呼吸道及下呼吸道感染的患儿中均有较高的HPIV阳性检出率;季节性分布分析显示,HPIV感染无明显的规律性,以HPIV1、3为主,HPIV2、4仅散发存在。（3）序列分析结果提示,所选取的多重PCR方法检测阳性的10例标本确实是HPIV阳性,其中有两份分别属于HPIV4A、4B亚型。结论HPIV在儿童感染中除了单．亚型感染外还可存在混合型感染。未发现其感染的季节性特点。所应用的逆转录多重RT-PCR方法不仅检出率高于常用的方法（间接免疫荧光方法和病毒分离）,而且能够直接进行亚型分析。除了检出常见的1、2、3型外,还检出了较少见的4型,属国内首次报道。     

重庆地区急性呼吸道感染患儿鼻咽吸取物标本中人偏肺病毒的分离研究

目的分离新近发现的儿童呼吸道病毒病原——人偏肺病毒（hMPV）,并分析其感染的临床表现。方法选取重庆医科大学儿童医院2004年12月至2005年7月因呼吸道感染住院的患儿,无菌采集鼻咽吸取物。离心后细胞沉淀用直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A／B、副流感病毒1、2、3型等常见呼吸道病毒病原。上清接种于Veto-E6和LLC-MK2细胞,进行hMPV分离,出现细胞病变者,扩增hMPV N、F基因,F基因扩增产物序列递交GenBank。收集并分析hMPV感染患儿的临床资料。结果收集的86份鼻咽吸取物中,有6份接种Veto-E6和LLC-MK2细胞后出现细胞病变,且用RT-PCR成功扩增出hMPV N、F基因片段,证实hMPV分离成功。在6例阳性标本中,2例收集于冬季,2例春季,2例夏季。6位患儿年龄都小于2岁,诊断为支气管肺炎（2／6）、毛细支气管炎（2／6）、婴幼儿哮喘（1／6）和上呼吸道感染（1／6）。副流感病毒3和腺病毒可为协同感染病毒病原。结论首次在中国内地成功分离获得6株hMPV,从活病毒水平证实hMPV是导致中国儿童下呼吸道感染的病毒病原,hMPV感染的临床表现与呼吸道合胞病毒感染相似。采用病毒分离技术,hMPV在呼吸道感染患儿中的检出率约为7％（6／86）。     

新型呼吸道病毒在PICU的检出及其临床意义

目的了解新型呼吸道病毒在PICU中的检出情况及感染患儿的临床特点。方法收集我院600例PICU急性呼吸道感染患儿的咽拭子标本600份,87例社区健康体检儿童咽拭子87份作为健康对照。应用多重PCR技术对新型呼吸道病毒进行检测,部分阳性结果进行基因测序,并分析阳性病例的临床资料。结果（1）600例患儿中,新型呼吸道病毒检测阳性114例（19％）,其中人博卡病毒（humanbocavirus,HBoV）48例（8．00％）,C型鼻病毒（humanrhinovirusgroupC,HRV—C）47例（7．83％）,新型甲型流感H1N1病毒13例（2．17％）,人偏肺病毒（humanmetapneumovirs,HMPV）10例（1．67％）,wu多瘤病毒3例（0．50％）。87例健康儿童呼吸道病毒检测均为阴性。（2）114例新型呼吸道病毒检测阳性患儿中,单一感染69例,混合感染45例,其中HBoV混合其他病毒感染22例（45．83％,22／48）,HRV—C混合其他病毒感染14例（29．78％,14／47）,新型甲型流感H1N1病毒混合其他病毒感染4例（4／13）,HMPV混合其他病毒感染9例（9／10）,wu多瘤病毒混合其他病毒感染3例（3／3）。结论PICU中HBoV、HMPV、HRV—C、新型甲型流感H1N1病毒等新型呼吸道病毒具有较高的检出率,可能导致重症感染,应该引起临床重视。     

偏肺病毒毛细支气管炎的临床研究

目的　了解人类偏肺病毒 (hMPV)感染情况及所致毛细支气管炎的临床特征。方法 (1)采用RT PCR方法 ,对 12 6例毛细支气管炎中经呼吸道常见病原检测阴性的 5 4份鼻咽洗液标本进行hMPV基因检测 (扩增 测序 ) ;(2 )分析hMPV感染患儿的临床资料。结果　 (1)共检测出 2 1份阳性hMPV扩增产物 ,阳性率为 16 7% ,占 5 4例呼吸道常见病原检测阴性患儿的 39%。 (2 ) 2 1例hMPV毛细支气管炎中幼婴 (1～ 6月龄 )占 6 2 % ;多为低 中度发热 (86 % ) ;外周血WBC <10 0× 10 9/L者占81% ;胸部X线表现为两肺野点片状影和 (或 )肺气肿影者分别为 6 8%和 6 2 %。经临床Lowell评分 5例评为重症。hMPV毛细支气管炎患儿组主要临床特征与A亚型呼吸道合胞病毒 (hRSV)毛细支气管炎组无区别 ,仅病程较B亚型hRSV毛细支气管炎组长 (P <0 0 1)。结论　 (1) 12 6例毛细支气管炎住院患儿中有 16 7%是由hMPV感染引起。 (2 )hMPV毛细支气管炎的主要临床特征与hRSV毛细支气管炎无明显差异。