HBV DNA的前C区1896 G/A变异与血清HBV DNA水平

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）前C区1896G／A变异对血清HBV DNA水平复制及临床表现的影响，本研究报道采用酶联免疫吸附试验（EHSA）和荧光定量PCR方法（FQ-PCR）及突变特异引物PCR方法（AS-PCR）对95例诊断符合2000年修订的病毒性肝炎防治方案的HBV感染者进行了HBV血清免疫标志物和HBV DNA定量及HBV DNA1896位点G／A变异检测的结果。     

乙型肝炎病毒X基因PCR产物直接测序方法的建立和临床应用

乙型肝炎病毒各个区变异的研究是当前的研究热点。已经知道，HBV有S区、C区、P区和X区四个区。其中X区的变异可影响核心启动子和增强因子Ⅱ，产生翻译终止密码，导致HBV DNA复制和表达的抑制。研究HBV变异的方法有多种，而确定变异位点最直接的方法就是DNA测序。目前，DNA序列分为引物标记法和末端标记法两种，本研究拟通过PCR扩增HBV X基因，并用引物标记法对其测序，拟建立一个快速、简便、低成本的测序方法。研究HBV X基因变异从而为研究其他目的基因的变异提供有效的方法。     

人类MOG1基因检测及其与青壮年猝死综合征的相关性研究

目的寻找MOG1基因的变异位点,探讨其与青壮年猝死综合征的关系。方法提取青壮年猝死综合征病例组及健康对照组的基因组DNA,采用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增MOG1基因编码区外显子、外显子-内含子交界区以及3′侧翼区序列,直接行DNA测序以明确遗传变异类型,并进行统计学分析。结果在病例组中共检测到3个变异位点,其中2个为新发现的突变,分别为c.285G〉C（p.L95L）和c.＊4C〉T,另1个为单核苷酸多态性位点c.437＋16C〉T。在病例组和对照组中c.437＋16C〉T位点基因型分布（P=0.071）和等位基因频率（P=0.819）存在一定程度差异,但差异均无统计学意义。结论MOG1基因是否是中国人青壮年猝死综合征的易感基因还有待进一步研究。     

建立一种实时荧光PCR对维生素D受体基因单核苷酸多态性快速分型

目的:建立实时荧光PCR快速检测维生素D受体(VDR)基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性。方法:以VDR基因的rs2228570、rs1544410、rs7975232三个SNP位点的变异碱基分别设计并合成特异性引物。11例体检健康儿童血液标本作为检测样本,采用实时荧光PCR方法检测样本中VDR基因型,采用Sanger法对检测结果测序验证。结果:利用所设计的特异性引物对人全血基因组中VDR进行SNP位点特异性扩增,根据7500 FAST实时荧光PCR仪的分析结果得到基因型,与测序结果比对后发现,11个样本采用实时荧光PCR方法基因分型结果与测序结果均一致。结论:实时荧光PCR快速检测VDR基因rs2228570、rs1544410、rs7975232位点多态性的方法或可用于临床VDR基因SNP快速分型。     

汉族人白细胞介素-18基因启动子多态性与慢性乙型肝炎的相关性研究

目的 探讨中国汉族人白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）基因启动子单核苷酸多态性及其与慢性乙型肝炎易感性之间的关系。方法 应用序列特异性引物一聚合酶链反应技术，检测231例慢性乙型肝炎患者和300名正常人儿．馏基因启动子-607C/A、-137G／C单核苷酸多态性位点基因型。结果 正常对照组和慢性乙型肝炎组中，IL-18基因启动子-607C/A位点3种基因型频率分别为CC型：0．22（66／300）和0．27（62／231），CA型：0．53（160／300）和0．50（116／231），AA型：0．25（74／300）和0．23（53／231）；IL-18基因启动子-137G／C位点3种基因型频率分别为GG型：0．67（202／300）和0．79（182／231），GC型：0．30（90／300）和0．19（45／231），CC型：0．03（8／300）和0．02（4／231）。经Y0检验，慢性乙型肝炎组IL-18基因启动子-137GG分布频率显著高于正常对照组（X^2=8．55，P=0．003），而-607C／-137C和-607A／-137C单倍型频率显著低于正常对照组。进一步比较慢性乙型肝炎患者儿．馏基因启动子多态性与乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）DNA复制的关系，发现高水平HBV—DNA组-607位点AA基因型分布频率明显低于低水平HBV—DNA组（Y2=6．03，P=0．014）。结论 汉族人慢性乙型肝炎与IL-18基因启动子-607C/A、-137G／C单核苷酸多态性相关，其中IL-18基因启动子-137位点C等位基因可能对机体HBV感染有保护作用，而启动子-607位点AA型对感染后HBV—DNA的复制可能有抑制作用。     

基因芯片检测乙醇对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变的研究

目的：研究乙醇对HBV DNA多位点基因变异的影响，为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取85例慢性乙肝患者为研究对象，分为嗜酒组和非嗜酒组，采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区G1896A及A1814C位点、BCP区 A1762T及G1764A位点、P区C528A及T552C位点的基因突变。结果:嗜酒组在BCP区A1762T及G1764A位点的突变频率明显高于非嗜酒组(均P<0.05)。在前C区G1896A及A1814C位点，P区C528A及T552C位点突变频率无明显差异（均P>0.05）。结论:乙醇导致乙肝病毒BCP区A1762T及G1764A位点发生基因突变，增强HBV基因的表达和复制，加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

PCR-RFLP检测拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异

目的 建立用PCR－限制性片段长度多态性技术（PCR－RFLP），分析拉米夫定抗HBV感染中聚合酶YMDD变异方法。方法 在拉米夫定抗HBV治疗过程中HBV DNA由阴性再次转为阳性患者及HBV DNA始终保持阳性的血清达1年或1年以上，用3对引物扩增HBV P基因的C区，扩增产物分别用3个限制性内切酶分析，酶切结果用8.4%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。检测HBV YMDD变异，同时血清用全自动测序仪检测YMDD变异。分析比较两者结果。结果 35例病人，包括33例HBV DNA再次阳性患者，2例用药1年HBV DNA未转阴。14例病人出现YMDD变异。PCR－RFLP结果为6例YVDD变异、4例YIDD、1例YI／MDD、21例YMDD与测序一致。另3例PCR－RFLP结果为YI／VDD，即混合变异，测序报告为2例YIDD、1例YVDD，分析相应的测序图，存在混合变异。并把YIDD与YVDD变异的血清混合，行PCR－RFLP，结果与YI／VDD一致。结论 用PCR－RFLP能快速、简便、灵敏地检测YMDD变异。     

先天性心脏病患者CHD7基因突变的研究

目的 筛查先天性心脏病(congenital heart fflsease,CHD)患者CHD7(chromodomsin helicase DNA-binding protein gene)基因的胚系突变,探讨其在先心病发生中的作用.方法 采集67例临床确诊的CHD患儿、100名正常对照的外周静脉血,提取白细胞基因组DNA,PCR扩增CHD7基因,变性高效液相色谱分析技术对PCR产物进行突变筛选,出现异常峰型的扩增片段进行DNA测序,明确突变位点和类型,并进一步结合病例对照和生物信息学分析探讨变异的功能意义.结果 67例先心病患者中共检出7种单碱基的替换,位于CHD7的不同内含子.其中,IVS11+127A＞G和WS12+21T＞G的等位基因频率均为0.0075,为罕见变异;而IVS2+34G＞A、IVS4+39C＞A、IVS12.5T＞C和IVS16+51C＞A等位基因频率为0.2635、0.2156、0.1505、0.3636,属于单核苷酸多态性;IVS12-5T＞C在CHD组的检出频率显著低于正常对照组(5.42%vs 9.57%,P＜0.05);而IVS14-35C＞G则仅见于CHD患儿.生物信息学分析显示,IVS12-5T＞C替换具有增强外显子剪切的效应.结论 CHD7基因单核苷酸多态性变异WS12-5T＞C对CHO的发生可能具有保护作用,而CHD7基因的突变并不是构成散发性先天性心脏病的主要原因.     

牙龈卟啉单胞菌prtH基因分布与多态性研究

目的　分析牙龈卟啉单胞菌 (P .gingivalis)prtH基因的遗传多态性 ,从而了解细菌变异与其对牙周致病作用的相关性。方法　以PCR技术从牙周炎患者口腔中分离的P .gingivalis进行prtH基因扩增 ;采用斑点杂交法 ,以生物素标记prtH基因为探针 ,与以引物B进行PCR扩增为阳性的P .gingivalis基因组DNA杂交 ;对PCR产物进行AluⅠ限制性酶切和DNA测序分析。结果　以prtH基因A、B引物对 14 0株临床分离株进行PCR扩增 ,分别在 76例 (引物A)和 117例 (引物B)出现阳性扩增产物 ,阳性率分别为 5 4 .2 %、84 %。对 34例引物B扩增阳性的P .gingivalisDNA进行点杂交检测 ,阳性吻合率为 82 .4 %。与GenBank中菌株ATCC332 77(U15 2 82 )和W83(L2 74 83)的prtH基因序列相比 ,5株P .gingivalisPCR扩增产物的测序存在着缺失和点突变。结论　在慢性牙周炎患者临床P .gingivalis分离菌株中存在着prtH基因的遗传多态性 ,本实验建立了具有高度敏感性和特异性的PCR检测方法     

乙型肝炎病毒C区基因多态性的检测分析

目的 探讨乙型肝炎患者和健康携带者乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）C区基因变异规律及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测乙肝患者和HBV健康携带者外周血HBV DNA载量;PCR结合DNA测序对HBV C区基因进行多态性检测,并应用DNAstar软件进行比对和分析。结果①与标准株相比,所有标本C区基因序列均出现变异。在≥2例标本中出现的突变31处,包括PreC基因3处,C基因28处;其中9处为错义突变,1处为终止突变,其余21处均为同义突变。nt 1827 c→a和nt 2221 c→t出现在所有标本,有6处同义突变出现于较多标本中。4例乙肝患者标本在nt1896位发生g→a突变,另有4例乙肝患者在HBcAgCTL识别表位84～101处发生2处突变即S87G和I97F或197L。②DNA扩增及测序的成功与否与HBV的DNA拷贝数密切相关,本次研究DNA扩增及测序成功的标本其DNA拷贝数多大于40 193/ml,DNA拷贝数较低的标本不易获得成功。结论HBV基因组极易发生突变,C区基因有2个位点的突变见于所有扩增成功标本,为此研究标本所特有,提示这些突变热点可能具有地域特异性。C区基因变异可引起HBeAg和HBcAg的结构及功能改变,进而导致病毒逃逸机体对病毒的免疫清除作用,或影响HBeAg的检出。     

基因芯片检测拉米夫定治疗乙肝病毒感染耐药分析

目的 分析拉米夫定治疗乙肝病毒感染耐药性,旨在为指导慢性乙肝患者临床药物治疗提供新方法.方法 应用基因芯片检测255份51名拉米夫定抗乙肝病毒治疗自愿者不同阶段服药的临床标本及145份HBV DNA阴性血清耐药突变,并对突变进行分析.结果 经一年药物治疗10名患者产生耐药突变,耐药率19.6%（10/51）,产生突变阳性标本病毒载量＞105拷贝/ml.药物治疗后产生突变＞6个月.10例突变病毒株中,552密码子处突变9例,528密码子处突变3例,密码子555中未发现突变.5例血清存在混合感染,其中4例为野生型病毒与突变型的混合,野生型病毒所占比例皆在40%以下.1例血清出现在（4,4）位点的密码子ATT与（3,3）位点密码子TTG两种突变,两种突变类型病毒并行产生同步增长.（3,3）突变类型首次报道.结论 拉米夫定抗乙肝病毒治疗6个月以上易产生耐药,产生耐药病毒载量＞105拷贝/ml.主要发生在YMDD区,且存在两种突变类型病毒的混合感染,以上结果对慢性乙肝患者用药具有指导作用.     

限制性片段长度多态性分析拉米夫定治疗引起乙型肝炎病毒耐药基因变异的研究

目的　应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析方法 (PCRRFLP) ,研究拉米夫定治疗引起慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒耐药基因 (HBVDNA)变异。方法　收集 2 4 0例用拉米夫定治疗 5 2～ 78周慢性乙型肝炎患者的血清标本 ,应用PCRRFLP方法扩增HBV 5 5 2 ,5 2 8两个基因位点片段 ,用限制性内切酶NdeⅠ ,NlaⅢ酶切分析 ,同时测定HBVDNA含量 ,并用DNA序列分析测定 3例患者HBVDNAP区基因序列 (1例野毒株 ,1例M5 5 2V伴L5 2 8M变异 ,1例M5 5 2I变异 )。结果　 2 4 0例患者应用拉米夫定治疗 5 2～ 78周后 ,5 1例血清HBVDNA出现YMDD变异 ,其中M5 5 2V变异 38例 ,M5 5 2I变异 13例 ,L5 2 8M和M5 5 2V同时变异 2 6例 ,L5 2 8M和M5 5 2I同时变异 1例。与定量PCR比较 ,可以测定YMDD变异的最低含量为 1× 10 4 copies mlHBVDNA序列分析结果与RLFP测定一致。结论　PCRRLFP方法是一种快速、简便的检测HBVDNA聚合酶变异的方法 ,可以用来筛查大量的血清标本 ,适宜作为临床用来观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者检测HBV变异的方法     

短片段PCR-ELISA液相杂交法的建立及检测HBV YMDD变异的研究

目的：建立短片段PCR－ELISA技术,检测HBV P基因C区变异位点,以了解拉米呋啶治疗过程中与HBV耐药有关突变株的产生。方法：通过定点诱变获得的重组质粒作为标准对照,采用短片段PCR－ELISA方法对拉米呋啶治疗的60例乙肝患者血清标本进行HBV聚合酶P基因的变异检测同时观察其HBV DNA的定量,肝功能指标的变化,结果：所测60份血样中有8份检出突变株,经测序证实YMDD变异存在,其中4例由ATGR变为GTG,1例变为ATT,3例变为ATC,并出现HBV DNA定量反跳及肝功能的变化,结论：短片段PCR－ELISA法监测乙肝病毒YMDD变异,其方法与一般PCR相比,时间仅为其五分之一,且具有更好的特异性。     

基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV变异技术的建立和应用

目的建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法设计特异性寡核苷酸探针阵列,特殊处理芯片载体。用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。在本院住院治疗患者中选择30例服用拉米夫定后,HBV DNA转阴(<500 copies/ml)168周后又反跳≥5 000 copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测分析。同时用PCR直接测序法对上述30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果 30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBV YMDD变异21例,其中YVDD变异11例。YIDD变异10例。HBVDNA PCR直接序列测定结果,有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,并有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸。核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。标本阳性变异序号与基因芯片检测结果完全一致。结论 乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD,YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100％,无假阳性。     

A novel accurate ACRS-PCR method with a digestion internal control for identification of wild type and YMDD mutants of hepatitis B virus strains

As a consequence of the point mutation in the YMDD motif of the hepatitis B virus (HBV) polymerase gene, lamivudine-resistant mutants have been reported in chronic hepatitis B patients who underwent lamivudine therapy. The objective of the study was to develop a novel accurate artificially created restriction site (ACRS) method with a digestion internal control for identification of YMDD, YIDD and YVDD HBV strains. Three conserved, specific and diagnostic primers introducing NdeI, SspI and AleI cleavage sites were designed in order to identify YMDD, YIDD and YVDD strains, respectively; while, their reverse primers also modified with the above recognition sites in order to enzyme correctness monitoring and false outcome avoiding. Thirty-two chronic hepatitis B patients who had taken lamivudine for 1-3 years and checked by the Inno-LiPA HBV DR kit, were evaluated by the ACRS method and then compared to sequencing data. The results of the ACRS method revealed the YMDD mutant strain in 20 patients, YMDD plus YIDD pattern in 1 patient, YMDD plus YVDD in 4 patients, the YIDD in 4 patients and mixed infection with each three strains in 1 patient. The sequencing and Inno-LiPA results were in agreement with the ACRS results. The novel ACRS method is a reliable, rapid and a cost-effective technique for determination of HBV strains with the wild type and YMDD mutant patterns.     

PCR-RFLP结合克隆测序监测乙肝病毒拉米夫定耐药突变株的产生

目的 建立PCR结合酶切的方法监测慢性乙型肝炎患者体内拉米夫定耐药突变株的产生,并与PCR产物克隆后测序相结合。了解此方法的可靠性和可行性,同时用此方法筛查50例应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中耐药株的发生情况。方法 拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者50例,治疗时间9个月-24个月,设计错配PCR结合限制性片段长度多态性方法,快速检测患者体内乙型肝炎病毒（HBV）酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid,YMDD)变异株的发生情况,对筛检耐药株阳性的标本应用PCR产物克隆后测序加以证实。结果 在50例服用拉米夫定患者中发现9斧正患者在用药超过9个月时出现拉米夫定耐药突变株（YMDD变异株）,其中YIDD变异5例,YVDD变异4例,后者有3例合并有1526M突变。结论 本方法在检测YMDD变异方面具人快速简便的特点,经克隆后测序证实,具有较好的可靠性。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBVP区基因突变模式与基因型的关系

目的分析慢性乙型肝炎患者在拉米夫定（LAM）治疗过程中出现耐药后,HBVP区基因突变模式及基因分型的关系。方法对2008年9月至2010年6月在我院就诊的107例临床诊断为LAM耐药慢性乙型肝炎患者进行HBVP区及基因分型测定。结果107例患者的基因突变模式为8种,100％均发生YMDD序列突变,其中单位点突变43例,其余均为联合突变;107例患者主要以B（25．2％）和C（73．8％）基因为优势,1例为B和c混合基因,且c基因以rtM204＋rtL180M模式为主,占60．7％（48／79）,B基因以rtM204突变模式为主,占66．7％（18／27）;rtM204和rtM204＋rtL180M突变模式的B和C基因比较两者差异有统计学意义（x2分别为8．4和7．2,P〈0．01）。结论YMDD基序突变是LAM耐药后HBVP区基因突变的主要模式,不同基因型决定了与耐药相关的变异出现形式。     

三联叠加疗法对慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒复制和变异的影响

目的观察疗效确切的抗病毒药物和免疫调节剂,叠加伍用对慢性乙型肝炎病人HBV复制和变异的影响.方法应用拉米夫定、干扰素α-2b、黄芪注射液三联叠加疗法,对慢性乙型肝炎病人进行抗病毒治疗,并与单独应用拉米夫定的抗HBV效果进行比较评价.检测HBVDNA阴转率和HBeAg-抗HBe血清转换率;血清HBVDNA浓度;HBVDNA的YMDD变异率和前C区变异率.结果A组(叠加用药组)与B组(拉米夫定单药组)比较,HBVDNA阴转率分别在第12周、36周及48周差异有显著性(P<0.05),HBeAg阴转率在第36周、48周差异有显著性(P<0.05),抗HBe阳转率仅在第48周差异有显著性(P<0.05);两组患者血清HBVDNA浓度比较,治疗12周时降低程度差异有显著性(P<0.05),治疗第36周和48周时差异有非常显著性(P<0.01);治疗后12周,A组出现前C区BCP变异;疗后24周、36周和48周,两组均出现YMDD和前C区变异.结论与拉米夫定单独用药比较,三联叠加疗法可增加慢性乙型肝炎患者HBVDNA阴转率和HBeAg-抗HBe血清转换率,更显著降低血清HBVDNA浓度,并减少YMDD变异,故其抗HBV疗效优于拉米夫定单独用药.     

Factors associated with viral breakthrough in lamivudine monoprophylaxis of hepatitis B virus recurrence after liver transplantation

This study aimed to investigate the factors associated with viral breakthrough among liver transplant recipients who receive lamivudine monoprophylaxis. Consecutive patients receiving liver transplantation for HBV-related liver disease from June 1999 to October 2000 were studied. All patients received lamivudine 100 mg daily pre- and post-transplant. Serum samples were collected before lamivudine treatment, before liver transplantation, and then every 3-6 months after liver transplantation. Lamivudine-resistant mutations at the YMDD motif of HBV P gene were detected by direct sequencing and HBV DNA was quantified by real-time polymerase chain reaction (PCR). Ten patients, 7 males and 3 females, aged 50.5 +/- 7.9 years, were studied. Three patients had fulminant hepatitis and 7 patients had end-stage cirrhosis before liver transplantation. Lamivudine was started at 4.5 (range 0-40) weeks before liver transplantation. The median post-transplant follow-up was 16 (range 12-23) months. Four patients developed YMDD mutations 10.5 (0-16) months after transplantation with relapse of viraemia (median 1,294, range 51-3,135 MEq/ml). All patients who developed YMDD mutants had end-stage liver cirrhosis, and HBV DNA were detectable on the day of liver transplantation (median 0.62, range 0.086-1.63 MEq/ml). On the contrary, all 3 patients transplanted for fulminant hepatitis did not have YMDD mutation. Among the 3 end-stage cirrhotic patients who had negative HBV DNA before liver transplantation, none developed YMDD mutation. In conclusion, patients transplanted for fulminant hepatitis B and cirrhotic patients in whom HBV DNA could be rendered PCR negative before liver transplantation are unlikely to develop YMDD mutation on lamivudine monoprophylaxis.     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒基因序列变异特点及其准种研究

目的研究拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区核苷酸序列变异、特点、含量及其与基因型和病毒载量的关系。方法普通DNA测序法检测拉米夫定治疗的117份慢乙肝患者血清HBV逆转录酶区基因序列及其基因型;其中99份用TaqMan法定量HBVDNA;64份用焦磷酸测序（Pyrosequencing）检测YMDD基序中碱基的频率。结果HBVYMDD变异组中C型43例,B型10例,A／B混合型1例;YMDD不变异组中C型54例,B型8例,D型1例,HBVDNA含量平均对数值在变异组和不变异组分别为：6．5699和6．6165;YMDD变异与其基因型及病毒载量无统计学意义;rtL180M位点变异与rtM204I／V位点变异高度相关;并且HBV野生株与变异株均同时存在。结论结合两种测序方法可以用来研究拉米夫定治疗中HBV基因序列变异情况及对YMDD耐药株进行定量。