过表达Atg5蛋白对巨噬细胞泡沫化程度的影响

目的探讨过表达Atg5蛋白对巨噬细胞泡沫化程度的影响。方法采用Atg5慢病毒和对照组病毒感染Raw264.7巨噬细胞,建立对照细胞系(对照组)和Atg5过表达细胞系(观察组)。两组细胞分别加入50 mL/L ox-LDL诱导形成泡沫化细胞。采用Western blot分析两组细胞蛋白p62、LC3、CD36和SR-A的变化;采用高效液相法检测两组细胞内胆固醇脂(CE)、游离胆固醇(FC)和总胆固醇(TC)的变化;采用免疫荧光和电子显微镜分析两组细胞内脂滴的含量;采用ELISA检测两组细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。结果与对照组比较,观察组细胞自噬底物p62水平显著下调,LC3-II水平显著上调(P0.05)。与对照组比较,观察组巨噬细胞CE、FC和TC含量均显著下调(P0.05)。观察组细胞脂质水平和脂滴的数量较对照组明显下降(P0.05)。与对照组比较,观察组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著下调(P0.05)。结论自噬核心蛋白Atg5过表达可显著提高巨噬细胞自噬水平,可能通过自噬降解胞内胆固醇等脂质,预防巨噬细胞泡沫化,进而降低动脉粥样硬化的发生。     

基于甲基化捕获联合转录组测序探讨栀子-川芎药对抗动脉粥样硬化的作用机制

目的:观察栀子-川芎药对对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7泡沫细胞DNA甲基化和转录组表达的作用。方法:细胞毒性试验(CCK-8)法检测不同浓度栀子-川芎冻干粉对RAW 264.7细胞的增殖抑制情况;以ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h形成泡沫细胞,将细胞分为栀子-川芎冻干粉组(80 mg/L ox-LDL、0.3 g/L栀子-川芎冻干粉干预)、模型组(80 mg/L ox-LDL处理)和空白对照组(未处理);气相、色谱质谱法(GC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测各组总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)以及炎性因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)]的表达;采用DNA甲基化捕获测序(MC-seq)和转录组测序(RNA-seq)方法检测各组细胞全基因组DNA甲基化和转录组基因表达水平,使用DSS工具分析各组样本间的差异甲基化位点(DMS)和差异表达基因(DEGs),并利用生物信息学方法对差异基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因本体(GO)富集分析。结果:CCK-8检测发现,...     

脂多糖刺激RAW264.7和Ana-1形态改变及细胞因子表达的差异

目的 比较两株小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7和Ana-1经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导后在形态及细胞因子表达等方面的差异.方法 MTT法检测小同终浓度(0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L)LPS作用后两株细胞增殖活力,确定最佳作用浓度.选择1 mg/L LPS刺激RAW264.7和Ana-1细胞,ELISA法分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测两株细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-10的表达量.结果 LPS终浓度为1 mg/L时两株细胞存活率分别为(162.05±28.14)%、(159.92±20.43)%,显著大于同细胞其他浓度组别(P<0.01);1 mg/L LPS刺激后,两株细胞各细胞因子表达均为随时间呈先增多后减少趋势,峰值出现时间RAW264.7细胞早于Ana-1细胞.TNF-α的表达4 h时RAW264.7细胞高于Ana-1(P<0.01),8 h、12 h时低于后者(P<0.05);IL-1β的表达各时间点比较RAW264.7均高于Ana-1(P<0.05);IL-6的表达各时间点比较RAW264.7均低于Ana-1(P<0.05);IL-10的表达于刺激后4 h,RAW264.7细胞高于Ana-1细胞(P<0.05).结论 当LPS浓度为1 mg/L时,Ana-1与RAW264.7细胞存活率均最强;经LPS刺激后,RAW264.7细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10表达高峰早于Ana-1细胞,各细胞因子表达量各有侧重.研究者进行炎症相关实验时对Ana-1和RAW264.7的选择需考虑两者之间的差异.     

别嘌呤醇抑制巨噬细胞脂质蓄积的作用机制

目的采用氧化型低密度脂白(ox-LDL)构建小鼠巨噬细胞泡沫化模型,探讨别嘌呤醇对泡沫化进程中脂质蓄积的影响及其机制。方法体外培养小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7,用ox-LDL或Dil-ox-LDL孵育细胞构建泡沫化模型。用不同浓度别嘌呤醇处理细胞,MTT法筛选出合适的实验浓度。将合适浓度的别嘌呤醇作用于细胞,在共聚焦荧光显微镜下观察Dil-ox-LDL孵育后RAW264.7细胞内脂质蓄积情况;酶学终点法定量检测细胞内总胆固醇的变化;半定量﹑荧光定量RT-PCR法和蛋白免疫印迹法分别检测细胞中LXRα和ABCA1 mRNA和蛋白的表达水平。结果与ox-LDL诱导的泡沫化模型组相比,别嘌呤醇组脂质蓄积显著下降,总胆固醇含量明显下调。别嘌呤醇在mRNA和蛋白水平上引起LXRα和ABCA1的高表达。结论别嘌呤醇具有抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞泡沫化进程的作用,并通过上调LXRα-ABCA1途径来调节细胞内胆固醇的含量。     

黄芪多糖对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 探讨黄芪多糖(APS)对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导,建立泡沫细胞模型.用油红O染色在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化.再以不同浓度APS(0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)作用泡沫细胞24 h;以100 mg/L APS作用泡沫细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)后,酶比色法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果①巨噬细胞经ox-LDL诱导48 h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的APS作用于巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后,细胞内胆固醇含量均明显减少(P＜0.01).③与对照组相比,100 mg/L的APS作用于巨噬细胞源性泡沫细胞6 h、12 h、24 h、48 h,细胞内胆固醇含量均明显减少(P＜0.01).结论①巨噬细胞经ox-LDL诱导后,有大量泡沫细胞形成.②APS可减少RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量.     

同型半胱氨酸通过诱导miR-33激活NF-κB途径上调RAW264.7源性泡沫细胞TNF-α、IL-6的表达

目的研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过诱导mi R-33激活核因子κB(NF-κB)途径上调肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的表达,促进炎症反应,加剧动脉粥样硬化(As)。方法 RAW 264.7源性巨噬细胞,经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞后,分别将mi R-33 mimics和mi R-33 inhibitor转染入细胞内后每组给予5.0 mmol/L的Hcy干预;油红"O"染色确定泡沫细胞模型是否诱导成功; Western blot和实时定量PCR测定NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达;高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量。结果油红"O"染色后含脂滴的泡沫细胞被染成红色;与其它组相比,mi R-33 mimics组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达均增高且细胞内的胆固醇含量增加(P0.05); mi R-33 inhibitor组的NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白和m RNA表达均降低且细胞内的胆固醇含量降低(P0.05);空白对照组、mi R-33 mimics对照组和mi R-33 inhibitor对照组间相比,所有检测指标均无统计学差异(P0.05)。结论 Hcy通过诱导mi RNA-33激活NF-κB途径上调TNF-α和IL-6的表达,增加炎症反应,促进动脉粥样硬化。     

ghrelin通过PI3K/Akt信号通路促进RAW264.7源性泡沫细胞迁移

目的探讨ghrelin对RAW264.7源性泡沫细胞迁移的影响及相关机制。方法油红O检测泡沫细胞模型的构建,胆固醇氧化酶法检测泡沫细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)含量,transwell小室实验检测ghrelin对RAW264.7源性泡沫细胞迁移的影响,Western blot检测Akt、p-Akt和cleaved Caspase-3蛋白的表达,免疫荧光检测p-Akt和cleaved Caspase-3的表达,细胞骨架荧光探针检测细胞骨架的变化。观察PI3K特异性抑制剂LY294002是否影响RAW264.7源性泡沫细胞的迁移能力及相关蛋白的表达。结果 10-7mol/L ghrelin处理RAW264.7源性泡沫细胞可以促进泡沫细胞迁移,此过程可以被LY294002逆转。Western blot结果显示10-7mol/L ghrelin可显著升高RAW264.7源性泡沫细胞p-Akt的表达,降低cleaved Caspase-3的表达(P0.05),并明显改善RAW264.7源性泡沫细胞的迁移能力(P0.05),LY294002可逆转以上变化。免疫荧光检测显示Akt在RAW264.7细胞明显表达,ghrelin组表达增多,LY294002组明显降低。结论 ghrelin可促进RAW264.7源性泡沫细胞迁移,其分子机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

丹参酮ⅡA对泡沫细胞胆固醇平衡的影响

目的通过体外细胞实验阐明丹参酮ⅡA对泡沫细胞胆固醇平衡的影响。方法体外培养小鼠RAW264.7细胞,以氧化型低密度脂蛋白诱导为泡沫细胞模型,并用不同浓度的丹参酮ⅡA进行处理,通过油红O染色观察细胞内脂质堆积情况,酶比色法定量检测细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化,荧光定量PCR和WesternBlot检测细胞中CD36、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)、肝脏X受体α(LXRα)、过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)及PPARγ的mRNA和蛋白表达。结果 0～20 mg/L的丹参酮ⅡA对泡沫细胞增殖活力无明显影响,20 mg/L丹参酮ⅡA干预后,泡沫细胞内胆固醇酯与总胆固醇的比值显著降低,细胞内脂质累积减少,并上调AB-CA1、LXRα和PPARα的mRNA和蛋白表达,但对CD36表达无明显作用。结论丹参酮ⅡA能抑制泡沫细胞的形成,其机制可能是通过诱导PPARα、LXRα和ABCA1表达,促进胆固醇的外排。     

RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定

目的 以小鼠巨噬细胞RAW264.7为对象,建立简便而又准确的泡沫细胞诱导及鉴定方法.方法 将实验分为正常对照组和不同浓度氧化型低密度脂蛋白与细胞孵育组,在以孵育时间为24 h的前提下,用MTT法和流式细胞术来确定诱导泡沫细胞的氧化型低密度脂蛋白合适浓度区间范围,并用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定不同程度泡沫细胞内胆固醇酯含量.结果 氧化型低密度脂蛋白浓度范围为20～30 mg/L时,细胞存活率已受到显著抑制,并随着氧化型低密度脂蛋白浓度的增高细胞凋亡率和坏死率逐渐增大,起初以细胞凋亡为主,当氧化型低密度脂蛋白浓度大于40 mg/L时凋亡的细胞不断坏死.20 mg/L和30 mg/L氧化型低密度脂蛋白与RAW264.7细胞共孵育24 h,细胞内胆固醇酯比重分别为66.26%和71.19%,而10 mg/L的氧化型低密度脂蛋白诱导24 h的泡沫细胞不典型,40 mg/L以上的氧化型低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞泡沫化程度严重,贴壁不牢,大部分细胞破裂或凋亡,脂滴散布于细胞外.结论 20～30 mg/L氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬泡沫细胞模型稳定且形态较完整,符合泡沫细胞的形态学特征.     

下调miR-92a通过调控PIAS3抑制ox-LDL诱导RAW264.7细胞炎症介质分泌和脂质蓄积

目的探讨下调miR-92a对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7细胞炎症介质分泌和脂质蓄积的影响及其机制。方法以不同浓度(0、25、50、100 mg/L)的ox-LDL处理RAW264.7细胞24 h或以100 mg/L ox-LDL分别处理RAW264.7细胞0、12、24 h后,采用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ox-LDL对miR-92a表达的影响。建立miR-92a低表达的RAW264.7细胞株,并给予100 mg/L ox-LDL处理后,用qRT-PCR、油红O染色、一氧化氮(NO)荧光探针(DAF-FMDA)和Western blot检测下调miR-92a表达对ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中炎症因子诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、白细胞介素6(IL-6)和IL-1β表达、脂质蓄积以及信号转导子和转录激活子3(STAT3)信号通路相关蛋白p-STAT3、STAT3蛋白表达的影响。建立活化STAT3蛋白抑制分子(PIAS3)和miR-92a低表达的RAW264.7细胞株,并给予100 mg/L ox-LDL处理后,观察沉默PIAS3表达对ox-LDL作用下miR-92a低表达的RAW264.7细胞中炎症因子、脂质蓄积以及STAT3信号通路的影响。Target Scan软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-92a和PIAS3的靶向关系。结果随着ox-LDL作用时间和浓度的增加,RAW264.7细胞中miR-92a表达升高;双荧光素酶报告实验验证PIAS3是miR-92a的靶基因。采用ox-LDL处理后RAW264.7细胞中miR-92a、i NOS、IL-6、IL-1β、p-STAT3表达升高,NO释放增多和细胞内脂滴升高,而PIAS3的表达下降。这种调控作用可被anti-miR-92a所抑制;而沉默PIAS3后,anti-miR-92a的这一抑制作用得以恢复。结论下调miR-92a可通过调控PIAS3抑制ox-LDL诱导RAW264.7细胞炎症介质分泌和脂质蓄积。     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞杀伤作用

目的探讨树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法采用胃癌患者自身血液中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),经体外诱导分别扩增出DC和CIK细胞,二者共同培养后,利用MTT法检测DC细胞联合CIK细胞体外杀伤人胃癌细胞株(MNK-45、MNK-28、SG-7901)的活性。结果DC与CIK细胞共培养后得到的细胞群高表达CD3 CD56 ,平均值达到(56.74±7.63)%。通过彼此相互作用诱导出的细胞群体对胃癌细胞株MNK-45、MNK-28、SG-7901有杀伤作用,且杀伤活性随着效靶比的增加而增强。结论DC与CIK细胞共培养后有很强的增殖能力,对胃癌细胞具有杀伤活性,且其杀伤作用与胃癌细胞类型无相关性。     

DC与CIK或LAK联合对结肠癌细胞株SW480杀伤作用的研究

[目的]研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导或未诱导的杀伤细胞(CIK)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性.提供DC联合CIK或LAK治疗结肠癌的实验依据.[方法]取人外周血分离出单个核细胞(PBMNC),诱导生成DC、CIK、LAK细胞;流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后的表型变化;以CIK+DC细胞、CIK细胞、LAK+DC细胞及LAK细胞作为效应细胞,SW480为靶细胞,以15∶1、30∶1、45∶1为效靶比,LDH释放法测定细胞杀伤试验活性;ELISA检测杀伤试验中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、IL-17的分泌水平.[结果]流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后,其表面分子HLA-DR、CD40、CD80和CD86表达分别平均为90.23％、73.68％、85.96％、57.55％,与未经肿瘤抗原冲击DC比较,DC成熟的表面标志分子表达明显增加(P＜0.01).相同效靶比下,CIK+DC细胞组对SW480的杀伤作用最强,明显高于其他细胞组(P＜0.01);CIK+ DC细胞组在效靶比为45∶1时,杀伤活性最强(P＜0.01);单独CIK细胞组的杀伤活性明显高于LAK+DC细胞组(P＜0.01);LAK+ DC细胞组的杀伤活性明显高于单独LAK细胞组(P＜0.01).效靶比为45∶1时,各杀伤试验细胞组上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17的分泌量,CIK+DC细胞组的IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于其他细胞组(P＜0.05);LAK+DC、单独LAK细胞组IL-2的分泌量明显高于CIK+DC、单独CIK细胞组(P＜0.05);单独CIK细胞组IFN-γ的分泌量明显高于LAK+DC、单独LAK细胞组(P＜0.05).[结论]CIK+DC细胞组对SW480的杀伤活性明显强于单独CIK、LAK+ DC组、单独LAK细胞组.其机制可能是,SW480抗原致敏的DC分泌IFN-γ、IL-12等刺激、诱导CIK细胞的活化和增殖,明显增强CIK细胞杀伤SW480的活性.     

Transdifferentiation of glioblastoma cells into vascular endothelial cells

Glioblastoma (GBM) is the most malignant brain tumor and is highly resistant to intensive combination therapies and anti-VEGF therapies. To assess the resistance mechanism to anti-VEGF therapy, we examined the vessels of GBMs in tumors that were induced by the transduction of p53(+/-) heterozygous mice with lentiviral vectors containing oncogenes and the marker GFP in the hippocampus of GFAP-Cre recombinase (Cre) mice. We were surprised to observe GFP(+) vascular endothelial cells (ECs). Transplantation of mouse GBM cells revealed that the tumor-derived endothelial cells (TDECs) originated from tumor-initiating cells and did not result from cell fusion of ECs and tumor cells. An in vitro differentiation assay suggested that hypoxia is an important factor in the differentiation of tumor cells to ECs and is independent of VEGF. TDEC formation was not only resistant to an anti-VEGF receptor inhibitor in mouse GBMs but it led to an increase in their frequency. A xenograft model of human GBM spheres from clinical specimens and direct clinical samples from patients with GBM also showed the presence of TDECs. We suggest that the TDEC is an important player in the resistance to anti-VEGF therapy, and hence a potential target for GBM therapy.     

Development of hematopoietic cells from embryonic stem cells

Embryonic stem cells are pluripotent stem cells that can differentiate into all somatic cell lineages and germ lineage cells in vivo. In vitro differentiation capacity of the cells is rather limited compared with the in vivo pluripotency. However, differentiation into hematopoietic lineages is easily obtained, and it is a powerful tool to investigate hematopoietic development and differentiation. In this article, we describe a differentiation induction method that we established, the OP9 system, a unique method using the macrophage colony-stimulating factor-deficient stromal cell line OP9. The utility of the OP9 system includes hematopoietic development, differentiation, B-cell formation, osteoclast formation, and so on. The usefulness and limits of embryonic stem cell-derived hematopoietic cells in cell therapy are also discussed.     

Differentiation of mesodermal cells from pluripotent stem cells

The pluripotency of embryonic stem cells has been well demonstrated by a vast variety of studies showing the induction of differentiation into desired cell types that have the potential to be used not only in basic studies but also in medical applications. The induction of mesodermal cells, especially blood cells, from embryonic stem cells is notable from the point of view of transplantation, and the methods for this induction have improved over the last few years, with more defined culture conditions in place. Concurrently, the generation of induced pluripotent stem cells from somatic cells opens the possibility of autologous transplantation. In fact, there are a growing number of reports demonstrating that several mesodermal cells can be differentiated from induced pluripotent stem cells using the same methods used for embryonic stem cells. This review summarizes recent advances in the differentiation of mesodermal cells from embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.     

B-lymphoid cells with attributes of dendritic cells regulate T cells via indoleamine 2,3-dioxygenase

A discrete population of splenocytes with attributes of dendritic cells (DCs) and coexpressing the B-cell marker CD19 is uniquely competent to express the T-cell regulatory enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) in mice treated with TLR9 ligands (CpGs). Here we show that IDO-competent cells express the B-lineage commitment factor Pax5 and surface immunoglobulins. CD19 ablation abrogated IDO-dependent T-cell suppression by DCs, even though cells with phenotypic attributes matching IDO-competent cells developed normally and expressed IDO in response to interferon γ. Consequently, DCs and regulatory T cells (Tregs) did not acquire T-cell regulatory functions after TLR9 ligation, providing an alternative perspective on the known T-cell regulatory defects of CD19-deficient mice. DCs from B-cell–deficient mice expressed IDO and mediated T-cell suppression after TLR9 ligation, indicating that B-cell attributes were not essential for B-lymphoid IDO-competent cells to regulate T cells. Thus, IDO-competent cells constitute a distinctive B-lymphoid cell type with quintessential T-cell regulatory attributes and phenotypic features of both B cells and DCs.     

造血干细胞分化成肝细胞的可能性

来自骨髓的造血干细胞具有干细胞的多向分化的潜能.近年来有研究表明,在特定微环境下,造血干细胞能诱导分化成肝细胞,也有研究对此表示争议.本文对造血干细胞是否能有效诱导分化成肝细胞作简要综述.