棕榈酸对EA.hy926细胞胆固醇代谢相关基因表达的影响及机制

目的研究棕榈酸(PA)对内皮细胞株EA.hy926胆固醇代谢的影响,检测胆固醇流出、胆固醇胞内转化、脂蛋白摄入以及信号通路相关基因表达的变化。方法体外培养内皮细胞株EA.hy926,分为白蛋白(ALB)对照组和PA处理组。采用实时荧光定量PCR法检测ATP结合盒转运体A1(ABCA1)、ABCG1、27-羟化酶、清道夫受体A1(SR-A1)、SR-B1、CD36、凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)、肝X受体α(LXRα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达变化。结果和ALB对照组相比,10、20、30μmol/L PA处理组ABCG1 mRNA水平显著下降(P0.01),20、30μmol/L PA处理组CD36、LOX-1 mRNA水平显著升高(P0.05)。与ALB对照组相比,10、20、30μmol/L PA处理组LXRαmRNA水平显著下降(P0.001、P0.05、P0.001),10μmol/L PA处理组PPARγmRNA水平显著下降(P0.05)。而10、20、30μmol/L PA处理EA.hy926细胞未显著影响ABCA1、SR-A1、SR-B1、27-羟化酶的表达。结论 PA能够改变内皮细胞EA.hy926细胞胆固醇流出和脂蛋白摄入相关基因的表达,其机制与LXRα和PPARγ信号途径有关。     

姜黄素抑制棕榈酸诱导的巨噬细胞炎症反应的机制研究

目的探讨姜黄素抑制棕榈酸诱导的巨噬细胞炎症反应的作用机制。方法以0、250、500μmol／L棕榈酸干预小鼠巨噬细胞RAW264．724h,观察细胞形态,逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中受体相互作用蛋白140（RIPl40）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、白细胞介素-6（IL-6）mRNA水平,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测上清中TNF-a、IL-6水平;噻唑蓝法（MTr）确定姜黄素作用RAW264．7细胞的最佳时间和浓度;细胞分为姜黄素组和对照组,分别给予20μmol／L姜黄素和二甲基亚砜（DMSO）预处理1h后,均给予500μmol／L棕榈酸作用24h,观察细胞形态并检测细胞中RIPl40、TNF-a、IL-6mRNA水平和上清中TNF-a、IL-6浓度。采用单因素方差分析和t检验对研究数据进行统计检验。结果500μmol／L棕榈酸组RIPl40mRNA表达较0μmol／L组显著升高（3．40±0．51比1．01±0．21,t=7．436,P〈0．01）;0、250、500μmol／L棕榈酸组TNF-amRNA（1．00±0．03、1．79±0．12、2．16±0．13）和蛋白[（197±25）、（371±10）、（485±17）ng／L]、IL-6mRNA（1．00±0．51、2．55±0．15、2．59±0．17）和蛋白[（953±66）、（1081±36）、（1182±18）ng／L]与棕榈酸剂量明显相关（F=99．308、187．049、152．958、26．594,均P〈0．01）;棕榈酸处理后,细胞变圆、皱缩甚至崩解;姜黄素作用RAW264．7细胞的最佳时间为1h,最佳浓度为20ixmol／L;姜黄素组与对照组相比,RIPl40mRNA（1．00±0．05比0．63±0．01,t=一13．79,P〈0．01）、TNF-amRNA（0．64±0．11比1．00±0．07,t=一4．532,P〈0．05）和蛋白[（322±12）比（485±17）ng／L,t=一13．577,P〈0．01]、IL-6mRNA（0．57±0．05比1．00±0．02,t=一14．167,P〈0．01）和蛋白[（241±47）比（1182±18）ng／L,t=一44．810,P〈0．01]均显著降低,而细胞形态正常,细胞问仍有连接融合。结论RIPl40可能参与姜黄素抑制棕榈酸诱导的炎症反应过程。     

阿托伐他汀钙对EA.hy926细胞全基因表达谱的影响及生物信息学分析

目的探讨阿托伐他汀钙对体外培养人脐静脉内皮细胞EA.hy926细胞基因表达谱的影响及作用的分子机制。方法取EA.hy926细胞分实验组和对照组,实验组采用10μmol/L阿托伐他汀钙体外干预人脐静脉内皮细胞EA.hy926 24h,用Affymetrix HG-U133plus 2.0全基因组表达芯片检测阿托伐他汀钙对EA.hy926细胞基因表达谱的影响。并运用基因富集分析(GSEA)软件、DAVID基因功能聚类分析软件及Cmap数据库对芯片数据进行分析,对相关靶基因进行实时定量PCR验证。结果与对照组比较,实验组基因芯片分析筛选出差异表达倍数>2倍的基因649个,其中上调基因295个,下调基因354个。经DAVID及GSEA基因富集分析显示,阿托伐他汀钙广泛下调了细胞周期调控相关基因,上调了Kruppel样转录因子等血管保护基因,Cmap数据库分析显示,阿托伐他汀钙与组蛋白去乙酰化酶抑制剂及白藜芦醇呈正相关的联强度高。结论阿托伐他汀钙从多角度发挥抗动脉粥样硬化作用,作用机制可能与组蛋白去乙酰化酶抑制剂及白藜芦醇相似。     

Ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响

目的探讨Ghrelin能否抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡。方法大鼠主动脉内皮细胞分别在含0.3 mmol/L棕榈酸的脂性培养基中孵育24 h,培养基中加或不加Ghrelin,应用MTT法检测细胞活性,Ho-echst 33258及流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,分光光度计检测Caspase-3活性,Western Blot检测Bcl-2和Bax表达。结果棕榈酸降低细胞活性,使细胞凋亡增加至30.03%,与对照组(5.01%)相比差异有统计学意义(P<0.01),棕榈酸增加Caspase-3活性,使Bcl-2/Bax比率下降。Ghrelin能够浓度依赖性增加细胞活性,10 nmol/L是最低有效浓度,100 nmol/L时作用最显著。Ghrelin能抑制棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡,使凋亡率降至10.03%(P<0.05)。同时Ghrelin降低Caspase-3活性并增加Bcl-2/Bax比率。结论 Ghrelin可以抑制棕榈酸诱导的血管内皮细胞凋亡,可能在棕榈酸诱导的内皮细胞损伤中发挥保护作用。     

棕榈酸对雨蛙肽诱导的大鼠胰腺腺泡细胞炎症早期基因表达谱的影响

背景：高三酰甘油血症是急性胰腺炎的发病原因之一。血浆中增多的游离脂肪酸（FFA）可损伤多种细胞，导致细胞功能障碍，可能在高三酰甘油血症性急性胰腺炎的发生、发展中起重要作用。目的：探讨饮食中的主要FFA棕榈酸对雨蛙肽诱导的大鼠胰腺腺泡细胞炎症早期基因表达谱的影响。方法：以胶原酶消化法分离大鼠胰腺腺泡细胞，将细胞分为3组，雨蛙肽组加入终浓度为100nmol／L的雨蛙肽，雨蛙肽＋棕榈酸组加入相同剂量的雨蛙肽和终浓度为1mmol/L的棕榈酸，正常对照组不予处理。培养3h后提取细胞总RNA，应用含15000余条大鼠基因的大鼠Affymetrix 230A基因芯片检测基因表达谱的变化。结果：雨蛙肽＋棕榈酸组较雨蛙肽组出现30条上调基因和15条下调基因，其功能涉及细胞信号转导、转录、脂质代谢、蛋白修饰等不同层次。结论：棕榈酸可能通过影响大鼠炎症胰腺腺泡细胞多种结构和功能基因的表达而加重其损伤。     

槲皮素对软脂酸诱导的EA.hy926细胞eNOS合成的影响

目的研究槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞e NOS合成的影响。方法体外培养EA.hy926细胞,分正常对照组、模型组、槲皮素组、二甲双胍组,采用RT-PCR法及免疫组化法,测定各组细胞e NOS m RNA和蛋白表达。结果模型组细胞e NOS m RNA和蛋白表达显著低于正常对照组(P0.05),药物组与模型组相比e NOS m RNA及蛋白表达显著增加(P0.05),药物组间差异无统计学意义(P0.05)。结论槲皮素对软脂酸诱导EA.hy926细胞e NOS合成具有显著促进作用。     

阿司匹林抑制动脉粥样硬化炎症反应机制的初步探讨

目的利用高胆固醇饮食(2%)并免疫损伤诱发的主动脉粥样硬化模型,评价阿司匹林(ASA)能否抑制动脉粥样硬化炎症反应并探讨其相关机制.方法将40只建立起主动脉粥样硬化模型的新西兰大白兔随机分为ASA小[4 mg/(kg·d)]、中[12 mg/(kg·d)]、大[20mg/(kg·d)]剂量和高胆固醇4组,另设对照组,每组各10只.测定指标包括0、2、12周时的血脂、12周时的血清C-反应蛋白(CRP)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞阳性率以及环氧化酶(COX)-1和-2的信使核糖核酸(mRNA)含量.结果与高胆固醇组相比,ASA小、中、大剂量组CRP和MCP-1均显著降低(P均＜0.01);斑块部位平滑肌细胞阳性率减少17.6%、39.4%和57.2%;巨噬细胞阳性率分别减少35.7%、50.7%和64.7%,均有非常显著性差异(P均＜0.01);COX-1和COX-2 mRNA的表达量均显著降低,COX-1 mRNA表达减少30.1%、27.6%和39.9%,COX-2 mRNA表达减少44.7%、57.3%和66.3%.ASA大、中、小剂量组间比较,CRP和MCP-1在大、中剂量组显著低于小剂量组(P＜0.01～0.05),而大、中剂量组间无显著差异(P＞0.05);斑块部位平滑肌细胞和巨噬细胞的阳性率在中剂量组显著低于小剂量组,在大剂量组又显著低于中剂量组(P均＜0.05);不同剂量ASA组间比较,COX-2 mRNA的表达量在大剂量组低于中剂量组(P＜0.01),在中剂量组又低于小剂量组(P＜0.01),而COX-1 mRNA的表达量在大剂量组低于中剂量组(P＜0.01),在中、小剂量组间无显著性差异(P＞0.05).结论ASA能剂量相关地抑制动脉粥样硬化的炎症反应,其分子机制与其对COX-1和COX-2的阻滞作用均有关.     

川芎嗪对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞炎症反应的影响

目的探讨川芎嗪对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞炎症反应的影响及其分子机制。方法体外培养的人冠状动脉内皮细胞,随机分为正常对照组(无干预)、ox-LDL组(50mg/Lox-LDL)、川芎嗪组(1、10、100μmol/L川芎嗪+50mg/Lox-LDL),观察川芎嗪对细胞间黏附分子1(ICAM-1)和环氧酶2基因和蛋白表达的影响;进一步检测与其耦联的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和核转录因子κB(NF-κB)信号通路活化的影响。结果与ox-LDL组比较,川芎嗪(10、100μmol/L)降低ICAM-1的基因表达(1.49±0.26、1.81±0.05比2.36±0.34,P<0.01),抑制环氧酶2的蛋白表达(0.21±0.03、0.13±0.04比0.48±0.01,P<0.05);川芎嗪(1、10μmol/L)降低ICAM-1的蛋白表达(0.16±0.03、0.14±0.02比0.87±0.05),抑制上述黏附分子和炎症因子耦联的信号分子p38MAPK的磷酸化激活(0.30±0.10、0.12±0.06比0.66±0.15),抑制信号分子NF-κB蛋白(0.32±0.08、0.20±0.11比0.62±0.10)表达水平的升高(均P<0.01)。结论川芎嗪具有对抗ox-LDL诱导的内皮细胞炎症和黏附反应,并抑制MAPK和NF-κB信号通路的激活。     

软脂酸对EA.hy926细胞一氧化氮合成的影响及六味地黄丸的干预效应

目的研究软脂酸(PA)对EA.hy926内皮细胞一氧化氮(NO)合成和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表达的影响及六味地黄丸(LWDHP)含药血清的干预作用。方法将培养的EA.hy926细胞分组,采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAPDH)依赖性硝酸盐还原酶法测定细胞裂解上清液NO含量;RT-PCR及Western印迹检测细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PA损伤的细胞裂解液中NO含量减少,与正常对照组比较差异显著(P<0.01)。2.5%LWDHP含药血清组NO含量进一步减少,5%、10%LWDHP含药血清组及二甲双胍(MET)组均能显著增加细胞裂解液中NO含量,与PA组比较有差异显著(P<0.01),但三者之间互相比较无显著性差异(P>0.05)。同时PA组细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达显著减少(P<0.01),LWDHP和MET组细胞内eNOS mRNA和蛋白表达量增加(P<0.01)。结论 LWDHP含药血清能够刺激PA损伤的EA.hy926细胞eNOS mRNA和蛋白的表达,从而有效促进NO的合成,发挥其保护作用。     

动脉粥样硬化发病机制和炎症反应关系研究进展

炎症反应为动脉粥样硬化(AS)发生发展过程中的核心因素,炎症过程中具有标志性的因子已成为评价AS稳定程度的具有预后意义的主要指标。机体炎症反应时释放的生物活性因子,不但可预示血管事件发生的危险性,而且还参与AS相关疾病的发病过程。因此,认识AS病理过程中炎症细胞间的相互作用机制并加以干预,是目前防治AS研究的一个重要方向。     

通心络下调caspase-3蛋白表达及活性抑制软脂酸诱导的人外周血内皮祖细胞凋亡

目的:探讨通心络(tongxinluo,TXL)对软脂酸(palmitic acid,PA)诱导的人外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitor cell,EPCs)凋亡及caspase-3蛋白表达和活性的影响。方法:密度梯度离心法获取人外周血单个核细胞,培养7d后,贴壁细胞分成7组:对照组以M199培养液培养48h;PA各浓度组(共3组)分别用含200,400,800μmol/L PA的M199培养液孵育48h;通心络干预组(共3组)分别先用含100,200,400μmol/L TXL的M199培养液干预2h后,再加入400μmol/L PA孵育48h。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞蛋白,采用Westernblot技术检测caspase-3蛋白表达水平;采用分光光度法检测caspase-3蛋白活性水平。结果:PA呈浓度依赖性诱导EPCs凋亡;加入TXL干预,EPCs细胞凋亡率明显降低;Western blot和分光光度法检测显示,PA组EPCs的caspase-3蛋白表达及活性明显高于对照组,200和400μmol/L TXL干预组明显低于PA组(P0.05)。结论:PA呈浓度依赖性诱导EPCs凋亡,TXL能部分抑制PA的上述作用,其机制与下调caspase-3蛋白表达及活性有关。     

汉滩病毒感染EA.hy926细胞上调固有免疫相关分子表达的研究

目的　探讨汉滩病毒（hantaan virus, HTNV）感染EA.hy926细胞诱导抗病毒固有免疫相关分子的表达,为建立HTNV感染的细胞模型提供依据。方法　将HTNV感染EA.hy926细胞,利用间接免疫荧光和实时荧光定量PCR技术于不同感染时间段,检测EA.hy926细胞中模式识别受体、细胞因子及抗病毒相关分子的mRNA表达水平。结果　HTNV感染EA.hy926细胞后,随着感染时间的持续,核蛋白mRNA相对表达倍数显著上调,且不同感染时间段差异具有统计学意义（P＜0.05）;与未处理组相比,HTNV感染EA.hy926后,Toll样受体3、RIG-I和MDA5模式识别受体mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,IL-6、IL-10、IFN-β和CCL5细胞因子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）,ISG15、MxA、OAS1、IFITM1和IFITM3抗病毒相关分子mRNA相对表达倍数均显著上调（P均＜0.05）。结论　HTNV感染EA.hy926细胞后,可上调抗病毒固有免疫相关分子的表达,该细胞可以作为体外HTNV感染的细胞模型。     

软脂酸通过上调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶表达促进血管内皮细胞凋亡

目的探讨软脂酸(PA)诱导的血管内皮细胞凋亡中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的作用。方法人脐静脉内皮细胞(HUVEC)贴壁培养后分为对照组;PA(200、400、800μmol/L)浓度组(分别为PA200组、PA400组、PA800组);NADPH氧化酶抑制剂apocynin(50、100、200 mol/L)干预组(分别为apo50+PA400组、apo100+PA400组、apo200+PA400组)。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞蛋白,采用Westernblot技术检测NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白表达的水平。倒置共聚焦荧光显微镜检测活性氧的产生。结果 PA呈浓度依赖性诱导HUVEC凋亡;与对照组比较,PA400、PA800组HUVEC凋亡率明显升高,P47phox蛋白表达明显增强(P<0.05),PA400组活性氧产生明显升高(P<0.05);与PA400组比较,apo100+PA400组、apo200+PA400组HUVEC凋亡率明显降低,p47phox蛋白表达明显减弱,活性氧产生明显降低(P<0.05)。结论 PA呈浓度依赖性诱导HUVEC凋亡,apocynin能部分抑制PA的上述作用,其机制与下调NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白表达及活性氧产生有关。     

Cytoprotective effects of melatonin on astroglial cells subjected to palmitic acid treatment in vitro

Melatonin, an endogenously produced neurohormone secreted mainly by the pineal gland, has a variety of physiological functions and neuroprotective effects. Saturated fatty acids (SFAs) have been known to induce neurotoxicity and oxidative stress in central nervous system injuries and neurodegenerative pathologies. However, the effect of melatonin on SFAs-induced cytotoxicity in astroglial cells, if any, has remained to be explored. This study reports that in primary cultured astroglial cells, melatonin significantly attenuated palmitic acid (PA)-induced cytotoxicity in a concentration- and time-dependent manner. Additionally, melatonin effectively suppressed PA-induced reactive oxygen species generation and prevented PA-induced apoptosis whereby the rise in Bax/Bcl-2 ratio and caspase-3 activation in astroglial cells was inhibited. However, it did not appear to exert an obvious effect on PA-induced intracellular calcium overload. Luzindole, a nonselective melatonin receptor antagonist, attenuated melatonin's promotion effect of cell survival and Stat3 phosphorylation, indicating that melatonin exerts its protective property in astroglial cells, at least in part, through the activation of membrane receptors and then Stat3 signaling pathway. Finally, melatonin had an inhibitory effect on the pro-inflammatory cytokine gene expression. The results suggest that melatonin may be an effective cytoprotective agent against PA-based cytotoxicity through modulating cell survival and inflammatory response in astroglial cells.     

棕榈酸对肝癌HepG2细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨棕榈酸对肝癌HepG2细胞自噬和凋亡的影响。方法采用含浓度为800txmol／L棕榈酸的DMEM高糖培养基培养肝癌HepG2细胞24h,向HepG2细胞转染绿色荧光蛋白（GFP）-LC3质粒,通过观察LC3II绿色荧光斑点确定自噬发生情况。利用BafAl抑制自噬后,采用M30免疫荧光检测细胞凋亡情况。结果棕榈酸刺激24h明显增加自噬及凋亡细胞数量。阻断自噬,棕榈酸刺激引起的HepG2细胞凋亡水平明显增加。结论棕榈酸可刺激自噬发生,该自噬对肝癌HepG2细胞有一定的保护作用。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞E-选择素、IL-6分泌的影响

目的探讨同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）对人脐静脉内皮细胞E-选择素、白细胞介素6（IL6）分泌的影响。方法在人脐静脉内皮细胞ECV304培养基中加入不同浓度Hcy,孵育不同时间,用ELISA法分别测定培养上清液中E-选择素及IL6的含量。结果终浓度为250μmol/L的Hcy孵育内皮细胞,E选择素的分泌在4h显著上调,6h达峰值;IL6的分泌在6h开始升高,24h达峰值,之后随着时间的延长逐渐下降。Hcy呈浓度依赖性（50μmol/L～500μmol/L）促进内皮细胞E选择素及IL6的分泌。结论Hcy能刺激血管内皮细胞分泌E选择素及IL6。     

固有免疫介导的炎症反应在动脉粥样硬化发病机制中的研究进展

动脉粥样硬化是常见慢性心脑血管疾病的病理基础,其病变始于血管内皮细胞构成的天然屏障功能障碍,由各种损伤因子影响内皮细胞Caspase-1/Sirt1/AP-1、SREBP2/NOX2/NLRP3、KLF2/FoxP1/NLRP3、NFAT5/NLRP3等通路信号转导、相关炎症基因表达,激活内皮细胞,继而单核细胞浸润主动脉壁内膜下并分化为巨噬细胞,引起相应内皮激活的固有免疫反应,在NLRP3/ASC/Caspase-1炎性小体途径激活后,使促炎症细胞因子IL-1β、IL-18释放增加,介导下游炎症因子、趋化因子等表达增加,促进动脉粥样硬化炎症反应;血管壁持续慢性炎症反应使血管平滑肌细胞表型转变,促进动脉粥样硬化斑块形成,还使斑块成分发生改变、易损性增加,斑块微钙化则增加了斑块处血管应力,破裂危险增加。本文综述了固有免疫介导的动脉粥样硬化炎症机制研究现状,为动脉粥样硬化抗炎药物研发提供思路以及促进抗动脉粥样硬化研究的实验设计。