超声微泡造影剂介导EGFP对兔视网膜的转染效率

目的 探讨在不同能量超声和一定剂量微泡作用下,超声微泡造影剂介导下增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒对兔视网膜转染的效率、安全性以及可行性.方法 将30只新西兰大白兔随机分为6组:质粒组(A组)、质粒+微泡组(B组)、质粒+超声照射组①(C组)、质粒+超声照射组②(D组)、质粒+微泡+超声照射组①(E组)、质粒+微泡+超声照射组②(F组).将1 ml pEGFP-C1质粒与1 ml SonoVue微泡造影剂混合,由耳缘静脉注入,分别用0.5、1.0 W/cm2超声波辐照眼球.转染7天后行视网膜光镜及透射电镜检查,观察质粒、微泡及超声照射对视网膜有无损害,并在荧光显微镜下观察pEGFP-C1质粒表达情况.结果 光镜及透射电镜结果显示质粒、微泡及超声照射对视网膜无损害.A～D组均可见少量绿色荧光表达(P均＞0.05),E、F组的荧光表达较强,明显高于其他4组(P均＜0.05),E、F组荧光强度差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 在一定能量的超声照射下,超声微泡造影剂能够提高携带EGFP质粒在兔视网膜的转染效率.     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠骨骼肌

目的 探讨增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的条件下表达的可行性.方法 20只清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机均分为裸质粒组(P)、质粒 超声组(P U)、质粒 微泡组(P M)和质粒 超声 微泡组(P U M)共4组进行实验.选择增强绿色荧光蛋白质粒与白蛋白微泡相混合,以超声介导白蛋白微泡破裂的方法 对大鼠骨骼肌行基因转染,转染7 d后,荧光显微镜下观察质粒在大鼠脊斜肌组织中的表达情况.结果 P、P M组大鼠脊斜肌组织中均未见增强型绿色荧光蛋白表达;P U组可见少量微弱绿色荧光,荧光强度较P和P M组明显增强(P<0.05),P U M组可见明显特异性增强型绿色荧光蛋白表达,荧光强度约为P、P M组的10倍,P U组的3倍(P<0.05);P U M组转染率为(42.72±10.07)%较之P U组(13.62±6.17)%明显增高(P<0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂造成的脊斜肌组织毛细血管通透性的增加,是血管内基因成功跨越内膜屏障的主要途径之一.     

超声微泡介导EGFP 质粒对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的实验研究

目的探讨不同浓度的超声微泡造影剂，在不同声强的超声辐照下，介导DNA质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移奠定基础。方法将培养的RB细胞分别予以超声条件为0．25，0．5，0．75，1．0，1．25W／cm^2，60S的连续波辐照，微泡造影剂浓度为1％，100．4，20％，30％，以筛选出对RB细胞活性无明显抑制的最适超声声强、辐照时间和微泡浓度。根据以上筛选条件，转染EGFP基因入RB细胞，24～48h后，在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，并用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测。结果声强〈0．75W／cm^2（60s），以及微泡浓度〈20％时，对RB细胞的活性无明显抑制。当微泡浓度10％，超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2时，介导的DNA质粒对RB细胞转染具有较高的转染效率，明显高于其他实验组。超声声强为0．5W／cm^2或0．75W／cm^2介导的转染效率，在统计学上差异无显著性意义。结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声微泡介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤细胞与传统转染方法效率对比

目的探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下，介导EGFP质粒转染视网膜母细胞瘤（RB）细胞的效率及可行性。 方法将RB细胞分为6组，1组以一定能量的超声波辐照，2组加适当剂量的微泡造影剂，3组加入质粒，4组加入质粒与微泡，5组加入质粒、微泡，并用一定能量的超声辐照，6组予脂质体与质粒。转染24-48h后观察EGFP表达，并用RT—PCR进行检测。同时对1、2组予以染色。 结果超声微泡介导的DNA质粒对RB细胞的转染效率，与脂质体介导的质粒转染效率相似，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对RB细胞的活性无明显抑制。 结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高DNA质粒在RB细胞中的转染效率。     

超声微泡造影剂介导PEDF质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管(CNV)效果.方法 氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型.将24只造模成功的CNV大鼠分为2组:①空白组,②超声辐照微泡转染组.于转染后14 d,分别进行眼底荧光血管造影(FFA),RT-PCR和免疫荧光检查.结果 转染后14天超声微泡能介导PEDF质粒对大鼠视网膜、脉络膜的转染,并且对CNV有抑制作用.结论 利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜、脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用.     

超声微泡造影剂介导PEDF基因转染大鼠视网膜与传统转染比较的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂与脂质体介导色素上皮源性因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管（choroidal neovascu larization,CNV）效果。方法氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型。将36只CNV大鼠分为3组：（1）空白组,（2）超声辐照微泡转染组,（3）脂质体转染组。于转染后7、14、28d,分别进行荧光眼底血管造影（fundus flourascent angiography,FFA）,RT-PCR检测。结果转染后7、14d超声微泡介导PEDF质粒对大鼠视网膜的转染效率与脂质体介导的转染效率相似,但转染后28d两者转染效率差异有显著性。超声微泡与脂质体介导PEDF质粒转染对CNV有抑制作用。结论利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用。     

超声介导微泡造影剂促进HSV-TK基因转染抑制小鼠肝癌移植瘤的实验研究

目的 探讨超声辐照微泡造影剂介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)自杀基因系统转染小鼠肝癌组织的有效性.方法 小鼠肝癌皮下移植瘤,尾静脉注入HSV-TK,添加或不添加Sono Vue,脉冲多普勒超声(1MHz、2W/cm2 、5min)辐照,第2天重复治疗1次.24h后荷瘤鼠腹腔注射更昔洛韦(GCV),连续10d,绘制肿瘤生长曲线,观测荷瘤鼠生存时间,半定量RT-PCR分析肿瘤内TK mRNA的表达,TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡.结果 与单纯超声辐照组比较,超声(US)和Sono Vue组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),小鼠的平均生存时间延长(P<0.05),肿瘤内TK mRNA的表达增多(P<0.05),肿瘤细胞凋亡指数增高(P<0.05).结论 超声辐照Sono Vue可有效介导HSV-TK基因发挥抗瘤效应.     

超声微泡造影剂介导VEGF基因治疗大鼠心肌缺血的实验性研究

目的：探讨超声微泡造影剂介导血管内皮生长因子（VEGF）基因转染大鼠缺血心肌的有效性。方法：将15只急性心肌梗塞3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只，第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式将pcD2VEGF121基因转染大鼠心肌约6分钟；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2VEGF121基因的造影剂；第三组为对照。2周后，分别行免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白及毛细血管内皮细胞，结果：采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强VEGF基因在大鼠心肌组织内的表达，并可促进缺血心肌组织新生血管，结论：超声微泡造影剂介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

超声微泡造影剂介导基因治疗卵巢癌的研究进展

卵巢癌基因治疗的关键在于如何安全高效地将外源性基因导入细胞。超声微泡造影剂作为新兴的基因转染载体,有望为卵巢癌基因治疗开辟新的路径。本文就超声微泡造影剂在卵巢癌基因治疗中的研究进展进行综述。     

超声微泡介导野生型p53基因转染Y79细胞的实验研究

目的研究超声微泡介导wtp53（wild type p53）基因转染视网膜母细胞瘤（Y79）细胞的效率及作用效果。方法以一定能量的超声介导wtp53转染Y79细胞,分为（1）质粒＋微泡＋超声照射组;（2）质粒＋脂质体组;（3）质粒＋超声照射组;（4）空白对照组。RT-PCR检测wtp53mRNA,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果超声微泡介导的wtp53基因对Y79细胞的转染效率明显高于其他实验组,检测到的细胞凋亡率也明显高于其他组。结论超声微泡可达到高效的基因转染目的,wtp53对Y79细胞有明显抑制生长的作用。     

超声靶向微泡破碎和生物可降解纳米粒

目的 探讨超声靶向微泡破碎(UTMD)的物理靶向和纳米粒的生物靶向联合的双靶向方法细胞内递送siRNAs的效果.方法 制备RGD和非RGD生物可降解纳米粒;L16(45)正交设计筛选超声、微泡、纳米粒的优化参数;实验分成优化参数组、RGD纳米粒组、非RGD纳米粒组和空白对照组;倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察并检测分子探针Cy3标记的siRNAs在细胞内的摄取.结果 RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(93.49±1.37)%和34.28±2.06,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(88.33±1.24)%和30.59±3.93,两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).非RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(71.24±2.80)%和18.39±0.90,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(84.78±2.13)%和27.18±0.91,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 UTMD物理靶向和纳米粒生物靶向联合的双靶向方法不能提高siRNAs的细胞内递送.

Abstract：

Objective To investigate the intracellular delivery of siRNAs through the applications of ultrasound targeted microbubbles destruction(UTMD)and biodegradable nanoparticles carriers.Methods Preparation of nanoparticles with and without RGD sequences,parameters optimization via L16(45)orthogonal design,control experiments in groups of optimization,RGD targeted nanoparticles,non-RGD nanoparticles and blank control, and determinations by inverted fluorescence microscope and flow cytometry were performed.Results The uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of RGD targeted nanoparticle was (93.49±1.37)% and 34.28±2.06 respectively,and that in group of optimization was (88.33±1.24)% and 30.59±3.93 respectively(P＞0.05).Whereas the uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of non-RGD nanoparticles was(71.24±2.80)% and 18.39±0.90 respectively,and that in group of optimization was (84.78±2.13)% and 27.18±0.91 respectively(P＜0.05).ConclusionsThe applications of UTMD with RGD targted nanoparticles cannot increase the intracellular delivery of siRNAs.     

超声定位辐照载pEGFP质粒DNA超声微泡转染新生血管性角膜组织的实验研究

±7.08;B组:97.02±8.31;C组:81.83±9.44),差异有统计学意义(F=23.56,P<0.05).结论 一定声强和时间的辐照下,超声微泡能有效提高质粒DNA在兔新生血管性角膜组织的基因转染率.     

In vivo gene transfer into the ocular ciliary muscle mediated by ultrasound and microbubbles

This study aimed to assess application of ultrasound (US) combined with microbubbles (MB) to transfect the ciliary muscle of rat eyes. Reporter DNA plasmids encoding for Gaussia luciferase, β-galactosidase or the green fluorescent protein (GFP), alone or mixed with 50% Artison MB, were injected into the ciliary muscle, with or without US exposure (US set at 1 MHz, 2 W/cm², 50% duty cycle for 2 min). Luciferase activity was measured in ocular fluids at 7 and 30 days after sonoporation. At 1 week, the US+MB treatment showed a significant increase in luminescence compared with control eyes, injected with plasmid only, with or without MB (×2.6), and, reporter proteins were localized in the ciliary muscle by histochemical analysis. At 1 month, a significant decrease in luciferase activity was observed in all groups. A rise in lens and ciliary muscle temperature was measured during the procedure but did not result in any observable or microscopic damages at 1 and 8 days. The feasibility to transfer gene into the ciliary muscle by US and MB suggests that sonoporation may allow intraocular production of proteins for the treatment of inflammatory, angiogenic and/or degenerative retinal diseases.     

超声微泡介导自杀基因对卵巢癌细胞的抗瘤效应

目的探讨超声微泡介导自杀基因对卵巢癌SKOV3细胞抗瘤效应的机制。方法采用最适超声转染参数,以超声介导微泡转染pORF-HSV1TK质粒,将SKOV3细胞分成6组:阴性对照组(C组)、超声辐照组(U组)、脂质体组(L组,阳性对照组)、脂质体+超声辐照组(L+U组)、脂质体+微泡+超声辐照组(L+M+U组)和微泡+超声辐照组(M+U组)。以RT-PCR检测HSV1TK的表达,以MTT测定各组细胞增殖抑制率。光镜下观察各组转染细胞数量、形态变化,以流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡率及细胞周期。结果L+M+U组HSV1TK基因表达最强,细胞增殖抑制率明显高于其他组(P均<0.05),且光镜下细胞数量减少最多,形态明显异常;其细胞凋亡率为(49.13±0.82)%,且大多数细胞周期被阻断于G1期(P<0.05)。结论超声介导微泡能增强HSV1TK/GCV系统抑制SKOV3增殖和诱导SKOV3凋亡的作用,且将SKOV3细胞周期阻断在G1期,从而发挥抗瘤效应。     

超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染

目的探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c小鼠心肌绿色荧光蛋白基因(EG-FP)转染的可行性和应用价值。方法实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒 超声辐照组(P US)、质粒 SonoVue 超声辐照组(P UTMD)、质粒 PEI组(P PEI)、质粒 PEI 超声辐照组(P PEI US)、质粒 PEI SonoVue 超声辐照组(P PEI UTMD)。由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析。结果电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物。非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达最强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显。P PEI UTMD组的转染率最高,荧光强度最强。结论UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法。     

超声造影剂在肝癌基因治疗中的靶向性实验研究

目的 探讨结合了肝细胞配体的超声造影剂在超声辐照下介导目的 基因转染肝癌细胞的可行性,寻找一种新的基因靶向导入方法.方法 制备肝细胞表面特异性配体半乳糖基化多聚赖氨酸(GPLL),并对产物进行红外光谱分析.将c-myc基因反义寡核苷酸(ASODN)、G-PLL与SonoVue微泡三者偶联,在超声波介导下,促使c-myc ASODN转染人肝细胞癌SMMC-7721细胞及肺腺癌A-549细胞(作对照),实验结束后行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以观察不同组问c-myc基因的表达情况.结果 超声介导微泡破裂可增加c-myc ASODN在SMMC-7721细胞和A-549细胞中的表达;SMMC-7721细胞加入G-PLL组中c-myc基因表达水平显著降低,差异有统计学意义(P＜0.01),而A-549细胞中加入与未加入G-PLL组间c-myc基因表达量的差异无统计学性意义(P＞0.05).结论 超声介导微泡造影剂破裂的方法可促进基因的转染,而超声联合肝细胞受体介导的微泡造影剂则更具有肝细胞靶向性,能有效地促进目的 基因在肝癌细胞中的表达,为肝癌基因治疗提供了新的途径.     

超声波介导微泡破裂促EGFP基因转染大鼠脑组织的实验研究

目的 探讨超声波介导微泡造影剂破裂促外源基因在中枢神经系统转染的可行性.方法 15只大鼠分3组,1组经股静脉输入含绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)的造影剂0.8 ml,立即用超声波照射大鼠颅骨3 min;第2组输入相同的造影剂0.8 ml,不采用超声波照射;第3组输入不含造影剂的pEGFP 0.2 ml,立即超声波照射3 min.48 h后处死大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 只在股静脉输入含pEGFP的造影剂,并经超声波照射的大鼠微血管壁上观察到绿色荧光蛋白表达.结论 以微泡造影剂为基因载体,通过超声波靶向破坏微泡,有可能在脑血管内皮细胞中获得基因转染.