许旺细胞源神经营养因子对发育期运动神经元效应的实验研究

目的 研究许旺细胞源神经营养因子对发育期运动神经元的效应。方法 14只新生SD大鼠切断一侧面神经后随机分为实验组和对照组，实验组，局部用许旺细胞源神经营养因子(10μg/d)1周，对照组予等量PRS。观察面神经核中运动神经元数量、形态。结果实验组运动神经元数量、形态均优于对照组。结论 发育期面神经切断后，应用许旺细胞源神经营养因子可维持运动神经元存活。     

许旺细胞源神经营养因子的亚细胞定位及初步分布

目的 观察许旺细胞源神经营养因子的超微结构定位,探索其在神经、皮肤和肌肉中的分布以及神经损伤前后量的变化。方法 （1）胶体金标记免疫电镜法对预损伤2周大鼠坐骨神经超薄切片进行许旺细胞源神经营养因子的亚细胞定位;（2）免疫金银染色法对正常及损伤2周后的坐骨神经、肌肉和皮肤进行许旺细胞源神经营养因子的标记并观察量的变化。结果 （1）在许旺细胞胸浆中有明显的均匀圆形的致密金颗粒附着,但大量存在于内质钢和高尔基体上;（2）对照组、正常及失神经支配肌肉组为（－）,正常神经组为（＋）,正常皮肤组为（＋＋）,变性神经组和失神经支配皮肤组为（＋＋＋）。结论 （1）许旺细胞中,内质网可合成许旺细胞源神经营养因子,并且在高尔基体加工;（2）神经和皮肤中存在有许旺细胞源神经营养因子表达。正常皮肤中许旺细胞源神经营养因子含量高于正常神经,失神经支配皮肤中许旺细胞源神经营养因子含量相当于变性神经。     

许旺细胞源神经营养因子受体在脊髓组织中的分布研究

目的　探讨脊髓组织中是否存在许旺细胞源神经营养因子 (SDNF)受体及其在亚细胞水平的分布情况。　方法　应用放射性配体结合法检测脊髓中1 2 5 I- SDNF的特异性结合。　结果　 (1)脊髓组织 1 2 5 I- SDNF特异结合的最大容量 (Bmax)为 (2 .86± 0 .2 2 ) fmol/ mg蛋白 ;平衡解离常数 (Kd)为(4 9.4± 6 .5 ) pmol/ L;(2 )动力学分析显示 K1 为 (9,2± 0 .7)× 10 7M- 1 × min- 1 ,K- 1 为 (4 .2± 0 .5 )× 10 - 3min- 1 ;(3)特异性分析表明对 SDNF高度特异性 ;(4 )亚细胞分布 :特异结合位点以微粒体膜含量最高。　结论　脊髓中存在 SDNF的受体 ,表明脊髓为 SDNF的靶组织     

许旺细胞源神经营养因子在运动神经元轴突逆行运输的研究

目的：研究许旺细胞源神经营养因子能否被脊髓运动神经元逆行运输。方法：氯氨T氧化法标记许旺细胞源神经营养因子，新生SD大鼠经一侧小腿肌内注射^125I标记的许旺细胞源神经营养因子，测一左、右侧腰段脊髓的放射性记数。结果：注射侧腰段脊髓放射性记数明显高于对侧。结论：脊髓运动神经元可以逆行运输许旺细胞源神经营养因子。     

大鼠坐骨神经损伤后脊髓及坐骨神经中睫状神经营养因子及其受体mRNA的表达

目的　探讨不同年龄大鼠坐骨神经损伤再生过程中 ,脊髓及坐骨神经睫状神经营养因子 (CNTF)及其受体α(CNTFRα)mRNA变化。方法　幼年、成年及老年大鼠各 96只 ,随机分为正常组 (1 2只 )和实验组 (84只 ) ,实验组大鼠切除右侧长 6mm的坐骨神经 ,分为伤后 1、3d和 1、2、4、8、1 2周组。利用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)及原位杂交法检测脊髓及坐骨神经中CNTF、CNTFRαmRNA的表达变化。结果　原位杂交及RT PCR结果显示 ,各年龄组大鼠伤后损伤侧脊髓和伤侧神经CNTFR及CNTFRαmRNA表达均较正常组及未伤侧显著升高 (P <0 .0 5) ,4周达最高峰 ;伤侧近、远端神经中CNTFmRNA 1d～ 1周表达较正常组及未伤侧减低 (P <0 .0 5) ,2周后开始升高 ,4周达高峰 (近端 :1 .59± 0 .1 3、1 .1 9± 0 .1 7和 0 .69± 0 .0 4 ,远端 :1 .1 3±0 .1 6、0 .84± 0 .0 6和 0 .57± 0 .0 3 ,P <0 .0 5)。其中幼年鼠变化最大 ,成年鼠次之 ,老年鼠最弱 ,近端较远端神经有变化大的趋势。结论　不同年龄大鼠坐骨神经损伤后脊髓、神经中CNTF及CNTFRαmRNA表达显著升高。     

许旺细胞源神经营养因子对脊髓前角运动神经元的保护作用

目的 了解许旺细胞源神经营养因子对神经损伤所致脊髓前角运动神经元死亡的保护作用。方法 选用出生３周ＳＤ鼠切断坐骨神经,神经近侧行旺细胞源神经营养因子或生理盐水,４周后观察腰４－５节段脊髓前角运动神经元的存活率和一氧化氮合成酶表达情况。结果术后４周,营养因子组神经元的存活率是９３．４％,生理盐一是５９．６％,两组一氧化氮合酶表达均未见增加。结论 许旺细胞源神经营养因子对员的俏髓前角运动神经元有明显     

许旺细胞源神经营养蛋白受体的初步定位

目的探讨脊髓前角运动神经元是否存在许旺细胞源神经营养蛋白的受体。方法采用放射性配体结合分析法,对许旺细胞源神经营养蛋白进行１２５Ｉ标记,以１２５Ｉ标记的许旺细胞源神经营养蛋白（１２５Ｉ－ＳＣＤＮＴＰ）为配体,与ＳＤ胚鼠的脊髓前角运动神经元进行受体结合分析。结果（１）１２５Ｉ－ＳＣＤＮＴＰ特异结合最大结合容量为（６．１±０．４８）ｆｍｏｌ／１０６ｃｅｌｓ,平衡解离常数为（３．８２±０．６０）ｐｍｏｌ／Ｌ;（２）动力学分析显示ｋ１＝（８．０３±０．３２）×１０８ｍｏｌ－１·Ｌ·ｍｉｎ－１,ｋ－１＝（２．６２±０．８２）×１０－３ｍｉｎ－１;（３）特异性分析表明许旺细胞源神经营养蛋白与运动神经元的结合具有高度特异性。结论在ＳＤ胚鼠的脊髓前角运动神元上存在着高亲和力许旺细胞源神经营养蛋白的受体。     

用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子的实验研究

目的：用Iodogen法标记许旺细胞源神经营养因子（SDNF）,以便下一步进行了SDNF在组织的受体的研究。方法：先将Iodogen涂布于小瓶内,加入SDNF和Na^128I溶液,摇匀,在室温下反应6min,滴入Sephadex LH20柱,分步收集而成SDNF放射性碘标记物。结果：本法可获得的SDNF放射性碘标记物可达99．7％放化纯度,SDNF的神经营养活性和免疫活性没有下降,能在－80℃保存条件下较稳定,符合进行SDNF受体分析的要求。结论：用Iodogen法标记SDNF方法简单,6min内便完成,既省时又达到较高的标记率,比通常用氯胺T法容易控制,其反应交易好得多。     

大鼠坐骨神经损伤后神经元细胞凋亡的初步观察

目的　用TUNEL法观察成年鼠周围神经损伤后 ,脊髓运动神经元和背根神经节感觉神经元的凋亡。方法　 2 1只雄性SD大白鼠 ,按术式随机分成两组。A组 :坐骨神经切断加双重结扎 ;B组 :坐骨神经挤压伤。分别于术后 7、14、2 8d取L4～ 6 脊髓 ,L5 背根神经节 ,用TUNEL法标记凋亡的神经元。结果　结扎组和挤压伤组均出现凋亡细胞。结扎组在术后 14d、2 8d时间点上 ,检出的凋亡细胞明显多于挤压组 (P <0 .0 5 ) ,7d时无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　周围神经损伤后导致神经元死亡的方式为凋亡。靶器官分泌的神经营养因子对神经元有保护作用     

许旺细胞源运动神经营养因子单克隆抗体的制备

目的获得针对许旺细胞源神经营养因子（SDNF）的单克隆抗体。方法SDNF免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与同系小鼠SP2／O—Ag14骨髓瘤细胞按1：5比例进行融合，间接ELISA法筛选阳性克隆，有限稀释法进行克隆化培养，制备腹水抗体。结果获得4株能稳定分泌抗体的细胞株6D3、B8、C9E9、A6C6，效价为1：5120。结论所获得的4株杂交瘤细胞株均有较强稳定分泌抗BDNF单克隆抗体的能力，这为进一步的研究打下了基础。     

雪旺细胞源神经营养因子在大鼠生长发育腰髓中的表达

目的：观察雪旺细胞源神经营养因子在大鼠生长发育腰髓中的表达。方法：取不同年龄的胎鼠、幼鼠及成年鼠的腰髓或相关组织，行常规免疫组织化学研究。结果：雪旺细胞源神经营养因子在成年大鼠腰髓的整个白质和灰质后角Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层有较低表达。雪旺细胞源神经营养因子在胎龄14、15d开始有表达，胚胎时期表达先增高后下降，其中胎龄21d最高。出生后雪旺细胞源神经营养因子（SDNF）在腰髓中表达明显下降，其中第7、12d稍高。结论：SDNF在成年大鼠腰髓（包括背根神经节）有较低表达。SDNF在生长发育的腰髓中表达基本呈逐渐下降趋势。SDNF对大鼠脊髓的发育可能起促进作用。     

许旺细胞源神经营养因子受体在外周神经组织中的分布研究

目的探讨许旺细胞源神经营养因子(SDNF)受体在外周神经的分布状况.方法应用放射性受体结合法检测外周神经组织中125I-SDNF的特异性结合.结果外周神经组织中存在许旺细胞源神经营养因子的特异性结合位点,且该特异性结合位点具有如下特点(1)高亲和力,Kd为(93.11±0.52)pmol/L;(2)低结合容量,Bmax为(8.91±0.26)fmol/mg;(3)可饱和性,饱和曲线呈双曲线型,Scatchard分析的回归线呈直线;(4)可逆性,结合常数K1为(3.91±0.63)×107M-1×min,解离常数K-1为(3.38±0.54)×10-3min-1;(5)特异性.结论外周神经组织中存在许旺细胞源神经营养因子的高亲和力受体,故为许旺细胞源神经营养因子发挥神经营养作用的靶组织.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的　研究胶质细胞源性神经营养因子 (glialcellline derivesneurotrophicfactor ,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用。方法　应用体外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸 聚羟基乙酸共聚物管 (polyCDL lactide co glycolide ,PLGA)构建的神经移植复合体 ,修复大鼠坐骨神经的缺损。 2 0只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为 4组 ,每组 5只。A组 :细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;B组 :雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;C组 :GDNF基因修饰的雪旺细胞 细胞外基质凝胶 PLGA管桥接组 ;D组 :自体神经桥接组。术后 12周检测运动神经传导速度 ,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析。结果　术后 12周 ,坐骨神经的运动神经传导速度 ,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓前角运动神经元存活率等 ,C组均优于A、B组 (P <0 .0 1) ,而与D组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足 ,而达到与自体神经移植相似的效果。     

大鼠外周神经损伤后许旺细胞表型改变的初步探讨

目的 探讨用免疫标记方法观察外周神经修复过程中许旺细胞表型改变的意义.方法 用SD雄性大鼠18只,制作右侧坐骨神经损伤模型,模拟临床常见的神经外膜相对扭转的缝合方法,分别于术后1、2、3周取缝合点远近各2 mm长坐骨神经标本,采用GFAP、Sox2、Krox20抗体标记许旺细胞. 结果 术后各观察点许旺细胞的GFAP表达均高于正常,且1周时表达最为明显;未见Sox2表达;术后1周Krox20几乎不表达,2、3周时Krox20的表达均高于正常,且Krox20阳性的许旺细胞明显增殖. 结论 通过免疫标记方法可以反映修复不同阶段许旺细胞的分化状态;对此现象的观察有利于判断神经再生状态并寻找影响神经再生的因素.     

电刺激对鼠坐骨神经横断后脊髓运动神经元凋亡的影响

目的 观察直流电场对鼠坐骨神经横断后脊髓运动神经元凋亡的影响。方法 鼠坐骨神经横断后,实验组在相应的脊髓节段立即置入直流电刺激器,对照组置入无输出电流的刺激器,分掇于术后1、4、7、14、28d取材,应用HE染色,光镜下进行形态学观察,对脊髓运动神经元计数半进行立体定量分析,用TUNEL染色,对脊髓运动神经元中阳性细胞计数。结果 坐骨社会横断后4、7、14、28d,实验组脊髓运动神经元数量明显多于对照组,术后7、14、28d,实验组脊髓运动神经元体积在于对照组,运动神经元TUNEL染色阳性数明显小于对照组。结论 直流电刺激对坐骨神经横断引起的脊髓运动神经元凋亡具有防治作用。     

Expression of adenovirus-mediated neurotrophin-3 gene in Schwann cells of sciatic nerve in rats

Sｕｃｃｅｓｓｆｕｌｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｒｖｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｆｔｅｒｍｉｃｒｏｓｕｒｇｉｃａｌｒｅｐａｉｒｒｅｑｕｉｒｅｓｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｍｉｃｒｏ ｍｉｌｉｅｕ .Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓ(ＮＴＦｓ) ,ｍａｉｎｐａｒｔｓｏｆｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｉｃｒｏ ｍｉｌｉｅｕ ,ｈａｖｅｂｅｅｎｓｈｏｗｎｔｏｐｌａｙａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｒｏｐｈｉｃｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａ…     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义.方法 Allen's方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化.结果脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平.结论脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过"胞体-轴突-靶器官"途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药.     

腺病毒介导的NT—3基因在大鼠从骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素 - 3(neurotrophin- 3,NT- 3)基因在大鼠坐骨神 经雪旺细胞 ( Schwann cells,SCs) 的表达.方法 NT- 3重组腺病毒在 293细胞中培养繁殖并 测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染 色检测 NT- 3蛋白的表达,并用 LEICA M550型图像分析仪对坐骨神经切片 NT- 3免疫组化染色 强弱进行定量评价.结果坐骨神经损伤修复后直接注射 Ad- NT- 3,2 d后出现 NT- 3免疫组化 染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7 d时显著增加 ( 与 2 d组相比,P< 0.01),14 d和 28 d时有所下降 ( 与 7 d组相比,P< 0.01),两者差异无显著 性意义 ( P >0.05),但与 2 d组相比,仍维持在较高的水平 ( P< 0.01).而正常坐骨神经、 损伤修复后注射 Ad- LacZ或生理盐水的坐骨神经 NT- 3免疫组化染色结果为阴性.结论 NT- 3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的 SCs并表达 NT- 3蛋白,为腺病毒介导神经 营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据.     

腺病毒介导的 NT- 3基因在大鼠坐骨神经的表达

目的观察腺病毒介导的神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在大鼠坐骨神经雪旺细胞(Schwanncells,SCs)的表达。方法NT-3重组腺病毒在293细胞中培养繁殖并测定滴度后,直接注入大鼠损伤修复的坐骨神经内,不同时间点取材,采用免疫组织化学染色检测NT-3蛋白的表达,并用LEICAM550型图像分析仪对坐骨神经切片NT-3免疫组化染色强弱进行定量评价。结果坐骨神经损伤修复后直接注射Ad-NT-3,2d后出现NT-3免疫组化染色阳性产物,主要位于吻合口附近,阳性产物呈平行条纹状排列,7d时显著增加(与2d组相比,P<0.01),14d和28d时有所下降(与7d组相比,P<0.01),两者差异无显著性意义(P>0.05),但与2d组相比,仍维持在较高的水平(P<0.01)。而正常坐骨神经、损伤修复后注射Ad-LacZ或生理盐水的坐骨神经NT-3免疫组化染色结果为阴性。结论NT-3基因能通过腺病毒介导转入损伤修复后周围神经的SCs并表达NT-3蛋白,为腺病毒介导神经营养因子基因治疗促进周围神经损伤再生提供了初步的理论和实验依据。