pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

pEGFP-VEGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的:构建一种含人血管内皮细胞生长因子121(VEGF121)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在成骨细胞中的表达.方法:从人胎脑文库中,以PCR方法扩增出人VEGF121基因,构建入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染成骨细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;免疫细胞化学及ELISA检测VEGF蛋白的表达.结果:PCR扩增出人VEGF121基因;构建入pEGFP-C1,体外成功转染入成骨细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫细胞化学及ELISA检测到VEGF蛋白的表达.结论:重组质粒pEGFP-VEGF体外转染入成骨细胞后,目的基因能够在细胞有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该种目的基因的成骨细胞进行下一步实验提供了理论支持.     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

bFGF在胃癌中的表达及其临床意义探讨

目的　探讨碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)在胃癌生长、转移中的作用及与临床病理指标的关系。方法　采用ELISA法检测 4 8例胃癌患者、51例胃良性病变患者及 30例健康正常人的血清bFGF表达水平。结果　 1.胃癌组血清bFGF表达值( 42 4 8± 11 73)pg/ml,高于胃良性病变组及健康对照组 (P <0 0 5) ;2 .胃癌组TNM各期中IV期组血清表达值 ( 75 36± 14 78)pg/ml,高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各组 (P <0 0 5)。结论　血清bFGF表达水平与胃癌的侵袭转移有关 ,可以作为判断胃癌恶性程度和预后的指标     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

牛pcDNA3—bFGF真核表达重组体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因真核表达质粒。方法：设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的bFGFcDNA引物，采用PCR法从原核pET3c-bFGF中扩增bFGFcDNA片段，纯化PCR产物，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至pcDNA3，转化感受态大肠杆菌DH5α，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果：经PCR能扩增出483bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论：成功构建了牛bFGF真核表达重组体bFGF-pcDNA。     

bFGF对大鼠成骨细胞膜integrin α2、α5、β1 mRNA表达的调控作用

目的 探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养大鼠成骨细胞膜上整合索(integrin)亚基mRNA表达的影响.方法 用含不同浓度bFGF F12培养基对大鼠成骨细胞进行24 h预孵后,接种于喷砂处理的钛片上,第3 d收集成骨细胞,利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.结果 体外培养的大鼠成骨细胞膜上integrinβ1mRNA表达水平最高,其次为integrin α2,integrinα5相对最低.bFGF能不同程度有效上调成骨细胞integrin α2、α5、β1mRNA的表达,但促进integrin α2,α5、β1mRNA表达的bFGF的有效浓度范围不同.结论 bFGF能促进大鼠成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.     

人生长激素重组载体的构建及其在原代成纤维细胞中的表达

早在1987年，生长激素(GH)基因即被成功克隆，随即开展了基因治疗的有关研究，但其进入临床试验的阻碍主要是缺少一个高效、易操作的基因治疗系统，尤其是靶细胞的问题，尽管传代细胞系易培养，但存在免疫排斥反应和肿瘤形成的危险。本实验以原代小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞，以逆转录病毒为基因表达载体，建立一个可操作的基因治疗系统。     

pBV—IL—6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的 构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。方法 经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。结果 获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０     

碱性成纤维细胞生长因子影响兔成骨细胞增殖与分化的实验研究

目的：研究不同剂量碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF)对兔成骨细胞DNA合成、碱性磷酸酶活性的影响。以探讨b-FGF在骨折修复过程中的作用,方法：采用酶消化分段收集法分离培养兔成骨细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态,免疫组化法检测细胞ALP和I型胶原,酶动力学方法检测碱性磷酸酶活性,应用流式细胞仪进行细胞DNA含量分析。结果：b-FGF可明显促进兔成骨样细胞的DNA合成,但却抑制其碱性磷酸酶的活性。结论：b-FGF对骨折修复起重要作用。但仍需通过与其它生长因子的协同来完善。     

pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0) 的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞HepG2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)构建成pEGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体pEGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。     

VEGF-C真核表达质粒的构建及其真核表达

目的　研究人血管内皮生长因子 C(VEGF- C)基因功能片段的表达功能及表达活性。方法　以前期从人舌癌克隆得到的 VEGF- C功能片段 c DNA和真核表达质粒 pc DNA3.1( )构建重组质粒 ,以阳离子脂质体转染法将其导入舌鳞癌细胞 Tca8113,并检测其表达、分泌功能及体外激活能力。结果　通过将长度约为 110 0 bp的VEGF- C功能片段插入 pc DNA3.1( )的 Eco R 和 Xho 酶切位点之间 ,成功构建出 pc DNA3.1( ) - VEGF- C重组质粒 ,该质粒转染 Tca8113细胞后得到 VEGF- C高表达的舌癌细胞 Vc Tca,转染后的细胞可表达相对分子质量为 5 3× 10 3和 2 9× 10 3的 VEGF- C分子 ,在细胞培养液中可检测到相对分子质量为 2 9× 10 3的 VEGF- C片断。结论　构建的 VEGF- C重组质粒可在真核细胞实现表达 ,并能被分泌和激活     

Bek腺病毒表达载体的构建及其在哺乳类动物细胞中的表达

目的构建Bek腺病毒表达载体并观察该载体在成纤维细胞中转基因表达FGFR2-Ⅲc的情况,为研究骨骼发育打下基础.方法利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Bek腺病毒表达载体;该载体感染成纤维细胞后,通过荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA情况.结果Bek腺病毒表达载体感染成纤维细胞后,成纤维细胞有绿色荧光表达,荧光定量PCR检测表明Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA效果明显(P＜0.05).结论Bek腺病毒表达载体构建成功,能够转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA,为研究骨骼发育和成骨机制提供了基础.     

牛碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及其酵母重组表达质粒的构建

根据已有资料设计并合成引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到牛ｂＦＧＦｃＤＮＡ全序列，经过序列分析后，建立其酵母分泌型表达质粒ｐＶＴ１０２Ｕ／ａ－ｂｂＦＧＦ。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子在烧伤及皮肤损伤创面中的应用

目的　观察重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rh -bFGF)对烧伤及损伤创面愈合的影响。方法　用rh -bFGF喷雾剂 ( 1 5 0AU/cm)进行局部喷涂 ,无菌敷料覆盖包扎。 80例早期烧伤创面采用自身对照法行常规治疗 ,观察同一深度、面积相近的创面的愈合时间 ,同期随机另选择 1 6例损伤后残余肉芽创面者行常规治疗作为对照。结果　治疗组创面愈合时间明显提前 ,经统计学处理 ,有显著性差异 (p <0 .0 1 )。结论　rh -bFGF有明显促进烧伤及皮肤损伤创面愈合的作用     

重组质粒在原核细胞中的转化

基因重组技术中的转化是一个把DNA重组分子用人工的方法导入受体细胞的单元操作过程 ,无论在理论上还是在方式上与自然界中细菌的转化均有不同。它把重组体导入受体菌 ,并改变受体菌的遗传性状 ,常用的方法有Ca2 +诱导转化、PEG介导的原生质体转化、电穿孔法等。 1970年 ,Mandel和Higa发现CaCl2 处理过的大肠杆菌能吸收λ噬菌体DNA ,不久Cohen等人用同样的方法实现质粒DNA转化大肠杆菌〔1〕。 1983年 ,Hanahan使用DMSO(二甲基亚砜 )和DTT(二硫苏糖醇 )诱导产生感受态细胞 ,大大提高了大肠杆菌的转化效率〔2〕。转化过程中首先是D…     

TAZ基因重组质粒的构建与表达

目的构建重组质粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-pEGFP-C2,并应用Western Blot检测TAZ蛋白在细胞内的表达情况,初步探索TAZ分子促进细胞增殖和迁移的作用机制。方法通过PCR扩增获得TAZ基因片段,胶回收后连接T载体,蓝白斑筛选,转化,提质粒,酶切,用T4DNA Ligase连接,亚克隆进入pEGFP-C2和pcDNA3.1获得新的重组质粒,分别转染HEK293细胞,智能型荧光细胞监测仪观察TAZ分子在细胞内的分布情况,Western Blot检测其在细胞内的表达情况。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序证明构建成功,荧光照片显示TAZ分子分布在细胞核和细胞浆中,Western Blot检测结果表明转染有重组质粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293细胞中有大量TAZ蛋白表达。结论成功构建了两种重组质粒,并初步验证了TAZ蛋白的细胞定位,为进一步研究其促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５