pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子bFGF基因真核表达载体,探讨bFGF基因转移治疗视网膜病变的方法.方法:将bFGF和GFP基因克隆到真核表达载体pcDNA3中.结果:酶切及琼脂糖电泳分析 pcFG中含有bFGF和GFP基因.结论:成功的构建了含有绿色荧光蛋白的人碱性成纤维细胞生长因子基因的真核表达载体.     

pcDNA3-Bfgf真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pcDNA3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒,为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经疾病奠定基础.方法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增脑细胞中bFGF基因;载体和RT-PCR产物经BamHI和EcoRI酶切,纯化,T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌,抗生素筛选重组质粒.结果 RT-PCR产物为649bp特异片段,pcDNA3咄FGF重组体菌落PCR产物为649 bp特异片段,测序分析为bFGF基因片段.结论经RT-PCR反应得到特异的bFGF基因片段,并成功构建了大鼠bFGF真核表达载体.     

pcDNA3-bFGF真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建pcDNA3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒，为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经疾病奠定基础。方法 建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增脑细胞中bFGF基因；载体和RT-PCR产物经BamHl和EcoRI酶切，纯化，T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，抗生素筛选重组质粒。结果 RT-PCR产物为649bp特异片段，pcDNA3-bFGF重组体茵落PCR产物为649bp特异片段，测序分析为bFGF基因片段。结论 经RT-PCR．反应得到特异的bFGF基因片段，并成功构建了大鼠bFGF真核表达载体。     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的：构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的真核表达载体,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法：①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增bFGF基因;②将bFGFDNA克隆到pGEM-TEasy质粒,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定;③然后将bFGF DNA亚克隆到pEGFP-N3质粒;通过抗性基因筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果：菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论：经RT-PCR反应得到了特异的bFGF基因片段并成功构建了bF-GF荧光真核表达载体。     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体转染骨髓间充质干细胞的表达

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染骨髓间充质干细胞(MSCs)后的表达情况。方法：应用脂质体介导的基因转移技术将bFGF真核表达载体导入MSCs,用抗药性标志选择方法筛选出阳性克隆后,用免疫细胞化学检测bFGF表达分泌情况。结果与结论：经转染bFGF真核表达载体的MSCs细胞呈阳性,说明经转染的MSCs表达并分泌bFGF蛋白。MSCs有望成为bFGF基因治疗中枢神经系统疾病的理想载体。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

TGF-β1、bFGF双基因修饰骨髓间充质干细胞的实验研究

以脂质体为载体来介导转化生长因子-β1（TGF-β1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察两基因的表达情况。方法 对SD大鼠的BMSCs采用贴壁法联合Percoll密度梯度离心法获得。使用PCR技术获得TGF-β1基因、bFGF基因,将其基因在真核表达载体pcDNA3.1（+）上构建,再将两种真核表达载体通过脂质体转染至第3代BMSCs。采用RT-PCR、Western blot检测BMSCs中bFGF、TGF-β1基因的表达水平。结果 贴壁法联合Percoll密度梯度离心可以获得BMSCs。成功构建pcDNA3.1（+）-bFGF和pcDNA3.1（+）-TGF-β1真核表达载体后,将其转染BMSCs,RT-PCR、Western blot均可检测到bFGF、TGF-β1基因的表达。结论 bFGF和TGF-β1可以通过脂质体转染方式修饰BMSCs,并获得高效表达。     

bFGF对成骨细胞整合素β1亚单位表达和细胞黏附的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成骨细胞整合素81亚单位表达的影响,探讨纤维黏连蛋白(FN)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独或联合应用时对成骨细胞在生物衍生骨支架上黏附的影响.方法:培养成骨细胞,以bFGF(100 ng/ml)刺激,接种于FN(10μg/ml)修饰的生物衍生骨支架上,Western blot检测bFGF对FN受体整合素β1亚单位表达的影响,MTT检测组间细胞黏附效率差异,电镜观察细胞密度与形态.结果:Western blot检测发现应用bFGF刺激后,成骨细胞整合素β1亚单位表达增强;MTT检测发现单独应用FN与bFGF均可增加细胞在生物衍生骨上的黏附效率(P＜0.01),但二者联合应用时,产生的效应进一步增强,二者存在统计学上的交互作用(P＜0.01);电镜观察也证明,二者联合应用时细胞密度、铺展效果均优于单独应用.结论:bFGF可以显著增强成骨细胞FN受体整合素β1亚单位的表达,明显提高成骨细胞在FN修饰生物衍生骨支架上的黏附效率,bFGF与FN对于促进成骨细胞的黏附具有交互作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对间充质干细胞成骨活性的影响

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是近年来研究较为广泛的具有较高生物活性的生长因子之一,对骨髓间充质干细胞有广泛的作用.该文就bFGF促进间充质干细胞向成骨细胞分化方面的研究进展做一综述.     

碱性成纤维细胞生长因子对间充质干细胞成骨活性的影响

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是近年来研究较为广泛的具有较高生物活性的生长因子之一,对骨髓间充质干细胞有广泛的作用。该文就bFGF促进间充质干细胞向成骨细胞分化方面的研究进展做一综述。     

bFGF基因转染骨髓基质细胞后的表达

目的用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因转染鼠骨髓基质细胞(BMSCs)，观察bFGF基因在BMSCs中的瞬时及稳定表达。方法用密度梯度离心法体外培养SD大鼠BMSCs，经传代培养，取第二代细胞，用脂质体法将bFGF真核重组表达质粒(bFGF-pcDNA3)转染，用免疫细胞化学法检测bFGF转染是否成功。结果bFGF基因能在BMSCs中瞬时及稳定表达。结论bFGF基因能转入BMSCs并稳定表达。     

下颌骨牵张后bFGF与IGF—I在新骨组织中的定位表达

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)与胰岛素样生长因子（IGF-I）在下颌牵张成骨过程中的表达及意义。方法 对12只成年山羊行双下颌骨牵张成骨术，在牵张结束后的第1、2和4周分别处死4只动物，取牵张区新骨组织用免疫组化检测bFGF和IGF-I的表达，另选2只同龄山羊作为正常对照。结果 下颌骨牵张后bFGF与IGF-I均呈高水平表达，bFGF定位于间充质或成纤维样细胞、成骨细胞以及新骨基质，而IGF-I则主要定位于成骨细胞。结论 bFGF与IGF-I可能在下颌骨牵张后的新骨生成中起着重要的调控作用。     

bFGF对大鼠成骨细胞膜integrin α2、α5、β1 mRNA表达的调控作用

目的 探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养大鼠成骨细胞膜上整合索(integrin)亚基mRNA表达的影响.方法 用含不同浓度bFGF F12培养基对大鼠成骨细胞进行24 h预孵后,接种于喷砂处理的钛片上,第3 d收集成骨细胞,利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.结果 体外培养的大鼠成骨细胞膜上integrinβ1mRNA表达水平最高,其次为integrin α2,integrinα5相对最低.bFGF能不同程度有效上调成骨细胞integrin α2、α5、β1mRNA的表达,但促进integrin α2,α5、β1mRNA表达的bFGF的有效浓度范围不同.结论 bFGF能促进大鼠成骨细胞膜上integrin α2、α5、β1mRNA的表达.     

碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应

目的 建立优化高效的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)蛋白重组方法,阐明二者在促成骨中的协同效应.方法 优化bFGF和BMP-2成熟肽的基因序列密码子,获得适用于大肠杆菌Origami2体系表达的bFGF及BMP-2成熟肽cDNA片段;利用PCR法将bFGF成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pColdⅡ中,构建重组原核表达质粒pColdⅡ-bFGF;利用PCR法将BMP-2成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-BMP-2,转入大肠杆菌Origami2中表达纯化;运用双酶切、质粒测序及Western blot技术证明Origami2表达体系的构建效果;进行细胞增殖实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)染色观察和体内成骨效率检测等,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应.结果 双酶切和质粒测序鉴定证明成功构建重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,Western blot检测发现蛋白正确表达.经过Ni-NTA亲和层析纯化后bFGF及BMP-2纯度高达90％.通过对二者比例的优化筛选,发现40 ng/mL bFGF +40 ng/mL rhBMP-2时,大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖效率、ALP活性及体内成骨效率最高,是二者促成骨的最优效组合.结论 成功构建高效表达的pCold Ⅱ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,实现了bFGF及BMP-2的高效表达.bFGF和BMP-2的优化联合应用具有促成骨协同效应.     

碱性成纤维细胞生长因子和骨保护素的生物学作用研究进展

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能够促进成骨细胞增殖,而骨保护素(OPG)是一种破骨细胞抑制因子,两者对于骨的再生与修复具有重要作用。近年来很多研究表明bFGF与OPG不仅在人体各组织器官中有大量表达,而且在口腔牙周组织也同样有所表达,并且有实验结果表明,OPG和bFGF的联合应用可促进犬牙槽骨缺损修复。现就bFGF和OPG的生物学特性及其作用予以综述。     

重组人bFGF蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

【目的】构建人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因的原核表达载体,并对其进行诱导表达和蛋白质纯化,以获得大量重组人bFGF蛋白。【方法】人工合成bFGF基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pET22b中,转化感受态细胞大肠杆菌RPX,经IPTG诱导表达重组bFGF蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测分析。【结果】成功构建了人重组bFGF表达质粒pET22b-rhbFGF,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,分子量约在18×103Da处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的28%,纯化后的蛋白质灰度扫描检测,纯度为95%。【结论】成功构建了重组人bFGF原核表达载体,并成功纯化了该基因的原核表达产物,为下一步人bFGF的产业化打下了基础。     

不同年龄抑郁障碍患者bFGF的表达

目的研究碱性成纤维细胞生长因子在不同年龄段抑郁障碍患者及正常对照组中的表达差异,为抑郁障碍的发病机制研究提供实验依据.方法共入组253人,随机分为抑郁组143人,正常对照组110人.使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分别测定两组血清中的促血管生长因子——碱性成纤维细胞生长因子(bFGF).将2组的碱性成纤维细胞生长因子测定结果分为<30岁和≥30岁,<40岁和≥40岁以及<50岁和≥50岁.结果(1)抑郁障碍组和正常对照组2组组间比较,bFGF差异无明显统计学意义(P>0.05).(2)在抑郁障碍患者组中,各年龄段患者的bFGF差异无明显统计学意义(P>0.05).(3)在正常对照组中,30岁以上者的bFGF高于30岁以下者(P<0.05);40岁以上者的bFGF高于40岁以下者(P<0.05);50岁以上及50岁以下者的bFGF差异无明显统计学意义(P>0.05).结论碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与抑郁障碍的发病机制的关系尚不明显.