内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的　探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl 2和Bax的表达情况。方法　选用雌性白色豚鼠 16只 ,随机分为实验组和对照组各 8只 ,以钥孔血蓝蛋白全身免疫后 ,实验组以相同抗原进行内耳免疫 ,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水 ,在内耳免疫 7d后处死动物 ,取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术 (terminal deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling ,TUNEL)检测内耳凋亡细胞 ,免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl 2和Bax的表达。结果　透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变 ,而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞 ,血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞 ,TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征 ,对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性 ,而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达 ,FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl 2蛋白表达阴性 ,对照组的Corti器、侧壁和     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl-2和Bax的表达情况。方法选用雌性白色豚鼠16只，随机分为实验组和对照组各8只，以钥孔蛾血蓝蛋白全身免疫后，实验组以相同抗原进行内耳免疫，对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水，在内耳免疫7d后处死动物，取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测内耳凋亡细胞，免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl-2和Bax的表达。结果透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变，而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞，血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞，TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征，对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性，而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达，FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl-2蛋白表达阴性，对照组的Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bcl-2蛋白表达阳性。实验组Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bax蛋白表达阳性，对照组只有螺旋神经节细胞Bax蛋白表达弱阳性，Corti器、侧壁表达阴性。结论内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生，Fas-FasL是此过程的信号转导途径之一，Bcl-2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

JNK信号通道在强噪声诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡的作用

目的：探讨强噪声对豚鼠耳蜗细胞死亡的机制及磷酸化c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通道在强噪声诱导耳蜗细胞凋亡的作用。方法：将实验组豚鼠暴露在4kHz窄带噪声120dBSPL噪声环境中4h,噪声刺激停止后1d、4d、14d组及对照组（每组各8只）在处死前测ABR。取每组4只豚鼠耳蜗作石蜡切片,另外4只豚鼠提取耳蜗总蛋白。脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术（TUNEL）检测耳蜗凋亡细胞,免疫组织化学及WesternBlot方法检测JNK信号途径蛋白质P-JNK、P-c-Jun的表达。结果：实验组耳蜗Corti器毛细胞、血管纹和螺旋神经节细胞存在TUNEL阳性细胞,以1d组最多,逐渐减少,14d组最少,而对照组未见阳性细胞。免疫组织化学观察到实验组P-JNK、P-c-Jun有免疫反应阳性,定位于细胞核,对照组未见阳性细胞。Western Blot检测P-JNK、P-c-Jun含量在噪声刺激后迅速增高并快速活化,1d、4d达到高峰,随后逐渐下降,但在14d仍然维持较高水平。结论：强噪声可以通过诱导凋亡造成耳蜗细胞损伤,同时P-JNK标志着JNK信号途径的激活,提示JNK信号通道可能也是介导强噪声诱导豚鼠耳蜗细胞凋亡信号通道之一。     

内耳免疫反应中的细胞凋亡活性及其与FasL表达的相关性

目的 观察内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡以及细胞凋亡活性与FasL表达相关性。方法16只雌性白色豚鼠。随机分为实验组与对照组，每组各8只。所有动物均先以钥孔虫戚血蓝蛋白全身免疫。然后，实验组再以相同抗原进行单侧内耳局部免疫，对照组则于单侧内耳注射等量磷酸盐缓冲生理盐水。3天后处死动物，取内耳免疫侧（或对照注射侧）耳蜗制备石蜡切片，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术检测内耳细胞凋亡活性，免疫组化法检测内耳FasL表达水平。结果实验组动物内耳Cord器毛细胞、血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞中存在阳性着色的凋亡细胞，对照组豚鼠内耳则否。实验组动物内耳Corti、蜗管侧壁、螺旋神经节细胞FasL表达阳性。对照组则为阴性。结论 内耳免疫反应可诱导局部细胞凋亡活性增高，FasL在此过程中可能发挥重要作用。     

细胞凋亡与激光对内耳损伤关系的研究

目的 研究激光对内耳的损伤过程中细胞凋亡最终是否参与,并探讨激光对内耳损伤的机制。方法 选用健康雄性听力正常的豚鼠24只,随机分成对照组及实验A、B、C组,每组6只。对照组只打开听泡暴露圆窗龛,实验组分别以平均功率为1W、3W及5W的超脉冲CO2激光在豚鼠左耳耳蜗底周造孔。术前1d和处死前分别检测豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)。术后1d断头处死豚鼠,扫描电镜形态学观察,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果 实验B组和实验C组术后ABR III波阈值较术前提高(P<0.05)。实验C组外毛细胞纤毛散乱,并有散在缺失,实验B组外毛细胞纤毛稍散乱,无缺失,而对照组和实验A组基本正常。实验C组耳蜗螺旋神经节细胞、耳蜗神经细胞及外毛细胞等处见明显凋亡阳性细胞,实验B组上述部位仅见散在少量凋亡阳性细胞,而对照组和实验A组未见明显改变。结论 高峰功率激光对内耳的结构和功能有损伤,细胞凋亡在其中起了重要作用。     

磷酸化JNK在庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞凋亡中的表达

目的:观察庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞损伤特点,并探讨磷酸化cjun氨基末端激酶(JNK)在前庭毛细胞凋亡过程中的作用机制。方法:健康豚鼠随机分为实验组和对照组各15只,分别行100mg/(kg·d)庆大霉素和生理盐水连续肌肉注射7d,第8天全身麻醉下处死豚鼠,取壶腹嵴为观察对象,左耳铺片,硝酸银染色检测毛细胞损伤;右耳冷冻连续切片,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测毛细胞凋亡,免疫组织化学方法检测细胞中JNK磷酸化。结果:实验组中毛细胞受损,壶腹嵴顶端见凋亡细胞,并在细胞内观察到磷酸化JNK免疫阳性反应;对照组中未见毛细胞损伤及凋亡细胞,未见磷酸化JNK。结论:庆大霉素可以通过诱导凋亡造成内耳前庭毛细胞损伤,同时磷酸化的JNK标志着JNK途径的活化,提示JNK途径在细胞凋亡过程中发挥了一定作用。     

模拟风洞噪声对豚鼠听功能及内耳细胞凋亡的影响

目的探讨模拟风洞噪声对豚鼠听功能及其内耳毛细胞、螺旋神经节细胞凋亡的影响。方法 24只豚鼠随机分为对照组(6只)及实验组(18只),实验组豚鼠暴露于模拟风洞噪声环境中,分别于模拟风洞噪声暴露前(Pr)、暴露1天(E1)、3天(E3)、7天(E7)、暴露后3天(R3)、7天(R7)检测其双耳听性脑干反应(ABR)阈值,并于噪声暴露3天(E3)、7天(E7)及暴露后7天(R7)取实验动物耳蜗行连续冰冻切片,免疫组织化学染色观察Caspase-3在内耳毛细胞及螺旋神经节细胞中的表达。结果实验组动物各时间点ABR阈值:噪声暴露1天(E1)(35.73±8.11dB SPL)、3天(E3)(43.91±6.32dB SPL)、7天(E7)(53.18±6.28dB SPL)的ABR反应阈较噪声暴露前(22.50±5.98dB SPL)明显增高(P<0.01),且暴露时间越长增高越明显。噪声暴露后3天(R3)(46.40±11.59dBSPL)ABR反应阈较噪声暴露7天(E7)(53.18±6.28dB SPL)有降低(P<0.05),噪声暴露后7天(R7)(35.38±11.63dB SPL)ABR反应阈较噪声暴露后3天(R3)(46.40±11.59dB SPL)进一步降低(P<0.01)。豚鼠内耳免疫组织化学观察凋亡标志物Caspase-3结果显示,模拟风洞噪声暴露引起豚鼠内耳螺旋神经节细胞及毛细胞中Caspase-3表达较正常对照组明显增高,且于噪声暴露7天(E7)达最高,暴露后7天(R7)后豚鼠内耳Caspase-3的表达较前明显减少。结论模拟风洞噪声可致豚鼠听功能的损伤,损伤程度在一段时间内与噪声暴露累积量呈正相关。噪声暴露结束后,听功能可部分恢复。同时,内耳凋亡标志物Caspase-3的表达和听功能呈现相同趋势。     

强噪声暴露下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3的表达

目的探讨强噪声能否诱导豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞（sprial ganglion cell,SGC）的凋亡及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法选用健康雄性白色豚鼠20只,随机分为4组,每组5只,其中3组为实验组,1组为对照组。将实验组动物暴露于4kHz、120dB SPL窄带噪声中4h,分别测试噪声刺激停止后1、4、14d及对照组豚鼠听性脑干反应（auditory brainstem response,ABR）。通过透射电镜和脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL）,检测SGC凋亡细胞,免疫组织化学方法检查Caspase-3蛋白的表达。结果透射电镜观察发现实验组SGC出现了凋亡细胞的特征性改变。实验组SGC的TUNEL染色明显增强,Caspase-3的表达增高,与对照组比较差异均有显著统计学意义（P〈0.01）。结论强噪声可以诱导SGC凋亡;SGC凋亡与caspase-3的激活有关。     

顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤

目的观察顺铂中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤特点,并探讨半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)在耳蜗毛细胞凋亡过程中的作用机制。方法健康豚鼠随机分为实验组和对照组各10只,实验组顺铂2mg·kg~(-1)·d~(-1),腹腔注射,连续6天：对照组用生理盐水等量腹腔注射,连续6天。动物实验期间每天测体重以调整药量,用药前及用药后第7天检测DPOAE,第7天处死豚鼠。左耳冰冻连续切片,免疫组织化学方法检测细胞中Caspase-3的表达;右耳冰冻连续切片,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法检测毛细胞凋亡。结果实验组中毛细胞受损,在细胞内观察到Caspase-3免疫阳性反应,并见凋亡细胞;对照组中未见毛细胞损伤,未见Caspase-3表达,未见凋亡细胞。结论顺铂可以通过诱导凋亡造成耳蜗毛细胞损伤,同时Caspase-3的表达,提示Caspase家族参与了耳蜗毛细胞凋亡过程。     

豚鼠耳颞部60Coγ射线照射对耳蜗核影响的实验研究

目的探讨60 Coγ射线照射对豚鼠耳蜗核神经元的影响。方法 48只豚鼠随机分为对照组(8只)和实验组(40只),实验组豚鼠于右耳颞部做一次性40Gy 60 Coγ射线照射后的1、4、7、14、30d行听性脑干反应(audi-tory brainstem response,ABR)测试,然后处死,行耳蜗核石蜡切片HE染色及免疫组织化学染色,观察细胞形态及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)。对照组不予60 Coγ射线照射,行ABR测试后行耳蜗核HE染色,方法同实验组。结果对照组ABR反应阈为29.17±1.95dB SPL,实验组在接受60 Coγ射线照射后1、4、7、14、30dABR阈值升高,分别为31.88±2.59、35.00±3.17、35.83±2.04、39.17±2.05、41.67±2.58dB SPL,照射后4、7、14、30d ABR反应阈与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组各时间点ABR波I、II、III潜伏期及I-II、II-III、I-III波间期延长,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色显示实验组在照射后不同时间点均出现耳蜗核神经细胞肿胀、胞核皱缩或碎裂、尼氏体减少,以14、30天时改变明显。对照组耳蜗核Caspase3免疫组化染色的灰度值为172.33±17.81,实验组60 Coγ射线照射后1、4、7、14、30d耳蜗核Caspase3免疫组化灰度值分别为136.37±24.42、94.67±15.33、91.40±11.71、110.80±4.23、123.56±32.56,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 60 Coγ射线照射可导致耳蜗核损伤;Caspase3表达上调可能与耳蜗核神经元射线损伤有关。     

正常豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义

目的：检测正常豚鼠内耳组织中水通道蛋白（aquaporins,AQPs）的表达,探讨其在内耳液体平衡中的意义.方法：用免疫组织化学方法,以兔抗大鼠AQP0、1、2、3、5、7、8的多克隆抗体,检测正常豚鼠内耳组织中水通道蛋白亚型0、1、2、3、5、7、8的表达.结果：水通道蛋白亚型0、1、2、3、5、7、8在豚鼠内耳有不同程度、不同模式的表达,其中AQP0仅在血管纹上皮细胞、螺旋神经节细胞有较弱的表达,AQP1的分布见于包绕骨迷路、内淋巴囊、内淋巴管的纤维细胞,基底膜鼓阶面细胞、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘纤维细胞、Corti器、内外螺旋沟、血管纹、椭圆囊壁、球囊壁、螺旋神经节细胞等.AQP2表达在血管纹、Corti器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中.AQP3、7、8的分布类似,在螺旋神经节和包绕膜迷路的组织中均有表达,其中Corti器、内外螺旋沟、血管纹、螺旋神经节表达较强,在螺旋韧带、螺旋缘纤维细胞表达较弱.AQP5则在Corti器、内外螺旋沟、螺旋神经节细胞表达较强,在螺旋韧带纤维细胞表达稍弱.结论：在正常豚鼠内耳中,尤其是膜迷路中有多种水通道蛋白亚型,以不同的方式表达,他们可能在维持膜迷路液体平衡中起着协同作用.     

Distribution of beta-tubulin in guinea pig inner ear

Our previous research had suggested that beta-tubulin might be an autoantigen for autoimmune inner ear disease. In this study, the expression of beta-tubulin in inner ears of normal and tubulin-immunized guinea pigs was examined by immunohistochemical staining. Strong immunoreactivity to beta-tubulin monoclonal antibody was found in stria vascularis, neurons of the spiral ganglion, cochlear nerve fibers and spiral ligament. Diffuse staining was found in the stria vascularis and the neurons of the spiral ganglion, while dense network staining was found in the spiral ligament, the nerve fibers and the vestibular end organs. The semicircular canals, endolymphatic duct and sac were also positively stained. In inner ears of guinea pigs challenged with beta-tubulin, staining intensity was diminished in the stria vascularis, the spiral ligament, and the neurons of the spiral ganglion. The results suggest that beta-tubulin is distributed to most structures of guinea pig inner ear. A challenge to the inner ear by tubulin could change the beta-tubulin distribution and cause degeneration in the spiral ganglion. The results support the hypothesis that beta-tubulin might be an autoantigen for autoimmune inner ear disease.     

溶酶体神经氨酸酶基因缺乏小鼠听觉和耳形态学改变初步研究

目的研究溶酶体神经氨酸酶基因（Neul）敲除小鼠听功能和耳形态学改变，探讨唾液酸沉积症听力损害的病理生理机制。方法应用听性脑干反应测试和常规颞骨连续切片观察3周、2个月和4个月龄的Neul敲除纯合子（Neul-／-）和野生型（Neul＋／＋）小鼠听阈和光镜下外耳、中耳及内耳形态。结果3周龄的Neul-／-小鼠，短声和短音8、16及32kHz听阈（声压级）较Neul＋／＋提高50—55dB；2个月和4个月龄小鼠听阈提高60—68dB。Neul-／-小鼠3周龄即有明显的中耳和内耳改变，特别是2个月和4个月龄有显著的外耳道堵塞和严重中耳炎，听小骨和耳蜗骨壁细胞、血管纹边缘层和中间层细胞、耳蜗螺旋神经节细胞、螺旋缘纤维细胞、前庭膜、基底膜及沿前庭阶外淋巴隙的间皮细胞明显囊泡化，但Corti器细胞正常。前庭神经节细胞、壶腹嵴及球囊毛细胞和支持细胞也呈现明显囊泡化。结论溶酶体神经氨酸酶的缺乏可导致较严重的听力损害和耳形态改变；外耳道阻塞或中耳炎和听骨改变可能引起传导性聋；耳蜗螺旋神经元、血管纹、螺旋缘、前庭膜和基底膜等细胞的溶酶体储积可能导致感音神经性聋。     

内耳免疫反应中细胞凋亡及Bcl-2与Bax的表达

目的 研究内耳免疫反应时细胞凋亡以及Bcl 2和Bax的表达情况,探讨自身免疫性内耳病发病机制。方法 选用健康SD大鼠60只,随机分成实验组30只（皮下注射Ⅱ型胶原与弗式佐剂）,佐剂组15只（皮下注射弗式佐剂）,对照组15只（予等量生理盐水）,免疫后进行畸变产物耳声发射（DPOAE）检测,扫描电镜形态学观察,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡及免疫组化检测Bcl-2和Bax的表达。结果 实验组DPOAE幅值下降（P<0.05）,部分毛细胞纤毛排列紊乱、簇状缺失, Corti器、血管纹和螺旋神经节可见TUNEL阳性染色, 且Bax/ Bcl-2表达比值上调,而对照组和佐剂组未见明显改变。结论 内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生, Bcl 2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

Anti-clarin-1 AAV-delivered ribozyme induced apoptosis in the mouse cochlea

Usher syndrome type 3 is caused by mutations in the USH3A gene, which encodes the protein clarin-1. Clarin-1 is a member of the tetraspanin superfamily (TM4SF) of transmembrane proteins, expressed in the organ of Corti and spiral ganglion cells of the mouse ear. We have examined whether the AAV-mediated anti-clarin ribozyme delivery causes apoptotic cell death in vivo in the organ of Corti. We used an AAV-2 vector delivered hammerhead ribozyme, AAV–CBA–Rz, which specifically recognizes and cleaves wild type mouse clarin-1 mRNA. Cochleae of CD-1 mice were injected either with 1 μl of the AAV–CBA–Rz, or control AAV vectors containing the green fluorescent protein (GFP) marker gene (AAV–CBA–GFP). Additional controls were performed with saline only. At one-week and one-month post-injection, the animals were sacrificed and the cochleae were studied by histology and fluorescence imaging.

Mice injected with AAV–CBA–GFP displayed GFP reporter expression of varying fluorescence intensity throughout the length of the cochlea in the outer and inner hair cells and stria vascularis, and to a lesser extent, in vestibular epithelial cells. GFP expression was not detectable in the spiral ganglion. The pro-apoptotic effect of AAV–CBA-delivered anti-clarin-1 ribozymes was evaluated by TUNEL-staining. We observed in the AAV–CBA–Rz, AAV–CBA–GFP and saline control groups apoptotic nuclei in the outer and inner hair cells and in the stria vascularis one week after the microinjection. The vestibular epithelium was also observed to contain apoptotic cells. No TUNEL-positive spiral ganglion neurons were detected. After one-month post-injection, the AAV–CBA–Rz-injected group had significantly more apoptotic outer and inner hair cells and cells of the stria vascularis than the AAV–CBA–GFP group.

In this study, we demonstrate that AAV–CBA mediated clarin-1 ribozyme may induce apoptosis of the cochlear hair cells and cells of the stria vascularis. Surprisingly, we did not observe apoptosis in spiral ganglion cells, which should also be susceptible to clarin-1 mRNA cleavage. This result may be due to the injection technique, the promoter used, or tropism of the AAV serotype 2 viral vector. These results suggest the role of apoptosis in the progression of USH3A hearing loss warrants further evaluation.     

Decreased cochlear DNA receptor staining in MRL.MpJ-Fas(lpr) autoimmune mice with hearing loss

OBJECTIVES: Previous studies of decreased cochlear DNA binding in autoimmune mice suggested that antibodies against a cochlear cell surface DNA receptor cause autoimmune hearing loss. However, the presence of a cochlear DNA receptor has not been determined. Therefore, immunohistochemistry with an anti-DNA receptor antibody was performed on MRL.MpJ-Fas(lpr) (MRL/lpr) autoimmune mice to determine 1) which inner ear structures contain DNA receptors and 2) whether the receptor staining pattern changes as autoimmune disease progresses and hearing thresholds increase. STUDY DESIGN: A prospective study of the progression of hearing loss in autoimmune mice and correlated alterations in immunostaining for the inner ear DNA receptor. METHODS: One group of MRL/lpr mice (n = 10) was allowed to develop autoimmune disease, and auditory brainstem response (ABR) audiometry was performed at 4, 6, and 9 months of age to measure the progression of hearing loss. A second group (n = 5) was tested for ABR thresholds at 2 months of age and immediately killed to assess receptor staining before the onset of autoimmune disease and hearing loss. The inner ears from all mice were immunohistochemically stained with an anti-DNA receptor antibody, and a qualitative analysis of the staining of cochlear structures was performed. RESULTS: Auditory brainstem response audiometry revealed a significant 20- to 30-dB elevation of thresholds as systemic disease progressed. Anti-DNA receptor staining was heaviest in the spiral ligament and less intense in the spiral ganglion and cochlear nerve. Both groups showed a similar pattern of staining in these structures. The stria vascularis and hair cells also stained in both groups. However, the stria cells of normal-hearing mice showed diffuse intracellular immunoreactivity, whereas older mice displayed less staining that was confined to the cell membranes. CONCLUSIONS: The inner ears of MRL/lpr mice contain DNA receptors. Autoimmune hearing loss was correlated with weaker overall intracellular staining in the stria vascularis and hair cells but increased staining of the cell membranes. This suggested DNA receptors have impaired endocytosis and more receptors remain on the cell membrane, possibly as a result of binding by circulating autoantibodies.     

凋亡及其相关基因在实验性自身免疫性内耳病小鼠内耳组织中的表达

目的探讨凋亡及其相关基因在自身免疫性内耳病形成和发展中的作用。方法选用近交系C57BL／6小鼠随机数字表法分为正常对照组和免疫7、14、21、28d组，每组16只。提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原，与等量完令弗氏佐剂，百日咳杆菌一次免疫实验组动物，制备自身免疫性内耳病动物模型，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase—mediated d-UTP nick end—labing，TUNEL）检测内耳中的细胞凋亡，应用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测Fas、FasL及bcl-2在内耳的表达。结果正常小鼠内耳组织中，TUNEL染色阳性细胞极为少见，偶尔在Corti器或球囊斑的支持细胞发现。免疫7d后，内毛细胞和少量的血管纹边缘细胞TUNEL染色阳性，14d后TUNEL染色阳性的细胞数量及种类显著增加，但外毛细胞、螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞免疫前后均未见凋亡表达。免疫组化染色显示，正常小鼠内耳中Fas表达广泛，FasL存部分螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞表达，bcl-2仅在螺旋神经节细胞、前庭神经节细胞有较强表达。免疫后FasL在各种组织均有较强表达，bcl一2在外毛细胞出现表达，在耳蜗神经无细胞的表达增加。RT—PCR检测正常小鼠内耳组织的Fas mRNA、FasL mRNA、bcl-2mRNA均为阳性，FasL mRNA低水平表达，免疫后升高，在2周达到高峰后逐渐下降；bcl-2 mRNA在免疫后进行性升高。结论Fas／FasL信号系统介导的凋亡与自身免疫性内耳病的发生、发展过程关系密切，bcl-2对内耳中Fas／FasL介导的凋亡有重要的调节作用。     

内耳疾病基因治疗方法的研究

目的:探讨一种高效、安全和简便的内耳疾病基因转移和导入方法。方法:将30只健康豚鼠随机分为A、B、C 3组,每组10只。用Ad—GFP报告基因分别由圆窗、耳蜗底回和脑脊液三种途径导入30只豚鼠内耳,在术前和术后测定听性脑干反应(ABR)阈值和畸变产物耳声发射(DPOAE)振幅改变。再行耳蜗铺片,观察AdGFP在内耳组织中的转染表达和耳蜗毛细胞的形态结构。结果:三种途径导入Ad—GFP在耳蜗螺旋神经节、血管纹和Corti器上均有转染和表达。在术后3 d的表达产物最高,7 d后减弱,10 d后更弱。圆窗和耳蜗底回钻孔导入手术可引起蜗内出血,凝血块淤积在耳蜗顶回的中阶,造成顶回毛细胞损害。而脑脊液给药途径无此现象。ABR阈值在各组动物手术前后无明显改变,而圆窗和耳蜗底回给药途径造成DPOAE幅度明显下降,脑脊液给药组无DPOAE改变。结论:应用腺病毒载体进行基因转移通过圆窗和耳蜗底回钻孔途径可引起蜗内出血,影响DPOAE幅度,而应用脑脊液给药途径则相对安全和方便。     

TUNEL-positive labeling in mouse inner ear caused by tubulin immunization is not apoptosis

Apoptosis is involved in all fundamental processes of the immune system. To study whether apoptosis plays any role in the pathogenesis of autoimmune inner ear disease, we immunized Balb/c mice with tubulin. The inner ears were examined with TUNEL (in situ terminal dUTP nick-end labeling) and immunocytochemistry of the apoptosis regulatory proteins Bcl-2 and Bax. TUNEL-positive cells are found in the tubulin-immunized inner ears but not in the control inner ears. The positive cells are the marginal cells in the stria vascularis, and the hair cells in Corti's organ and the saccule. However, under morphological analysis by light microscope, these cells lack the features characteristic of apoptosis. Moreover, no cells staining positive for Bcl-2 and Bax are found in any structures of the inner ears. These results suggest that positive TUNEL staining in this model does not indicate apoptosis and apoptosis may be not involved in autoimmune inner ear disease.