16SrRNA基因克隆文库用于菌群分析的效能研究和评价

目的建立16SrRNA基因克隆文库进行菌群相对定量的方法，评价其对细菌的检测效率以及对混合菌群巾低含量细菌的分析能力。方法取脆弱类杆菌等9种细菌以相同及级差比例制备细菌悬液，分别用或不用变溶菌素处理后，用试剂盒提取核酸，16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增、纯化、连接、克隆和测序，建立16SrRNA基因克隆文库，将序列与数据库进行比对分析。结果相同比例制备的菌悬液，加或不加变溶菌素提取的核酸，掺入的9种细菌均可检出。级差比例制备的菌悬液，加变溶菌素提取核酸，掺入的9种细菌均可检出；不加变溶菌素提取核酸，数量少难裂解的革兰阳性菌双歧杆菌未能检出。混合菌悬液中各种细菌的比例与文库反映的各种细菌的比例有数量对应关系，但不是线性对应关系。结论16SrRNA基因序列分析是一种较好的细菌菌群分析方法，它可以同时检出多种细菌，并能对混合细菌标本进行菌群相对定量，反映菌群中各种细菌的丰度，但不能准确定量菌群中各种细菌的数量。     

肥胖2型糖尿病患者胃旁路术后肠道菌群的变化

目的 基于16S rRNA基因测序技术研究肥胖2型糖尿病患者(BMI≥40 kg/m2)胃旁路术后肠道菌群的结构及代谢变化.方法 分别按照胃旁路术前、后两个组收集4位患者粪便样本共计8例,提取细菌总DNA,通过16S rRNA测序研究两组患者间的肠道菌多样性;同时每3月收集手术后患者血清,分析糖代谢和脂代谢变化,以及统计BMI、腰臀比变化.结果 通过胃旁路术后,患者的BMI、腰臀比、糖代谢和脂代谢均下降,逐渐趋于正常水平;同时其肠道菌中的拟杆菌门(Bacteroidetes)比例增加,厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)比例减少.结论 胃旁路术能有效改善肥胖2型糖尿病患者的病情,同时可改善患者肠道菌的组成.     

16S rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究

目的建立以16S rRNA基因序列分析为基础的细菌鉴定方法,并初步将其应用于临床常规细菌的鉴定。方法选择临床微生物实验室不能准确鉴定的细菌,以16S rRNA为靶序列,在两端保守区设计引物,PCR反应扩增目的片段,测序后与数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行序列比对。结果 13株菌中,有11株与数据库中的已知16S rRNA序列相似性达99.0%以上,成功鉴定到种的水平。结论 16S rRNA基因序列分析的方法可快速、准确地鉴定不典型菌株,可作为细菌常规鉴定的补充方法。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

细菌性眼内炎的病原分子诊断研究

目的 以16S rRNA部分基因直接测序为基础分析细菌性眼内炎中的病原菌,建立眼内标本病原菌非培养检测方法.方法 收集50例患者房水或玻璃体液标本,提取细菌DNA,16SrRNA基因通用引物PCR,扩增产物直接测序,通过核酸序列比对微生物种属鉴定,同时与传统方法进行比较.结果 50例标本中,直接涂片阳性22例(44%),细菌培养阳性13例(26%),PCR检测阳性28例(56%),成功测序22例,序列鉴定率为44%.16S rRNA基因序列鉴定与培养鉴定结果不完全吻合.结论 分子诊断对明确细菌性眼内炎感染有指导意义.     

细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用

目的:构建细菌16S rRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测.方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片.利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性.结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA.结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少.     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

16S rRNA基因序列鉴定标本中病原细菌的方法学研究

目的研究16S rRNA基因序列鉴定标本中病原微生物的关键技术,评价序列分析技术作为病原微生物检测方法的可行性和实用件。方法对117份不同来源的临床标本分别采用形态学、细菌培养、16S rRNA基因扩增与测序分析,比较不同方法对病原菌检出的灵敏度与特异性。分子技术通过改良的微量核酸提取方法,扩增16S rRNA基因两个区域（BSF8-BSR534和BAK11 w-BAK2）。结果细菌培养和PCR检测的阳性率分别是49％（57／117）和72％（84／117）,63％（53／84）的PCR产物通过直接测序鉴定到种;60例（52％）培养阴性标本中有7例（12％）经序列分析再次鉴定出病原菌;形态学检查阳性率为64％（75／117）,与PCR结果接近,两者结合可提供推测性报告。第1对引物（扩增区：BSF8-BSR534）较适合革兰阳性细菌分类,第2对引物（扩增区：BAK11w-BAK2）对临床常见病原菌均可获得理想的序列。结论改进核酸提取技术、筛选恰当的引物、优化基因扩增和测序流程,通过16S rRNA基因序列直接鉴定标本中病原微生物有着广阔的应用前景。     

16SrRNA序列分析技术对临床标本中疑难细菌的鉴定

目的：应用16S rRNA序列分析技术鉴定临床少见或疑难细菌,提高细菌鉴定的准确性。方法收集临床少见或疑难细菌44株,提取DNA,采用通用引物进行PCR扩增及目的片段基因测序,并将测序结果在核酸数据库中比对分析以确定菌种。结果44株临床少见或疑难细菌均扩增到16S rRNA目的基因片段并成功测序,40株(90．9%)鉴定到“种”,4株(9．1%)鉴定到“属”;其中常规方法与测序方法在“属”水平一致的有34株(77．3%),不一致的有10株(22．7%)。结论16S rRNA序列分析技术可以准确、快速地鉴定临床少见或疑难细菌,可以作为临床细菌鉴定的重要方法之一。     

尿源产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌中16S rRNA甲基化酶基因及菌株克隆测定

目的 了解16S rRNA甲基化酶基因在尿源产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs)肠杆菌科细菌中的分布及菌株序列型别,为临床用药提供依据。 方法 采用琼脂稀释法及PCR法对引起尿路感染的74株产ESBLs肠杆菌科细菌进行体外药敏、16S rRNA 甲基化酶基因检测与分型,MLST法进行溯源性序列分型研究。 结果 74株产ESBLs肠杆菌科细菌中93.4%耐庆大霉素、18.4%耐奈替米星、13.2%耐妥布霉素、仅5.3%耐阿米卡星与异帕米星。74株菌中22株（29.7%）检出16S rRNA甲基化酶基因,其中7株检出rmtB基因, 18株检出armA基因,3株同时检出rmtB和armA基因。22株16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株对庆大霉素、奈替米星耐药率为100%,对妥布霉素者为59.1%,对阿米卡星及异帕米星者仅为18.2%。多位点序列分型显示19株甲基化酶基因阳性大肠埃希菌序列型为:12株为ST117,2株为ST2003,ST3843、ST915、ST844、ST2581、ST2922各1株;3株甲基化酶阳性肺炎克雷伯菌分为ST1184、ST490、ST337。 结论 大部分尿源性大肠埃希菌可能源于同一克隆。16S rRNA甲基化酶基因在尿源产ESBLs肠杆菌科细菌中分布广泛,与氨基糖苷类药物耐药有明显相关性。     

Survival and surface adherence ability of bacterial pathogens in oral liquid pharmaceuticals and their containers

The survival and surface adherence ability of Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa in nutrient broth and in five oral liquid pharmaceuticals (nivaquine syrup, cough mixture, paracetamol elixir, cotrimoxazole and vitamin C) were investigated The bacteria grew more in nutrient broth than in the pharmaceuticals (p < 0. 001) and the recovery of stressed cells was enhanced when 3% Tween 80 was used as the recovery medium as against the use of normal saline (p < 0.01). The Gram-negative bacteria were more adapted to the pharmaceuticals than their Gram-positive counterparts. Klebsiella pneumoniae and Ps. aeruginosa were recovered in large numbers from nivaquine and cotrimoxazole suspensions that did not support the growth of the other bacteria. The effect of bacterial growth on the physico-chemical properties of the pharmaceuticals was also evaluated The properties were not altered significantly except for pH shifts of 0.3 to 1.1 caused by E. coli and S. aureus in paracetamol and vitamin C. Adherence capability was found to correlate with the survival ability of the bacteria. Populations on coupons were significantly higher when nutrient broth was used as the suspending medium compared with any of the pharmaceuticals (p < 0.01). Rubber and plastic coupons were significantly more accessible to the bacteria than glass coupon as revealed by the high population of bacteria recovered from their surfaces.     

应用ARDRA技术对细菌性阴道病的微生态分析

目的 了解细菌性阴道病(BV)患者阴道细菌种群微生态变化.方法 采用ARDRA方法对3例BV患者及1例健康妇女阴道分泌物的细菌16S rDNA进行分析.结果 3例BV患者分别检测到37、36和31个OTUS,而正常妇女中仅检测到16个;健康妇女阴道的优势菌群为乳酸杆菌,而BV患者中的优势菌群包括纤毛菌属、普氏菌属、埃氏巨型球菌属等.3例BV患者所检测的11个优势克隆子中,仅2个为已纯培养的细菌,其余9个均为未纯培养细菌.结论 细菌性阴道病患者与健康妇女的微生态存在明显差异,DNA限制性分析技术是对阴道菌群微生态进行快速分析的有力工具,可以鉴定出常规培养方法不能鉴定的潜在致病菌.     

Mechanisms of bacterial pathogenicity

Pathogenic bacteria utilise a number of mechanisms to cause disease in human hosts. Bacterial pathogens express a wide range of molecules that bind host cell targets to facilitate a variety of different host responses. The molecular strategies used by bacteria to interact with the host can be unique to specific pathogens or conserved across several different species. A key to fighting bacterial disease is the identification and characterisation of all these different strategies. The availability of complete genome sequences for several bacterial pathogens coupled with bioinformatics will lead to significant advances toward this goal.     

The influence of two implant materials on the growth of three subgingival predominant bacteria]

OBJECTIVE: Commercially pure titanium and titanium alloy as dental implants have show impressive clinical results. Despite the high success rates, some implants do fail. Compared to those studies on osseointegration of implants, the information pertaining to their failure is little. Further studies on the relationship between implant material and micro-organism are needed. The purpose of this investigation is to study the effect of two commonly used implant materials Titanium (TA2) and Ti-6AI-4V alloy (TC4) on the growth behaviour of three subgingival predominant bacteria Streptococcus sanguis (S. s), Porphyromanus gingivalis (P. g), Fusobacterium nucleatum (F. n) and their mixture. METHODS: Under anaerobic condition, bacterial suspensions of S.s, P.g, F.n and their mixture were incubated together with the two implant materials respectively, setting the same bacterial suspensions as controls. After 2, 7 and 14 days, the bacterial growth amount was assayed by means of clone forming unit (CFU) method. The pH value of the bacterial suspension was determined by pH-Meter. RESULTS: The results showed that there was no difference in amount of bacterial growth or pH value between TA2 group and TC4 group (P > 0.05). There was also no statistically significant change as to the proportion of individual bacteria in bacterial mixture or the pH value of culture suspension. CONCLUSION: Under the condition of this investigation, the two studies implant materials have no examined influences on the growth of the subgingival bacteria and the pH value of their culture environment.     

两种种植材料对龈下优势菌生长及生长环境的影响

目的　了解种植体周炎发病中受到关注的几种龈下优势菌的生长及生长环境与两种常用种植材料的关系。方法　采用配伍组设计 ,将两种常用金属种植材料纯钛和钛 - 6铝 - 4钒合金试件分别与三种龈下优势菌血链球菌 (S.s)、具核梭杆菌 (F.n)、牙龈卟啉单胞菌 (P.g)及其混合菌共同厌氧孵育 ,选择 2天、7天和 14天三个培养时间段 ,采用菌落形成单位计数法测定培养液中的细菌生长量 ,同时用精密 p H计测定培养液 p H值。结果　实验组与对照组间的细菌生长量及生长环境 p H值均无统计学差异 (P<0 .0 5 )。结论　本实验程期内 ,纯钛和钛- 6铝 - 4钒两种种植材料既未影响各单一菌及混合菌中各组成菌的生长量 ,也末影响细菌培养环境的 p H值     

肝移植术后细菌感染的相关因素分析

目的探讨手术技巧、肝脏移植受体待肝时间、受体术前肝功能分级和肝脏移植术后细菌感染的关系;分析肝移植术后细菌感染的常见菌群：探讨肝脏移植术后细菌感染的防治办法。方法结合本院2004年8月-2005年8月共31例行肝脏移植术的患者,对肝脏移植术后细菌感染情况进行分析。对所有原始数据进行分类汇总,并对数据进行统计学处理,得出结论。结果31例肝脏移植患者,共16例患者术后发生了细菌感染,感染发生率51,61％,多系统（或器官）细菌感染的发生率22．58％。前期的手术患者中,平均手术时间、平均无肝期均较后期的手术患者长,而感染发生率较后期的手术患者高。19例术前肝功能A级患者,有7例发生了单系统（或器官）的细菌感染,2例发生了多系统（或器官）细菌感染;8例术前肝功能B级患者,有2例发生了单系统（或器官）的细菌感染,1例发生了多系统（或器官）细菌感染;本组的5例肝功能C级患者中,除1例没有发生感染外,其余4例均发生了感染,且都为多器官、多系统的感染。在所有检出菌中,阳性率最高的为铜绿假单胞菌。结论感染仍然是肝脏移植术后常见且严重的并发症之一。手术技巧的提高,能明显减低患者术后感染的发生率。术前肝功能A级和B级之间感染发生率和严重感染的发生率均无明显差异。而术前肝功能C级的患者,无论是单系统（或器官）细菌感染的发生率,还是多系统（或器官）细菌感染的发生率,均较术前肝功能A级或B级高。肝脏移植术后患者发生感染的几率大小、感染严重程度和总体待肝时间分布无差别。肝脏移植术后感染的常见细菌为铜绿色假单胞菌。     

腹腔内细菌感染的检测及耐药性分析

目的:了解我院近年来的腹腔内细菌感染的特点以及耐药趋势。方法:采用美国B-D公司生产的9050血培养仪进行腹水的细菌培养,细菌鉴定及药敏采用美国Microscan Walkaway 40全自动细菌鉴定及药敏测试仪。结果:在检出的110株细菌中,以革兰阴性菌为主(55.5%),其次是革兰阳性菌(45.5%)。其中大肠埃希菌占20.9%,葡菌球菌属占25.4%。药敏实验结果显示,大肠埃希菌对青霉毒素、庆大霉素耐药率较高(50%以上),金葡菌、肠球菌呈多重感染的特点。结论:根据药敏试验结果合理选用抗生素以及采用联合用药,以减少新耐药株的出现。     

56例呼吸机相关肺炎病原菌学与临床分析

目的：分析呼吸机相关肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)的病原学及药物敏感的情况。方法：回顾分析56例VAP患者的临床资料、病原菌构成以及药敏感试验结果。结果：169例机械通气患者有56例发生呼吸机相关性肺炎,发生率为33．4％,死亡率为35．7％;共培养出致病的革兰氏阴性杆菌50株,革兰氏阳性菌14株,占VAP居首的细菌是铜绿假单胞菌。结论：VAP感染的细菌以革兰氏阴性杆菌为主,且细菌的耐药率普遍较高,在治疗中应注重病原菌的培养和药物敏感试验,合理使用抗菌素。     

降钙素原与细菌感染相关性分析

目的探讨降钙素原（procalcitonin,PCT）与细菌感染的相关性。方法将173例疑似细菌感染的患者按PCT的检测值分为PCT≥0．5与PCT〈0．5两组。同时检测173例患者外周血白细胞、中性粒细胞的变化情况和细菌培养结果,并与健康对照组相比较。结果PCT≥0．5与PCT〈0．5两组患者的细菌培养结果之间的阳性率差异有显著性（x^2=25．528,P〈0．05）;PCT〈0．5和PCT≥0．5两组的WBC和中性粒细胞水平均高于正常对照组,PCT〈0．5和PCT≥0．5两组WBC和中性粒细胞水平的差异有显著性（P〈0．05）.结论PCT应用于临床提示细菌感染的敏感性高,特异性好;PCT可以作为WBC和细菌培养两项指标质控水平的监测。     

2016年重庆市合川区人民医院细菌耐药性监测结果分析

目的 分析该院2016年临床分离菌的分布和耐药特征,为临床抗菌药物合理应用提供病原茵耐药监测数据.方法 对临床送检标本按常规方法进行病原茵分离,采用Vitek2-Compact系统进行鉴定,药敏试验方法采用MIC法及KB法,按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)相关标准进行.采用WHONET5.6软件进行数据统计分析.结果 2016年共分离出非重复病原菌2 214株.其中革兰阴性杆茵1 614株(占72.9％),革兰阳性茵600株(占27.1％).前5位分离菌分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞茵、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌.产超广谱p内酰胺酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌检出率分别为51.8％、27.6％,耐甲氧西林金黄色葡萄球茵检出率为26.5％.未发现对利奈唑胺和万古霉素耐药的葡萄球菌.结论 该院病原茵以革兰阴性杆茵为主,医院应强化合理规范用药,减少耐药菌株的产生.