国人胃癌蛋白质组分析中双向凝胶电泳技术建立及优化

目的　初步建立、优化用于胃癌蛋白质组研究的双向凝胶电泳技术和计算机图像分析技术 ,提高其分辨率及重复性 ,得到一种分析胃癌蛋白质组双向凝胶电泳新方法。方法　提取胃癌组织中蛋白质 ,对以固相pH梯度为第一向双向电泳的关键因素与环节 ,如样品处理、电泳参数和凝胶浓度进行一系列优化。进一步采用双向凝胶电泳分离胃癌组和正常组总蛋白质 ,银染显色、图像分析软件分析电泳图谱。结果　重复性实验结果显示同组样品在 3次不同实验中所得蛋白质斑点数目相对标准差 (变异系数平均值 % ) :胃癌组和正常组分别为 2 3.0 0± 10 .11、2 0 .33± 9.90。变异系数范围 (% ) :胃癌组和正常组分别为 3.80～ 6 0 .10、2 .70～ 5 6 .89。同一蛋白质斑点在 3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为 8.76 %± 5 .14 % ,13.0 0 %± 4 .2 2 %和 10 .84 %± 9.16 %。获得了较好的分辨率和重复性的双向凝胶电泳图谱。结论　蛋白质组双向电泳的建立及优化表明适合于胃癌蛋白质组差异表达研究。     

建立并优化胃溃疡复发大鼠蛋白质组分析的双向凝胶电泳技术

目的:建立并优化白细胞介素1β致大鼠乙酸性胃溃疡复发模型大鼠蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术。方法:实验于2005-04/2006-02在中南大学湘雅医院中西医结合研究所实验室、卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成。①选用成年SD大鼠60只,雌雄不拘。按随机数字表法分为2组:对照组、模型组,每组30只。采用乙酸复制胃溃疡动物模型及白细胞介素1β复制胃溃疡复发动物模型,正常对照组施予相同的饮食方案。②两组大鼠于复发模型建立成功后24h禁食,48h后处死,收集胃组织,在组织样品离体后立即以冰盐水冲洗以去除组织液和血细胞,并于30min内入液氮速冻,采用化学和高速机械法进行胃组织裂解。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究中的蛋白质抽提方法设计的2DQuantKit定量试剂盒,从而实现准确的蛋白质定量。为了尽量可能多分离蛋白质,选择pH值范围(pH3￣10)的固相线性24cm干胶条和125g/L的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶,采用初始电压为2.5W/胶电泳30min,然后以17W/胶恒功率电泳,直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳。结果:以固相pH梯度-IPG胶条(pH3～10)进行第一向等电聚焦,以SDS均一胶(12.5%)的垂直电泳为第二向,成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论:通过对蛋白质双向凝胶电泳的建立及技术的优化,获得了适合于研究胃溃疡复发蛋白质组差异表达。     

双向电泳技在筛选膀胱癌特异标志蛋白中的应用

目的建立高分辨率的膀胱移行上皮癌不同时期的双向凝胶电泳图谱,并初步分析其蛋白质表达情况,寻找其差异表达蛋白,为寻找癌变相关蛋白奠定实验基础.方法用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离膀胱移行上皮癌不同分期的组织,凝胶考马斯亮蓝染色,然后利用GS-800Calibrated Densitometer凝胶成像系统获取图像,用PDQuest2D分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配、斑点位置重复性的系统分析,寻找差异表达蛋白.在此基础上应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)得到相应的肽质指纹图谱,然后搜索数据库鉴定部分差异蛋白质.结果获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,三块胶的平均蛋白质匹配率达76%,蛋白质点在位置上有较好的重复性,不同胶间的蛋白质点在等电聚焦IEF方向偏差是(0.98±0.26)mm,SDS-PAGE方向偏差是(1.23±0.22)mm,并且得到了若干与细胞增生、分化、周期调控信号转导或肿瘤发生有关的蛋白质,例如SFN,热休克蛋白-27等.结论为进一步探讨癌变机理及筛选其特异性分子标志物打下方法学基础.     

成年无精子症男性睾丸活检组织双向电泳分析技术的初步建立及其优化

目的:建立并优化成年无精子症男性睾丸活检组织双向凝胶电泳图谱.方法:采用固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳分离技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析双向凝胶电泳技术(2-DE)图谱.对聚焦参数的设置和样品的处理等步骤进行优化.结果:优化后成功地获得了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.结论:应用2-DE初步建立了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率较高且重复性好双向凝胶电泳图谱,为从睾丸蛋白质组学水平进一步研究无精子症奠定了基础.     

薯蓣皂苷元诱导人胃低分化粘液腺癌MGC-803细胞凋亡依赖caspase-3途径

目的研究薯蓣皂苷元（Diosgenin,Dio）诱导人胃低分化粘液腺癌（MGC-803）细胞死亡的机理。方法四唑蓝（MTT）比色法检测Dio对肿瘤细胞生长抑制作用;流式细胞仪检测Dio对MGC-803细胞膜Annexin V表达的影响;APO-BRDU试剂盒检测Dio对MGC-803细胞DNA的影响;酶联免疫分析仪测定Dio对MGC-803细胞caspase-3活力和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO对Dio诱导细胞死亡的影响。结果一定浓度范围内Dio对MGC-803细胞增殖有剂量、时间依赖性抑制作用;经Dio处理后Annexin V-FITC＋/PI-的凋亡细胞逐渐增多;随Dio剂量增大,DNA断裂碎片增多,凋亡细胞也逐渐增多。Dio作用细胞24 h,明显增强细胞caspase-3的活性。caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO能部分抑制MGC-803细胞的凋亡。结论 Dio通过caspase-3途径诱导人胃低分化粘液腺癌细胞凋亡。     

过表达lncRNA-p21通过介导Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌MGC-803细胞的生长与转移

目的:探讨lncRNA-p21在调控胃癌MGC-803细胞生长与转移作用中的作用及Wnt/β-catenin信号通路在其中的功能。方法:在人胃癌MGC-803细胞中转染慢病毒以过表达lncRNA-p21。观察细胞形态、细胞增殖以及体内外迁移和侵袭能力,检测Wnt/β-catenin信号通路是否参与lncRNA-p21介导的抑制胃癌细胞增殖和生长作用。最后使用LiCl对Wnt/β-catenin信号通路进行验证。结果:LncRNA-p21过表达的胃癌MGC-803细胞发生了形态学的改变,表现为由纺锤状或星状形态变为较圆的低侵袭状态。LncRNA-p21在体内外均抑制了胃癌MGC-803细胞增殖和生长,体外实验表现为lncRNA-p21过表达减弱了胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭能力。LiCl实验验证了Wnt/β-catenin信号通路介导了lncRNA-p21对胃癌MGC-803细胞增殖、迁移与侵袭的抑制作用。结论:LncRNA-p21可在体内外显著抑制胃癌MGC-803细胞的生长与转移,且该抑制作用可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导。     

光动力疗法对人胃癌细胞MGC-803的杀伤性干预

目的:观察5-氨基乙酰丙酸介导的光动力学疗法对人胃癌细胞MGC-803的干预作用,探讨光动力学疗法治疗胃癌的可能作用途径。方法:实验于2004-03/2004-12在全军神经医学研究所完成。试剂5-氨基乙酰丙酸购自美国Sigma公司;MGC-803人胃腺癌细胞株购于中山大学实验动物中心。①分别使用不同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mmol/L,给予相同剂量的激光辐照。②使用相同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,给予不同剂量的激光辐照,能量分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100J/cm2。③使用不同浓度的5-氨基乙酰丙酸培养MGC-803胃癌细胞,浓度分别为0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mmol/L,不予激光辐照。④给予不同剂量的激光辐照培养MGC-803胃癌细胞,能量分别为6.25,12.5,25.0,50.0,100J/cm2,不给予5-氨基乙酰丙酸。以上4个实验均以四甲基偶氮唑盐法检测细胞活力,以不加5-氨基乙酰丙酸、无激光辐照培养的细胞作为空白对照,细胞存活率=处理组细胞吸光度值/对照组细胞吸光度值×100%。⑤培养MGC-803胃癌细胞,随机分为4组,即单纯MGC-803胃癌细胞组、单纯5-氨基乙酰丙酸组、单纯给予激光组及光动力学治疗组,使用吖啶橙-溴化乙锭染色法检测细胞凋亡情况。结果:①5-氨基乙酰丙酸浓度不同、激光辐射剂量相同:随5-氨基乙酰丙酸浓度逐渐递增,MGC-803细胞的存活率逐渐下降,各组细胞存活率之间差异有显著性意义(F=266.39,P<0.01);但在浓度到达2.0mmol/L后,细胞存活率不再随着5-氨基乙酰丙酸的浓度的增加而下降。②激光能量不同、5-氨基乙酰丙酸浓度相同:随着激光剂量的增加MGC-803细胞存活率显著下降,各组细胞存活率之间差异有显著性意义(F=226.31,P<0.01)。③5-氨基乙酰丙酸浓度不同、不给激光辐射:各组细胞存活率之间差异均无显著性意义(F=0.79,P=0.54)。④激光辐射剂量不同、不给5-氨基乙酰丙酸:各组细胞存活率之间差异均无显著性意义(F=0.61,P=0.66)。⑤只有光动力学治疗组出现细胞凋亡现象,而其他细胞组基本无凋亡细胞。结论:在较低的浓度范围内,5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法对人胃癌MGC-803细胞的杀伤作用随着5-氨基乙酰丙酸浓度的增加而增加,在较高浓度时则存在饱和现象,而且杀伤力与光剂量成正比。单纯激光不能产生光动力效应,5-氨基乙酰丙酸本身对细胞无毒性作用。5-氨基乙酰丙酸介导的光动力学治疗能够有效的治疗胃癌,光动力学疗法诱导肿瘤细胞凋亡是其可能作用途径之一。     

熊果酸对人胃癌细胞株MGC-803增殖的影响及机制

目的 观察熊果酸(Ursolic acid, UA)对胃癌细胞株(MGC-803)的抑制增殖作用。方法 培养胃癌细胞株(MGC-803)，以MTT比色法及克隆形成实验测定UA对胃癌细胞株MGC-803抑制增殖的作用。免疫印记法测定p-ERK1/2、Cyclin D1及p21waf/cip1表达。结果 MTT实验及克隆分析法均显示UA明显抑制MGC-803细胞增殖，免疫印记法显示UA抑制p-ERK1/2、Cyclin D1表达，同时上调p21waf/cip1表达。结论 熊果酸可以抑制胃癌细胞株(MGC-803)增殖，机制与影响p-ERK1/2及下游Cyclin D1、p21waf/cip1表达有关。     

人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法的建立

目的建立和优化人骨肉瘤蛋白质组双向电泳图像分析方法。方法对第一向双向电泳的关键因素与环节(如样品处理、电泳参数和凝胶浓度等)进行一系列优化。进一步采用双向凝胶电泳分离骨肉瘤组和正常组总蛋白质,银染显色,Image Master图像分析系统分析电泳图谱。结果重复性实验结果显示同组样品在3次不同实验中所的蛋白质斑点数目相对标准差。(变异系数平均值%):骨肉瘤组和正常组分别为23.00±10.11、20.33±9.90。(变异系数范围%):骨肉瘤组和正常组分别为3.80-6.89、2.70-6.89。同一蛋白质斑点在3次实验中等电点、分子量的相对标准差分别为8.93%±1.17%,10.16%±2.02%和10.87%±3.86%。获得了优于传统实验方法的分辨率和可重复性的双向凝胶电泳图谱。结论优化的双向凝胶电泳图象分析技术适合于骨肉瘤蛋白质组研究。     

沙樱桃脂类对人MGC-803细胞抑制作用的实验研究

目的探讨沙樱桃脂类对人胃癌MGC-803细胞的毒性作用及其机制。方法采用台盼蓝法检测细胞数、流式细胞仪检测细胞凋亡。将人MGC-803细胞分别与不同浓度的沙樱桃脂类(沙樱桃脂组)、5-FU(5-FU组)及PBS溶液(对照组)共同培养,观察沙樱桃脂类对人胃癌MGC-803细胞增殖的抑制作用。结果对人MGC-803细胞分别给予0.5、1.0、3.0mg/L沙樱桃脂类及10mg/L5-FU,培养6h、12h、18h、24h和48h,活细胞数随沙樱桃脂类浓度的增加和作用时间的延长而减少,与5-FU组相似(P>0.05),而与对照组比,差异有统计学意义(P<0.01);分析存活细胞率,表明人MGC-803细胞增殖被阻滞于G0G1期。在给予沙樱桃脂类0.5、1.0、3.0mg/L和5-FU培养48h后,人MGC-803细胞的凋亡率分别为13.8%、19.6%、26.2%和21.1%。结论沙樱桃脂类对人胃癌MGC-803细胞具有显著毒性作用,其机制可能与沙樱桃脂类可抑制MGC-803细胞分裂,并诱导其凋亡有关。