新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景:构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道.目的:观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达.方法:通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒(ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix)共转染293FT细胞.通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选5 d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析.结果与结论:经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群.     

新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用

背景：构建一个组成性表达某特定基因同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒载体目前未见报道。目的：观察新型慢病毒载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP在人骨髓间充质干细胞基因转导中的表达。方法：通过PCR在PEDF基因的两端加上attB位点,构建表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP,将表达载体与包装质粒（ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix）共转染293FT细胞。通过多次感染的方法将慢病毒载体导入人骨髓间充质干细胞,转导后第7天开始使用1～5mg/L嘌呤霉素筛选5d,得到表达PEDF和EGFP的人骨髓间充质干细胞,并进行Western、Elisa的鉴定分析。结果与结论：经PCR和测序证实,慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PEDF-IRES-EGFP构建成功;将其成功导入人骨髓间充质干细胞,经过筛选获得纯化的过表达PEDF基因的绿色荧光细胞群。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建

背景:Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何?目的:构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法:针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论:测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.     

绿色荧光蛋白标记SOX9基因慢病毒载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建绿色荧光蛋白标记的SOX9基因慢病毒载体,转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9基因的表达情况。方法双酶切从GeneArt提供的含SOX9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含SOX9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1,通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的SOX9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),将Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后观察SOX9基因的表达情况。结果测序结果显示质粒pLMIG-13GS0345-1中的插入序列与基因库中SOX9(NM_000346)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后可观察到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP转染目的细胞后可在mRNA及蛋白水平成功表达SOX9。结论本实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带SOX9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,并在兔骨髓间充质干细胞中成功表达,为下一步研究提供前期实验基础。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题.应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题.目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装.方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒.用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序.抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因.pMD1 8-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒.     

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的：构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法：双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体（Lenti-SOX9-GFP）,以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体（Lenti-LMP1-RFP）。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论：测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9（NM_000346）及LMP1（AF345904.1）基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。     

骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较

目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法。方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成。①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率。②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞。转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增。③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率。结果:①脂质体介导的基因转染24h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%。抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆。②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白。当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活。继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白。③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%。但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%。结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因。3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率最低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率最高,最适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯化和扩增,其可能更适合于体内基因直接感染。     

人miR-152基因的慢病毒载体的构建及稳定株筛选

目的构建人miR-152基因重组慢病毒载体并筛选稳定表达株。方法 PCR扩增包括miR-152前体所在区域的基因组DNA,克隆到慢病毒载体表达质粒pGIPZ中,得到重组的pGIPZ-miR-152表达载体,通过与包装质粒共转染HEK-293T细胞,获得携带miR-152 minigene的重组慢病毒。用病毒感染HepG2细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选。用real-time PCR法检测miR-152基因的表达。结果构建的重组质粒经双酶切验证和测序比对鉴定正确;该质粒转染293T细胞获取的慢病毒滴度达7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2细胞,感染效率达70%以上。药物筛选10 d后,获得的过表达株miR-152表达量比正常细胞高近10倍。结论成功构建人miR-152基因慢病毒载体质粒pGIPZ-miR-152,并筛选出miR-152过表达细胞株,为后续实验奠定基础。     

构建含人胰岛素样生长因子基因腺病毒载体及在兔骨髓间充质干细胞的表达

背景:Adeasy腺病毒系统是由T.C.He等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统.相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法,其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒,从而简化了腺病毒的构建和测试流程,而且,它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪,从而在近年来被广泛用作基因转染的载体.目的:用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达.设计:重复测量实验.单位:重庆医科大学儿科研究所.方法:实验于2004-11/2005-03在重庆医科大学儿科研究所完成.①重组腺病毒载体的构建:从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1,按Ad-easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0,电穿孔转化感受态XL-1细菌,扩增后获得重组腺病毒质粒,去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞;②腺病毒包装及扩增:Pae Ⅰ酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0,纯化后转染HEK293细胞,观察GFP的表达,待细胞90%以上漂浮后,冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad-hIGF-1(重组目的腺病毒)和Ad-0(重组空白腺病毒),将收集病毒上清重复多次感染293细胞(乒乓交互感染)以提高病毒滴度.③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5%CO2孵箱培养,隔天换液,10 d细胞融合达70%～80%,贴壁紧密,细胞形态均一,呈典型的涡漩状排列,传代至第3代按病毒感染复数分组转染.主要观察指标:①腺病毒载体的构建及鉴定.②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度.③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达.结果:①重组腺病毒的鉴定:从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中顺利扩增出约400 bp大小的清晰条带,与预期相符;pMDl8-hIGF-1测序结果经Blast2.0比对与公布序列一致性99.9%(281位碱基同义突变,未影响氨基酸翻译:ggffggc-Gly);pAdtraek-CMV空载体和pAdtraek-MGF-1分别双酶切(Kpn Ⅰ和HindⅢ)鉴定正确.质粒pAdEasey-1和Ad-hIGF-1用Pac I酶切鉴定鉴定正确.证实病毒质粒同源重组成功.②荧光表达及滴度测定:重组质粒pAd-hIGF-1经Pac Ⅰ线性化后转化HEK293E细胞,48 h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达,72h表达最强.约5-7 d后细胞出现病毒感染的特征性CPE,由此计算出腺病毒滴度为3.0× 109 pfu/mL.⑨靶细胞的感染及表达效率:病毒转染骨髓问充质干细胞24 h后观察到绿色荧光的表达,72 h左右荧光达到最强.免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现.SDSPAGE电泳在7.8 KD附近出现明显条带,与实际人胰岛素样生长因子-1分子量7.6 kD相符,证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达.结论:本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hlGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-MGF-1,免疫细胞化学和Western Blot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达.     

白血病与非白血病骨髓间充质干细胞对HL-60细胞影响的比较研究

本研究比较急性髓系白血病（AML）骨髓间充质干细胞（BMMSC）,完全缓解AMLBMMSC以及非白血病BMMSC对HL-60细胞的影响。HL-60细胞分为3组：与AMLBMMSC共培养组、与完全缓解AMLBMMSC共培养组以及与非白血病BMMSC共培养纽。在规定时间比较各组HL-60细胞计数、各纽HL-60细胞的CD11b和survivin蛋白表达、各组HL-60细胞周期分布;在光学显微镜下观察各组HL-60细胞形态并比较其分化率。结果表明：第5天和第7天各组HL-60的细胞计数无统计学差异（P值均〉0．05）;各组HL-60细胞G0／G1期细胞分布比例、survivin表达和CD11b表达无统计学差异（P值均〉0．05）;各组HL-60细胞的形态皆向成熟方向转化,分化率分别为18．0±3、17．0±1．3、19．0±2．0,比较表明无统计学差异（P=0．23）。结论：未发现各组骨髓MSC对HL-60细胞增殖分化的影响有差异。     

抗TGF-β1单克隆抗体对脐血CD34^＋细胞体外扩增作用的研究

为了探讨TGF—β1单克隆抗体对脐血CD34^＋细胞的扩增作用,本研究将分离纯化的脐血CD34＋细胞分为3组：①空白对照组：当天分选的新鲜脐血CD34＋细胞;②对照组：含SCF、FLT3-L、IL-3、IL-6四种因子组合的无血清液体培养体系中培养3天的脐血CD34＋细胞;③实验组：条件同对照组,但加入了TGF—β1单克隆抗体。3组均检测单个核细胞（MNC）计数,流式细胞术检测CD34和c—kit,计数混合集落（CFU—GEMM）、红系爆式集落（BFU—E）、粒系集落（CFU—GM）。结果显示：实验组MNC、CD34＋细胞、CD34＋c—kit＋细胞计数分别为[（2．35±0．25）×10^5、（1．16±0．29）×10^5、（1．09±0．26）×10^5],明显高于对照组[（1．25±0．13）×10^5、（0．55±0．19）×10^5、（0．51±0．2）×10^5],（P均〈0．01）。实验组CD34＋c—kit -亚群计数为（12．95±3．17）×10^3,明显高于对照组（1．71±0．83）×10^3,二者相比有显著性差异（P〈0．01）。实验组中早期集落CFU—GEMM、BFU—E的产率[（16．3±4．72）×10^3,（65．0±20．96）×10^3]明显高于对照组[（5．0±2．58）×10^3,（16．25±7．93）×10^3]（P〈0．01）,相对较晚期集落CFU—GM的产率在对照纽[（4．0±2．28）×10^3]和实验组[（6．33±2.85）×10^3]均高于空白组[（0．75±0．29）×10^3],但在对照组和实验组之间无显著性差异（P〉0．05）。此结果表明,TGF—β1单克隆抗体促进了脐血MNC和CD34＋细胞的扩增,且早期细胞CD34＋c—kit -细胞扩增更为突出;提高了早期集落CFU—GEMM和BFU—E的产量,而对相对较晚期的髓系集落CFU—GM的产量无明显影响。结论：TGF—β1单克隆抗体能协同其它生长因子有效扩增脐血CD34＋细胞,并保留一定量更早期的造血祖细胞,减轻了造血祖细胞分化的压力。     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者T细胞亚群及其数量与功能的研究

本研究探讨阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患者T细胞免疫状态及GPI^＋T细胞、GPI—T细胞的数量与功能。采用流式细胞术检测22例PNH患者及18名正常对照T细胞亚群、Th细胞亚群、GPI^＋T细胞、GPI—T细胞分别在CD3^＋T细胞、CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞群中的比例及其CD69的表达。结果显示,PNH患者CD4^＋T细胞占CD3^＋T细胞的比例[（47．7670±13．91139）％]较正常对照组[（54．9592±7．11678）％]降低,CD8^＋T细胞占CD3^＋T细胞的比例[（52．2767±13．90395）％]较正常对照组[（45．2418±6．75306）％]升高,差异均有显著性（P〈0．05）;CD4^＋／CD8^＋比值倒置,以PNH．AA患者最为明显（0．77763±0．409153）,与正常对照组（1．26356±0．348878）相比,差异有显著性（P〈0．05）。PNH患者Th1细胞比例[（16．9136±6．78899）％]较对照组[（4．4600±1．81879）％]升高,差异有显著性（P〈0．05）,PNH—AA患者Th1细胞比例变化[（22．8000±5．45244）％]较发作性PNH患者[（12．0083±2．20770）％]曼为显著,Th2细胞比例[（4．75824±．98441）％]较正常对照组[（3．7960±1．13810）％]无明显变化。PNH患者体内存在一群GPI—T细胞,其占CD8^＋T细胞的（14．67974-11．96718）％,占CD4^＋T细胞的（3．92414-2．46263）％,其占CD8^＋T细胞的比例较占CD4^＋T细胞的比例升高更为明显。PNH患者CD8^＋GPl^＋T细胞[（17．67881±8．562493）％]、CD8^＋GPI—T细胞[（15．86575±7．279743）％]、CD4^＋GPI^＋T细胞（4．65431±1．984378）％]、CD4^＋GPI—T细胞[（4．93181±1．730001）％]c1969的表达均高于正常对照组[CD8^＋T细胞（4．68038±1．216645）％,CD4^＋T细胞（1．77339±0．645259）％],差异有显著性（P〈0．05）,GPI^＋T细胞CD69的表达与GPI—T细胞相比,差异并无显著性。结论：PNH患者存在T细胞免疫功能亢进,其可能是造成骨髓衰竭的原因,但与T淋巴细胞组分中含有PNH克隆可能无关。     

骨形态蛋白2诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 观察骨形态蛋白2体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs进行诱导:骨形态蛋白2组(BMP-2,终浓度为10 μg/L),空白对照组.诱导24h后更换常规培养液继续培养4周.倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,Western Blot检测诱导2周和4周后Cx43以及cTnI的表达量,流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导分化率.结果 原代培养的BMMSCs 2周形成集落,呈梭形或星形.传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长,并出现肌岛样结构.免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达cTnI.Western Blot检测结果提示诱导后Cx43以及cTnI均明显增多,4周组明显高于2周组.流式细胞计数法显示:BMP-2组心肌样细胞诱导率为(17.9±0.8)％.结论 骨形态蛋白2可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高.     

间充质干细胞调控趋化因子配体2对系统性红斑狼疮作用的机制探讨

目的:探讨趋化因子配体2[chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2]在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)中的作用。方法:采用酶联免疫吸附试验检测SLE患者及正常对照者的血清、尿液及骨髓MSCs培养上清中的CCL2及白细胞介素(interleukin,IL)-17的表达水平,并采用流式细胞术检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17-CD4+IL-17+的百分率及其表面CCR2的表达。将18只雌性MRL/lpr SLE小鼠随机分为SLE小鼠组(n=6)(未治疗组)、脐带MSCs移植联合CCL2中和抗体治疗SLE小鼠组(n=6)及脐带MSCs移植联合同型对照IgG2B治疗SLE小鼠组(n=6),另选6只同周龄雌性C57BL/6小鼠作为健康阴性对照组。采用酶联免疫吸附试验检测各组血清CCL2及IL-17的水平,流式细胞术检测各组PBMCs中CD4+CCR2+IL-17+细胞百分率。结果:SLE患者血清[(839.0±160.5)pg/mL]、尿液[(881.8±162.7)pg/mL]及骨髓MSCs培养上清[(22 935±2 304)pg/mL]的CCL2含量均显著高于正常对照者[(433.0±31.0)pg/mL、(222.7±52.8)pg/mL、(8 394±5 125)pg/mL];SLE患者PBMCs中CD4+CCR2+IL-17+细胞百分率较正常对照者显著升高(P<0.01)。脐带MSCs移植联合CCL2中和抗体治疗SLE小鼠组血清CCL2浓度显著低于未治疗组,PBMCs中CD4+T细胞亚群IL-17、CCR2表达较未治疗组显著降低。结论:MSCs移植治疗SLE的效果可能通过抑制CCL2表达,进而下调患者Th17细胞水平来实现。     

哮喘患儿外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的变化及其与过敏体质和IgE水平的关系

目的探讨哮喘患儿外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Tr）的变化及其与过敏体质和IgE水平的关系。方法应用流式细胞术检测70例哮喘患儿的Tr细胞数变化,采用酶联免疫法（ELISA）检测血清中IgE含量。结果急性发作期组患儿外周血Tr水平[（6．17±1．72）％]明显低于缓解期组患儿[（7．56±1．48）％]和对照组儿童[（7．13±1．48）％]（均P〈0．05）;而缓解期患儿外周血Tr水平与对照组儿童比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。有过敏体质患儿外周血Tr水平[（5．53±1．18）％]明显低于无过敏体质患儿[（6．40±2．00）％]（P〈0．05）。哮喘组患儿外周血Tr水平[（6．17±1．72）％]与其外周血IgE水平[（144．86±14．74）IU／ml]呈负相关（rP=-0．435,P〈0．05）。结论外周血Tr水平在哮喘患儿发作期显著降低,而在有过敏体质的患儿更低,并与外周血IgE水平呈显著的负相关性。     

骨形态发生蛋白2与P53抑制剂PFT-α联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 观察骨形态发生蛋白2（BMP-2）与P53抑制剂PFT-α体外联合诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs）定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs分四组诱导：（1）空白对照组,仅用完全培养基诱导;（2）骨形态发生蛋白2组（BMP-2,终浓度10 μg/L）;（3）P53抑制剂组（PFT-α,终浓度20 μmol/L）;（4）BMP-2联合PFT-α组（BMP-2＋ PFT-α,终浓度分别为10 μg/L与20 mol/L）.24h后换为普通培养液继续培养4周.用倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变,免疫细胞化学法鉴定诱导后心肌样细胞中心肌特异标志物性肌钙蛋白Ⅰ （cTnⅠ）的表达,流式计数法计算诱导后心肌样细胞诱导率.结果 原代BMMSCs 10 d形成集落,呈星形或梭形.传代后细胞体积变大,诱导4周后细胞呈长梭形,生长趋于一致性,出现肌岛样结构.免疫细胞化学结果显示诱导4周后BMMSCs表达心肌特异性蛋白cTnⅠ.流式计数法结果显示：空白对照组、BMP-2组、PFT-α、BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导率分别为（1.4±0.3）％、（17.1±1.2）％、（28.2±1.0）％、（39.9±1.7）％,BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导分化率高于BMP-2组与PFT-α组（P＜0.01）.结论 BMP-2联合PFT-α可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率明显高于单纯BMP-2或单纯PFT-α诱导.     

急性髓系白血病和非白血病骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

本研究旨在比较急性髓系白血病的间充质干细胞（MSC）、急性髓系白血病完全缓解后骨髓MSC以及非白血病的MSC的三者生物学特性。将骨髓MSC分为3组：白血病组、完全缓解组以及非白血病组。采用光学显微镜观察各组MSC的形态学特征,在原位瑞氏染色后计数各组CFU-F数,计数各组MSC的融合时间,绘制各组MSC的生长曲线,应用流式细胞仪检测各组MSC的免疫表型及细胞周期并计算DI值。结果发现,3组骨髓MSC的形态无差异;3组原代MSC的CFU-F数有差异（P=0．01）,其中白血病组MSC的CFU—F最少;3组原代MSC的融合时间有差异（P〈0．01）,其中白血病MSC组的融合时间最长;在第3、5、7天对3组MSC（第2代）的细胞计数进行比较,结果无显著性差异（P〉0．05）;3组MSC（第二代）免疫表型检测显示CD105、CD106均为高表达,CIM5表达阴性,3组间结果比较无差异（P值分别为0．37、0．50）;各组MSC（第二代）的G0／G1期细胞比例分别为（89．9±4．0）％,（90．2±3．0）％,（91．0±3．0）％,3组比较未显示差异（P=0．79）。3组MSC的DI值都在0．9-1．1范围之内。结论：在对白血病与非白血病的第二代MSC的生物学特性比较中,未发现有显著性差异。     

脊柱手术出血中间充质干细胞的分离鉴定及数量变化

背景：临床骨科松质骨区手术中有较多红骨髓随术区出血而浪费丢失。目的：分析从脊柱手术出血中分离骨髓间充质干细胞的可行性及骨髓间充质干细胞数与收集血液时间和年龄的关系。方法：入选3例腰椎退变不稳和16例腰椎爆裂骨折患者,20~30岁4例、30~40岁5例、40~50岁5例、50~60岁2例,64岁1例、65岁1例、67岁1例,均行后路椎弓根钉棒系统内固定治疗。术中手锥钻开椎弓根拔出手锥后立即收集0~5min时段的钉道出血标本4例各5mL,用于细胞鉴定。另15例拔出手锥后0~5min、5~10min、10~15min3个时段,取椎骨出血标本各5mL分离出其中的单个核细胞接种于6孔板,培养3d后全量换液除去未贴壁细胞、苏木精原位染色并计数。结果与结论：免疫细胞化学法鉴定显示贴壁细胞细胞膜抗原CD34、CD14表达阴性,CD44、CD29表达阳性。0~5min时间段的椎骨出血标本中的贴壁细胞数为262.47±172.20,5min以后出血标本中的贴壁细胞数极少甚至没有。0~5min时间段组血液标本中的骨髓间充质干细胞数随年龄增长而减少。     

免疫性血小板减少症患者骨髓滤泡辅助性T细胞数量及功能的研究

本研究检测免疫性血小板减少症（ITP）患者骨髓滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）数量及功能,探讨Tfh细胞在ITP发病机制中的作用。选取2013年1月至10月在天津医科大学总医院血液科就诊的21例初治ITP患者、20例恢复期ITP患者及18名正常对照者,采用流式细胞术检测骨髓Tfh细胞数量、Tfh细胞功能相关分子CD40L、ICOS、IL-21的表达,采用RT-PCR技术检测BMMNC转录因子BCL-6mRNA相对表达水平;并将各项指标与疾病严重程度进行相关性分析。结果表明,ITP初治组骨髓CD4＋CXCR5＋／CD4＋细胞比例[（5．532±2．599）％]高于恢复期组[（4．064±2．026）％]和对照组[（4．048±1．413）％]（P〈0．05）;ITP初治组骨髓CD4＋CXCR5＋ICOS＋／CIM＋CXCR5＋细胞比例[（14．586±8．561）％]高于恢复期组[（12．884±10．161）％]和对照组[（7．487±5．176）％],初治组与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）;ITP初治组和恢复期组骨髓CIM＋CXCR5＋CD40L＋／CD4＋CXCR5＋细胞比例[（15．309±10．756）％]及[（18．242±12．243）％],高于对照组[（8．618±5．719）％]（P〈0．05）;ITP初治组和恢复组骨髓CD4＋CXCR5＋IL-21＋／CD4＋CXCR5＋细胞比例1（58．560±26．285）％]及[（57．035±30．936）％]高于对照组[（36．289±24．868）％]（P〈0．05）;初治组、恢复组、对照组BCL-6mRNA的表达水平分别为（1．407±0．264）、（1．149±0．217）和（0．846±0．157）,差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。结论：Tfh细胞在ITP患者的骨髓中数量增加,功能分子表达增多,功能亢进,在ITP发病机制中可能有重要作用。