黄芩素、阿维A诱导人皮肤鳞状细胞癌SCL-12细胞凋亡的研究

目的 探讨黄芩素、阿维A对人皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-12细胞凋亡的影响。方法 不同浓度黄芩素、阿维A单独及联合作用于SCL-12细胞,噻唑蓝（MTT）法检测上述药物对SCL-12细胞的生长抑制作用;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法和ELISA法检测SCL-12细胞凋亡率;实时荧光定量RT-PCR法检测Fas mRNA的表达。结果 黄芩素、阿维A单独及联合应用均可抑制SCL-12细胞的生长,除3.125 μmol/L黄芩素与2.5 μmol/L阿维A联合用药组外,其余各联合用药组与单药作用组相比,抑制作用明显增强,且抑制作用随用药浓度的增加而增强。3.125 μmol/L黄芩素、5.0 μmol/L阿维A单独及联合应用48 h后均可诱导SCL-12细胞凋亡,早期凋亡率分别为9.39% ± 1.52%、20.86% ± 2.16%、36.85% ± 3.26%,与对照组（4.39% ± 0.64%）比较,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）;联合用药组对SCL-12细胞凋亡的诱导作用显著强于单药作用组,差异有统计学意义（F = 138.44,P < 0.05）。黄芩素、阿维A单独及联合应用48 h后均可上调SCL-12细胞Fas mRNA表达水平,联合用药组SCL-12细胞的Fas mRNA表达水平显著高于单药作用组。结论 黄芩素、阿维A单独及联合应用均能抑制SCL-12细胞生长并诱导其凋亡,两种药物的联合应用对SCL-12细胞具有协同效应,其发生机制可能与上调Fas凋亡调控基因的表达有关。     

三种维A酸对皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1凋亡及Caspases的影响

目的 探讨三种维A酸（全反式维A酸、阿维A及他扎罗汀）对人皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1的生长抑制和凋亡的诱导作用以及对Caspases的影响。方法 以体外培养的SCL-1细胞为研究对象,采用四甲基噻唑蓝比色法观察三种维A酸对 SCL-1细胞的生长抑制作用,ELISA及膜联蛋白V/PI法检测细胞凋亡的诱导情况,流式细胞仪检测细胞周期,Western印迹分析Caspases 8和Caspases 9表达。结果 浓度为1 × 10-5 mol/L的3种维A酸均能抑制SCL-1细胞的生长,并具有时间依赖性。3种维A酸均能不同程度地诱导SCL-1细胞凋亡,将细胞阻滞于G1期,活化Caspases 8和Caspases 9。其中阿维A作用最为显著。结论 维A酸能抑制皮肤鳞状细胞癌细胞生长及诱导凋亡,这一效应可能由死亡受体和线粒体途径共同介导。     

Bcl-2对皮肤鳞状细胞癌细胞系SCL-1细胞Fas凋亡通路调控的研究

目的 建立稳定转染bcl-2的鳞状细胞癌（鳞癌）细胞系，研究人皮肤鳞癌细胞凋亡的相关通路。方法 应用脂质体介导的基因转染法，将含有bcl-2 cDNA的逆转录病毒表达载体pIRESneo质粒导入皮肤鳞癌细胞系SCL-1细胞中，并以空质粒作为对照。经过G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆，细胞扩大培养后用细胞免疫荧光染色法、RT-PCR和免疫蛋白印迹检测bcl-2的表达情况。然后用C2-ceramide和抗Fas单克隆抗体诱导细胞株凋亡，利用ELISA法检测可溶性DNA-组蛋白复合物，分析其凋亡的差异。结果 转染了pIRESneo- bcl-2的SCL-1细胞bcl-2蛋白和mRNA表达阳性，而转染了pIRESneo空载体的SCL-1细胞为阴性。不同浓度的C2-ceramide对SCL-1/bcl-2凋亡的诱导差异均无统计学意义，而对SCL-1/vector诱导的凋亡差异均有统计学意义。抗Fas单克隆抗体对SCL-1/bcl-2和SCL-1/vector诱导的凋亡，差异均有统计学意义，P ＜ 0.01。结论 用基因转染法成功地建立了稳定高表达bcl-2蛋白的SCL-1细胞系，C2-ceramide诱导的SCL-1凋亡基本可以被bcl-2阻滞，而Fas所诱导的凋亡仅部分被阻滞，即SCL-1细胞系在被阻断了线粒体途径后，还可以经由死亡受体通路进行凋亡     

RNA干扰神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对鳞状细胞癌SCL-1细胞的影响

目的 探讨神经突起导向因子 Netrin-1表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）SCL-1细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 脂质体2000将Netrin-1 siRNA和对照siRNA转染皮肤鳞癌SCL-1细胞。将细胞分为对照1组（未处理组）、对照2组（siRNA对照组）、实验组（Netrin-1 siRNA组）。Western印迹检测转染Netrin-1 siRNA后SCL-1细胞Netrin-1蛋白的表达。人胆囊收缩素/缩胆囊素8肽（CCK-8）ELISA试剂盒分析细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Western 印迹检测caspase-3、caspase-9及MMP-2的表达。结果 Netrin-1 siRNA明显下调SCL-1细胞中Netrin-1蛋白的表达。Netrin-1表达下调明显抑制SCL-1细胞的增殖和诱导细胞凋亡,增加caspase-3和caspase-9的表达,同时可显著抑制MMP-2的表达。结论 Netrin-1表达下调可介导鳞癌细胞增殖抑制、增高细胞凋亡率和降低细胞迁移能力。     

咪喹莫特对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株增生及凋亡的影响

目的 探讨咪喹莫特对体外培养人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株的增生抑制及凋亡诱导作用.方法 采用MTT法分析咪喹莫特对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的增生,倒置显微镜观察细胞形态学,AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡晚期形态改变,细胞死亡检测试剂盒检测细胞凋亡的程度,细胞免疫组化和RT-PCR检测凋亡相关基因Fas、bcl-2的表达.结果 咪喹莫特可明显抑制人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的增殖,并可导致其形态学改变.经0.150mg/mL咪喹莫特作用后24h,SCL-1细胞早期凋亡率最大,达47.23%;作用48h,可见典型凋亡小体.SCL-1细胞凋亡程度随咪喹莫特浓度增高、作用时间延长呈递增关系,经咪喹莫特作用后可上调Fas和下调bcl-2基因表达.结论 咪喹莫特可明显抑制SCL-1肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡.     

阿维A对人表皮鳞状细胞癌A431细胞株生长及凋亡的影响

目的 研究阿维A对上皮鳞状细胞癌(鳞癌)细胞生长的影响及其诱导凋亡作用。方法 以体外培养的人表皮鳞癌细胞A431细胞和角质形成细胞HaCaT细胞为研究对象,用MTT法观察阿维A对A431细胞和HaCaT细胞的生长抑制作用,用光镜和电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测凋亡峰的出现,Annexin-V染色证实凋亡的发生。结果 随着阿维A作用时间的延长及剂量的增加,对A431细胞增殖的抑制作用增加。同样浓度和同样作用时间的阿维A对A431细胞增殖的抑制率高于对HaCaT细胞的抑制率。光镜和电镜观察显示随阿维A作用时间延长,A431凋亡细胞增多。流式细胞仪检测显示随阿维A作用时间的延长,亚G1期凋亡峰明显增加,Annexin-V染色阳性细胞数增多。结论 阿维A具有抗上皮鳞癌细胞生长及诱导上皮鳞癌细胞凋亡作用。     

皮肤肿瘤

20141449 P38 MAPK在光动力疗法杀伤皮肤鳞状细胞癌细胞中的作用/刘建平（宁夏医科大学）,唐真真,侯晶梅…//中国皮肤性病学杂志.-2014,28（4）.-341～345 将SCL-1细胞分为空白对照组、ALA组、激光照射组、ALA-PDT组和P38阻断剂ALA-PDT组。Western blot检测各组细胞干预30min,60min和90min后磷酸化P38,Elk-1的表达;Western blot检测P38阻断剂ALA-PDT组细胞多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的表达。     

渥曼青霉素通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖

目的研究渥曼青霉素对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡及PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响。方法 CCK8法检测A431细胞增殖活性,Caspase-glot-3/-9活性测定试剂盒检测Caspase-3/9活性,Western blot实验分析Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、p-P85(Y458)、p-AKT(S473和T308)和p-S6K(T389)蛋白表达水平,ELISA法检测单链DNA(ss DNA)的水平,流式细胞术检测A431细胞凋亡率。结果渥曼青霉素(0.5~6μmol/L)处理A431细胞48 h后,呈浓度和时间依赖性的抑制细胞增殖、诱导Caspase-3/9活性的增强、增高了细胞凋亡标志物ss DNA水平、还促使了促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达;4μmol/L的渥曼青霉素处理细胞48 h后,能明显诱导A431细胞的早期和晚期凋亡,还显著抑制了P85(Y458)、AKT(S473和T308)和S6K(T389)的磷酸化水平;渥曼青霉素相比于同浓度的PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制剂(LY3023414、纳巴霉素、OSI-027和MK-2206)抗A431细胞增殖的活性更强。结论渥曼青霉素通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导降低了人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖活性,诱导了细胞凋亡。     

Notch1基因对裸鼠皮肤鳞状细胞癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Notch1基因在人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞裸鼠移植瘤中的作用。方法 于裸鼠腋下接种0.2 ml 1 × 108/ml的SCL-1细胞悬液,建立人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型,将其分为三组：未处理组（接种PBS悬浮的未转染细胞）,空载体转染组（接种空载体转染的细胞）和Notch1转染组（接种Notch1转染的细胞）。连续2周观察转染荷瘤裸鼠的生长情况,采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）研究肿瘤组织中的细胞凋亡,利用RT-PCR和Western印迹研究肿瘤组织中Notch1、bcl-2和bax mRNA和蛋白的表达。结果 Notch1转染组中肿瘤的生长明显受到抑制,其肿瘤的重量为（0.574 ± 0.219） g,显著低于未处理组（2.642 ± 0.404） g和空载体转染组（2.606 ± 0.512） g（F = 26.642,P 值均 < 0.01）。TUNEL结果表明,Notch1转染组每500个细胞中凋亡的细胞数为87 ± 9,明显高于未处理组（8 ± 2）和空载体转染组（10 ± 3）中细胞凋亡的数目（P < 0.05）;此外,RT-PCR和Western印迹结果表明Notch1转染组中裸鼠肿瘤组织Notch1和bax mRNA和蛋白表达均显著上升,而bcl-2的表达显著下调,三组间比较差异具有统计学意义（P值均 ＜ 0.05）。结论 Notch1基因能抑制人皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1裸鼠皮下移植瘤的生长,诱导SCL-1细胞凋亡,后者可能与bax表达的上升和bcl-2表达的下调相关。     

γ-干扰素、全反式维A酸对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞表达生存素的影响

目的 探讨γ-干扰素、全反式维A酸(ATRA)对皮肤鳞状细胞癌细胞株(SCL-1)表达生存素的影响。方法 采用RT-PCR、免疫印迹(Western blot)分析方法分别检测γ-IFN、ATRA作用前后SCL-1细胞株生存素mRNA及蛋白表达的差异。结果 γ-IFN处理后,生存素在SCL-1细胞表达较对照组明显下降(P<0.05),且具有时间依赖性和剂量依赖性;ATRA可以增强γ-IFN对生存素的抑制作用。结论 γ-IFN联合ATRA诱导皮肤鳞状细胞癌细胞发生细胞凋亡的机制之一可能与下调生存素的表达相关。     

阿维A对鼠B16黑素瘤的增殖抑制及诱导分化作用

目的 探讨阿维A对鼠B16黑素瘤移植瘤的增殖抑制及诱导分化可能的作用机制。方法 小鼠黑素瘤B16细胞接种C57BL/6J小鼠,观察阿维A及其联合顺铂对移植瘤生长状态的影响。应用HE染色观察移植瘤形态学改变;免疫组化法检测肿瘤组织中生存素、促细胞凋亡蛋白Fas及血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果 阿维A能显著抑制鼠B16黑素瘤的生长,各治疗组瘤重及瘤体积均低于阴性对照组（P < 0.05）。HE染色观察瘤组织：对照组瘤组织边界不清,细胞密集排列,异形性明显,治疗组瘤组织中心及边缘可见不同程度的大片状或灶性坏死。免疫组化结果显示：生存素和VEGF蛋白的表达在阿维A高剂量组及联合用药组的免疫组化评分分别为3.600 ± 0.966,2.100 ± 0.568和4.600 ± 0.966,2.400 ± 0.516,均低于对照组5.900 ± 1.370,6.100 ± 1.197（P < 0.01,P < 0.01）,Fas蛋白的表达均高于对照组（P < 0.01）,且各治疗组生存素的表达与Fas的表达呈负相关（rs = -0.77,P < 0.01）,与VEGF的表达成正相关（rs = 0.72,P < 0.01）。结论 阿维A能抑制鼠B16黑素瘤增殖,诱导其分化,作用机制可能与下调抑凋亡基因生存素、上调促凋亡基因Fas的表达及抑制VEGF的表达有关。     

苦参素注射液联合阿维A对银屑病患者Th17细胞及相关细胞因子的影响

目的：明确苦参素注射液联合阿维A对银屑病患者Th17细胞及相关细胞因子表达的影响。方法：选取100例银屑病患者,随机分为观察组（50例）和对照组（50例）。观察组口服阿维A胶囊联合苦参素注射液治疗,对照组仅口服阿维A胶囊。苦参素注射液0.6 g/d,每日1次,共4周。阿维A胶囊 20 mg/次,2次/d,共8周。ELISA检测外周血Th17细胞比例及相关细胞因子表达水平。结果：观察组和对照组Th17细胞百分比分别为（1.0±0.4）%、（2.4±0.8）%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。观察组血清IL-6、IL-17 、IL-23、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平分别为（5.5±0.6）ng/L、（23.7±4.5）ng/L、（69.2±8.5）ng/L、（643.1±68.7）ng/L,对照组分别为（7.4±1.0）ng/L、（40.6±9.2）ng/L、（104.8±11.9）ng/L、（871.4±94.3）ng/L,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：苦参素注射液治疗银屑病,可显著提高阿维A临床疗效,调节Th17细胞可能是其作用机制。     

三种黄芩提取物诱导人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞凋亡的研究

目的 探讨黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种黄芩提取物对人皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-1细胞凋亡的影响。 方法 将培养的SCL-1细胞分别用浓度为12.5、25、50、75、100 μmol/L的3种黄芩提取物作用12、24、48 h后,噻唑蓝（MTT）法检测上述药物对SCL-1细胞的生长抑制作用。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测SCL-1细胞凋亡率。流式细胞仪检测细胞周期。应用线性内差法,测定半数抑制浓度（IC50）;两样本均数比较用Student t检验;多样本均数比较采用方差分析,各样本之间多重比较采用SNK-q检验。 结果 3种黄芩提取物均可抑制SCL-1细胞的生长,并具有浓度及时间依赖性（均P ＜ 0.01）;在相同的药物浓度及作用时间下,黄芩素对SCL-1细胞生长抑制作用最强,黄芩苷抑制作用最弱,汉黄芩素抑制作用介于二者之间,差异具有统计学意义（均P ＜ 0.01）。12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别作用SCL-1细胞48 h均可诱导SCL-1细胞凋亡并阻滞细胞周期的进程,其中G1期细胞比例分别为56.37% ± 2.41%、74.23% ± 2.02%、64.15% ± 1.87%,早期凋亡率分别为8.09% ± 1.02%、24.13% ± 0.76%、14.45% ± 1.57%,与对照组（45.04% ± 1.93%,4.12% ± 0.29%）比较,差异均有统计学意义（F = 83.29,186.37,均P ＜ 0.01）;其中黄芩素作用最强,其次为汉黄芩素,黄芩苷作用最弱。 结论 黄芩能抑制SCL-1细胞生长并诱导其凋亡,为皮肤鳞状细胞癌的中药治疗开拓新的思路。