脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞；用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞；以MTT测定诱导细胞的增殖活性；免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达；诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化，且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高，移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

TGF-β1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的TGF-β1基因转染条件、剂量及基因治疗的安全性,体外将TGF-β1基因转入骨膜源间充质干细胞(MSCs),用水貂肺上皮细胞生长抑制法、透射电镜及软琼脂培养等方法检测.结果发现转基因MSCs表达的TGF-β1具有生物学活性.当3μl脂质体介导1μgTGF-β1基因转染时,能获得最佳转染效率和促MSCs增殖及向成软骨方向定向分化效应;转基因细胞无恶性转化倾向.从而把组织工程学与分子生物学有机结合成为分子组织工程学,为高质量地修复关节软骨缺损奠定了良好的基础.     

TGF-β_1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的 TGF-β1 基因转染条件、剂量及基因治疗的安全性 ,体外将TGF-β1 基因转入骨膜源间充质干细胞 ( MSCs) ,用水貂肺上皮细胞生长抑制法、透射电镜及软琼脂培养等方法检测。结果发现 :转基因 MSCs表达的 TGF-β1 具有生物学活性。当 3μl脂质体介导 1μg TGF-β1 基因转染时 ,能获得最佳转染效率和促 MSCs增殖及向成软骨方向定向分化效应 ;转基因细胞无恶性转化倾向。从而把组织工程学与分子生物学有机结合成为分子组织工程学 ,为高质量地修复关节软骨缺损奠定了良好的基础。     

bFGF真核表达质粒的构建及骨髓基质细胞转染

目的 探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法 及可行性.方法 构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过形态学观察、免疫组化、ELISA法、及RT-PCR方法 检测bFGF基因转染骨髓基质干细胞的成功性,以及转染后骨髓基质干细胞的生物学特性.结果 bFGF基因成功转染骨髓基质干细胞,并能持续稳定的分泌bFGF蛋白,可诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化.结论 bFGF基因可以转染骨髓基质干细胞,并能诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化.     

IGFBP7促进人脐带间充质干细胞的软骨分化

目的：探究胰岛素样生长因子结合蛋白7（insulin?like growth factor?binding protein 7,IGFBP7）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord?derived mesenchymal stem cells,hUC?MSCs）软骨分化的影响。方法：用软骨诱导培养基高密度成球培养hUC?MSCs,诱导成软骨分化,通过real?time PCR和Western blot检测软骨分化标志基因Sox9的表达,甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖的表达,以反映细胞外基质沉积情况;real?time PCR和Western blot检测IGFBP7在hUC?MSCs软骨分化过程中的表达情况;在hUC?MSCs中分别瞬时转染IGFBP7的表达质粒和siRNA以改变内源性IGFBP7表达水平,然后成软骨诱导,采用甲苯胺蓝染色,real?time PCR和Western blot检测IGFBP7表达变化对于hUC?MSCs成软骨分化的影响。结果：在hUC?MSCs成软骨分化过程中,IGFBP7 mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高。与对照组相比,过表达IGFBP7的hUC?MSCs经成软骨诱导后,Sox9表达量显著升高,甲苯胺蓝染色更深,软骨分化能力更强。反之,敲低IGFBP7表达后,hUC?MSCs的软骨分化能力降低。结论：IGFBP7促进人脐带间充质干细胞成软骨分化。     

生长分化因子5诱导骨髓间充质干细胞成软骨细胞的实验研究

目的研究生长分化因子5(Growth and differentiation[actor 5,GDF5)在诱导骨髓间充质干细胞(bonemarrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成软骨分化中的作用。方法通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,利用腺病毒载体将GDF5基因导入骨髓间充质干细胞,通过Safranin-O染色和甲苯胺蓝染色检测硫酸糖胺聚糖和蛋白聚糖、RT-PCR和免疫化学染色检测软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白的表达,探索GDF5腺病毒对BMSCs成软骨分化的诱导作用。结果 GDF5腺病毒感染的BMSCs细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量显著增加,软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白表达升高。结论本研究结果表明,GDF5能够显著促进脂肪间充质干细胞的成软骨分化。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

TGF—β1基因转染间充质干细胞的量效关系及安全性研究

为探讨能获得最佳转染效率和促增殖分化效应的TGF－β1基因转染条件，剂量及基因治疗的安全性，体外将TGF－β1基因转入骨膜源间充质干细胞（MSCs) , 用水貂肺上皮细胞生长抑制法，透射电镜及软琼脂培养等方法检测，结果发现：转基因ＭＳＣs表达基因TGF-β1具有生物学活性，当３μ１脂质体介导１μgＴＧＦ－β１基因转染时，能获得最佳转染结合成为分子组织工程学，为高质量地修复关节软骨损损奠定了良好的基础。     

Smad3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）信号转导通路下游信号分子Smad2、Smad3在TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）成骨分化中的作用。方法采用RT-PCR、Western blot检测TGF-β1促MSCs成骨分化过程中Smad2、Smad3mRNA和蛋白表达的变化;脂质体介导稳定转染Smad3ΔC,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶（ALP）和核心结合因子（cbfa1）mRNA的表达,用对硝基苯磷酸盐（PNP）法检测细胞ALP活性,用茜素红染色法检测细胞矿化能力,观察Smad3ΔC对MSCs成骨分化的影响。结果在TGF-β1刺激后24h,MSCs中Smad3的mRNA和蛋白表达量明显减少（P〈0.01）,而整个刺激过程中,Smad2的mRNA和蛋白表达量无明显变化（P〉0.05）;稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSCs和V-MSCs（空载体转染组）中ALP、cbfa1mRNA的表达水平、矿化能力明显高于Smad3ΔC-MSCs;随TGF-β1刺激时间延长,Smad3ΔC-MSCs中ALP活性增加缓慢,仅于48h有明显增加（P〈0.05）,但与同时段MSCs和V-MSCs中ALP活性相比,差异有极显著性意义（P〈0.01）。结论TGF-β1促进MSCs成骨分化这一生物学效应的输出受Smad3特异性和选择性的调节。     

间充质干细胞在构建组织工程软骨中的实验研究

目的探索利用几丁质支架和间充质干细胞(MSC)构建组织工程软骨。方法抽取兔股骨骨髓,密度梯度离心分离骨髓MSC,用转化生长因子β(1TGF-β1)诱导第3代的骨髓MSC向软骨方向分化,2周后用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,接种在几丁质支架上,用含TGF-β1的培养基继续培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,并在电镜下观察软骨细胞的生长情况。结果骨髓MSC经TGF-β1诱导后,具有软骨细胞特点,接种在几丁质支架上继续培养2周,这些细胞在支架上生长良好,并仍能很好表达Ⅱ型胶原。结论MSC经TGF-β1诱导,分化成的软骨样细胞在几丁质支架上表型稳定,生长良好。     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

重组质粒pEGFP-N1-apoJ的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 体外构建重组质粒pEGFP-N1-apoJ，转染大鼠骨髓间充质干细胞，并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法 通过脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染大鼠骨髓间充质干细胞，确定转染效率，并通过Real-time PCR、免疫细胞化学法、Western blot法检测载脂蛋白-J（apoJ）的表达。结果 增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞中瞬时转染效率达35%。转染后Real-time PCR、免疫细胞化学法和Western blot法检测证实重组质粒pEGFP-N1-apoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结论 重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染大鼠骨髓间充质干细胞，并在大鼠骨髓间充质干细胞中得到表达,有助于应用apoJ行基因治疗,为进一步研究apoJ作为新的脑出血治疗措施奠定实验基础。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

转化生长因子-β3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的：构建含有转化生长因子-β3（Transforming growth factor-β3,TGF-β3）和增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的腺病毒载体,使其转染兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,并在细胞内得到表达。方法：将含有TGF-β3基因克隆至含有EGFP的穿梭质粒,通过在感受态菌DH5α内同源重组,构建 pAdxsi-EGFP-TGF-β3。PacⅠ酶切线性化pAdxsi-EGFP-TGF-β3转染HEK293细胞,多轮“乒乓感染法”扩增收集 pAdxsi-EGFP-TGF-β3 病毒液,氯化铯梯度离心纯化,PCR和荧光显微镜观察EGFP的表达并检测重组腺病毒液的滴度。测定重组腺病毒液转染 MSCs 细胞转染效率,Western blot检测 TGF-β3 蛋白表达。结果：成功构建携带 TGF-β3和EGFP 的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3,PCR和绿色荧光证实病毒包装成功,并具有感染力,病毒滴度为 2×1010 pfu/ml。Western blot 检测表明Adxsi-EGFP-TGF-β3感染的 兔骨髓MSCs 细胞有效表达 TGF-β3。结论：含有 TGF-β3 和EGFP的腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3构建成功和TGF-β3蛋白在兔骨髓MSCs中有效表达,为进一步研究转染TGF-β3 基因的兔骨髓MSCs 减轻创面愈合后瘢痕组织增生提供实验基础。     

转化生长因子β_1基因修饰的间充质干细胞/仿生基质材料的体外复合培养

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)基因转染对间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响,评价涂覆多聚赖氨酸(PLYS)的聚DL乳酸(PDLLA) 仿生基质材料能否作为关节软骨组织工程学研究的支架材料。方法 将组织工程学与分子生物学有机结合,体外将具有多重生物学效应的TGF-β_1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞--间充质干细胞（MSCs）,并与表面涂覆PLYS的PDLLA可降解三维多孔基质材料体外复合培养。以单纯空载体转染MSCs为对照,通过扫描电镜等方法观察种子细胞的粘附、增殖及分化等情况。结果 基质材料孔隙率为88%,其中孔径为150～200μm的有效孔占80%。所有细胞均能很好地粘附于基质材料上,其中TGF-β_1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。结论 利用分子组织工程学原理可使TGF-β_1持续高效发挥作用,使提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。涂覆PLYS的PDLLA仿生基质材料不仅具有良好的生物相容性和结构相容性,而且具有更好的表面相容性和生物学活性,在一定程度上解决了细胞-基质材料之间存在的界面不相容问题,是关节软骨缺损修复的良好基质材料。     

HO-1基因转染对骨髓间充质干细胞增殖、 表型及多向分化能力的影响

目的 探讨在体外培养条件下,慢病毒载体介导的血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染对骨髓间充质干细胞(MSC)增殖、表型及多向分化能力的影响。方法 分离培养大鼠源性骨髓MSC,利用过表达HO-1重组慢病毒载体(lenti-HO-1)将HO-1基因转染到MSC中,用荧光倒置显微镜及Western blot法分析评估转染效率。利用1.5μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定过表达HO-1的MSC(MSC-HO-1)。用Western blot法检测MSC与MSC-HO-1内HO-1蛋白表达情况,用细胞计数法绘制MSC与MSC-HO-1的生长曲线,流式细胞仪检测MSC与MSC-HO-1表型,成骨、成脂及成软骨细胞诱导分化检测多向分化潜能变化。结果 MOI=50的 Lenti-HO-1可高效转染MSC。与MSC比较,MSC-HO-1在经过多次传代后仍能高效过表达HO-1,差异有统计学意义(P<0.05)。MSC-HO-1的增殖生长趋势、表面标志表达及多向分化潜能均与未转染的MSC相似。结论 重组慢病毒载体Lenti-HO-1可成功转染MSC并高效表达转入的基因;HO-1基因修饰对MSC增殖活性、免疫表型及多向分化潜能无显著影响。     

Morphology and function detection of chondrocytes differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells induced by supernatant of chondrocytes

目的:应用家兔肋软骨细胞上清液诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞定向分化,并对分化的细胞进行形态学和功能检测,探讨MSCs在体外成软骨分化的条件.方法:分离家兔的MSCs和肋软骨细胞进行体外培养,收集前3代肋软骨细胞上清液作为诱导液,对第3代MSCs进行14d的诱导培养.设置实验组、阳性对照组和阴性对照组,观察各组细胞的形态,甲苯胺蓝染色观察特异性蛋白表达、各组ALP活性,RT-PCR法检测各组细胞中的Ⅱ型胶原(ColⅡ)mRNA的表达.结果:经过14 d的诱导培养,实验组MSCs由长梭形逐渐变成多角形,甲苯胺蓝染色呈阳性;ALP活性显著升高,与其他2组比较差异有统计学意义(P＜0.01); ColⅡmRNA表达呈阳性.阴性对照组甲苯胺蓝染色呈阴性,ColⅡmRNA表达呈阴性.阳性对照组甲苯胺蓝染色呈阳性,ColⅡmRNA表达呈阳性.结论:家兔肋软骨细胞上清液能够促进MSCs向软骨细胞方向分化.     

TGF-β1和 EGFP 体外电转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：通过电转染介导转化生长因子β1(TGF-β1)转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察Ⅱ型胶原表达的情况。方法用全骨髓细胞贴壁培养法分离、培养兔 BMSCs;诱导14 d 后,免疫组化和 Western blot 法检测Ⅱ型胶原表达。结果 BMSCs CD90表达阳性,CD31表达阴性;成功转染 TGF-β1至 BMSCs;通过免疫组化及 Western blot 法检测TGF-β1组细胞内Ⅱ型胶原有较强的表达,与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组和空白对照组相比差异有统计学意义(P<0．05)。结论电转 TGF-β1质粒至兔 BMSCs,可以促进Ⅱ型胶原表达。