人类卵巢组织冷冻与移植研究进展

不断改进的化学疗法、放射疗法和骨髓移植疗法,使恶性肿瘤的治愈率和年轻患者的长期存活率明显提高。但是,这些疗法往往导致女性患者卵巢功能衰竭,损害患者的生殖能力。在肿瘤治疗前,将患者卵巢组织冷冻保存,是一项旨在保存女性生育力的新技术。本文就国外近年有关人类卵巢组织冷冻、移植的研究进展作一综述。     

人类卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果影响的研究

目的 探索不同卵巢组织条厚度对超低温冷冻效果的影响,同时评估卵巢组织的凋亡情况.方法 卵巢组织取自10例手术的妇女.冷冻前行卵巢组织切片,按最小厚度随机分成1.0、0.5、0.25 mm 3组.采用二甲基亚砜（DMSO）为冷冻保护剂的程序慢速冷冻法进行超低温冷冻保存.冻融后进行卵泡计数及各组间正常卵泡形态学分析比较,使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行组织细胞凋亡检测.上述结果与新鲜卵巢组织进行比较.结果新鲜卵巢组中97.6%原始卵泡保持形态学正常,切片厚度为1.0、0.5、0.25 mm三组形态正常率分别为71.1%、73.9%和72.7%,与新鲜组比较,三实验组下降明显,差别有统计学意义（χ2=15.66,P〈0.001）;而三冷冻组间相比差别无统计学意义（χ2=0.153,P=0.926）.TUNEL原位杂交显示窦前卵泡颗粒细胞中未见凋亡阳性信号,窦卵泡中可见散在阳性信号细胞,卵巢间质细胞亦有散在凋亡信号.结论 0.5～1.0 mm厚度卵巢组织为行超低温冷冻保存是较合理厚度,卵泡闭锁的机理值得进一步研究.     

不同卵巢组织冷冻方法对保存女性生育力的研究

目的比较程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法保存人卵巢组织,解冻后组织病理分析原始卵泡存活情况。方法卵巢组织取自15例卵巢畸胎瘤患者,卵巢皮质切割成10mm×1mm×1mm的组织条随机分配到玻璃化冷冻组（A组）、程序化冷冻组（B组）、新鲜对照组（C组）,组织病理分析比较三组原始卵泡形态的影响。结果三组共有572个原始卵泡,C组中96．9％的原始卵泡保持形态学正常,A和B组分别为85．6％与83．9％,差别有统计学意义（P〈0．01）;A与B组比较,差别没有统计学意义（P〉0．05）。结论尽管冻融后组织的原始卵泡存活率小于新鲜组织,玻璃化冷冻与程序化冷冻方法都能较好地保存人类卵巢组织,可用于人类卵巢组织的冷冻保存。     

微囊化异种甲状旁腺组织移植的研究

目的探讨微囊化异种甲状旁腺(PTG)组织移植对Wistar大鼠甲状旁腺功能低下的治疗作用及微囊的通透性。方法 40只去甲状旁腺Wistar大鼠随机分为微囊组、非微囊组、空囊组、空白对照组。用海藻酸-钡交联微囊包裹兔甲状旁腺组织,移植至Wistar大鼠肾包囊。移植后每隔2周取血测血钙,移植后第16周取移植物进行透射电镜检查及T淋巴细胞、大鼠IgG抗体的免疫组织化学染色。结果微囊组移植后第4周血清钙由(1．62±0．04)mmol／L恢复至正常水平 (2．2～2．6)mmol／L,9例维持至观察期结束(P<0．01),非微囊组、空囊组及空白对照组血清钙差异无统计学意义(P>0．05)。第16周取出移植物检测显示移植物活性良好,微囊周围可见较多T 淋巴细胞浸润,囊壁及囊内IgG抗体染色阳性。结论海藻酸-钡交联微囊可对甲状旁腺组织起到有效的保护作用,使甲状旁腺组织较长时间存活并发挥正常功能。但海藻酸-钡交联微囊并未减轻受体免疫排斥反应的激活且未有效的免疫隔离IgG抗体。     

微囊化兔甲状旁腺组织异种移植治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的探讨不同部位微囊化兔甲状旁腺组织异种移植治疗大鼠甲状旁腺功能低下症的效果。方法应用微囊技术制备微囊化（海藻酸钠-钡生物微胶囊）兔甲状旁腺组织。16只去甲状旁腺的Wistar大鼠按完全随机法分为肾脂肪囊微囊组及腹腔微囊组，每组8只。分别于移植微囊化兔甲状旁腺组织后5、15、25、35、45、55及65d检测血清钙含量，并于移植后第65d取移植物行透射电镜检查。结果移植后，肾脂肪囊微囊组大鼠血清钙水平恢复到正常范围直至观察结束时，透射电镜检查显示移植物存活良好；腹腔微囊组大鼠血清钙水平恢复到正常范围，但第65d时血清钙水平下降至〈1．6mmol／L，透射电镜检查显示移植物中心坏死，仅边缘有少数存活细胞。结论微囊化兔甲状旁腺组织异种移植在不用免疫抑制剂情况下，可以在大鼠体内存活，且有功能。不同移植部位移植后随着时间的延长存在差异，肾脂肪囊在微囊化异种组织移植中是首选的移植部位。     

Measurement of estrogen and progesterone receptors in abnormal human parathyroid tissue

Summary Estrogen and/or progestin administration to postmenopausal women with primary hyperparathyroidism lowers serum calcium. We measured cytosolic estrogen receptors (ER) and progesterone receptors (PR) by classical hormone-receptor binding techniques in parathyroid tissue removed from 10 men and 20 women, and ER by immunocytochemistry in tissue from an additional one man and seven women in order to ascertain whether these agents might exert a direct effect upon tissue responsible for hyperparathyroidism. ER were negative (<3.1 fmol bound estradiol/10 mg tissue) in all 8 adenomas and 4 of 5 secondary hyperplasias removed from men, and from women in 19 of 22 adenomas, 2 of 3 secondary hyperplasias, and 3 of 4 primary hyperplasias. PR were negative (<10.1 fmol bound progesterone/10 mg tissue) in 7 of 8 adenomas and all 5 secondary hyperplasias removed from men, and from women in 20 of 22 adenomas, all 3 secondary hyperplasias, and all 4 primary hyperplasias. For immunocytochemical studies, quickfrozen specimens were analyzed with a monoclonal antibody (Abbott Laboratory) directed at nuclear ER. All eight samples—five adenoma and three primary hyperplasia—were negative. We conclude that abnormal human parathyroid tissues have nondetectable levels of ER and PR. It is unlikely that estrogen and progesterone exert a direct, ER, or PR-mediated effect upon parathyroid tissue.     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

人未成熟卵母细胞冷冻技术进展

人成熟卵母细胞的纺锤体对低温敏感,在冷冻保存中极易受到伤害,加上成熟卵母细胞来源有限,人们开始研究人未成熟卵母细胞的冷冻保存。本文综述了人未成熟卵母细胞冷冻技术的意义、优势、影响因素以及目前存在的关键问题,期望能拓展配子冷冻领域。     

金雀异黄素在甲状旁腺激素诱导的人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达中的调控作用

目的 探讨金雀异黄素（Gen）对甲状旁腺激素（PTH）引起的人近曲小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的调控作用。 方法 应用实时定量-聚合酶链反应（real time-PCR）、Western蛋白印迹、报告基因等技术,观察Gen对PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的影响。使用MAPK通路抑制剂U0126阻断信号通路以明确Gen发挥作用的机制。 结果 HK-2细胞有基础量的CTGF mRNA和蛋白表达,PTH刺激后其表达量显著增加（P ＜ 0.05）。10-10 mol/L PTH作用12 h后,荧光素酶活性较对照组明显升高（1.8884±0.0780比0.9891±0.0300,P ＜ 0.01）。Gen剂量依赖性下调PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。正常HK-2细胞有少量磷酸化（p）ERK1/2表达,PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高,以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强。U0126作用后,CTGF mRNA、蛋白表达均明显下降（P ＜ 0.05）。Gen抑制PTH所致的HK-2细胞ERK1/2活化。 结论 Gen可通过阻断MAPK信号通路抑制PTH诱导的HK-2细胞CTGF表达。     

冻融人胎儿卵巢组织异种移植的实验研究

目的探求冻融人胎儿卵巢组织异种移植后的生长发育能力。方法胎儿卵巢组织分为新鲜胎儿卵巢组织(新鲜组),慢冻-快融胎儿卵巢组织(冻融组),解冻的胎儿卵巢组织异种移植到8只裸鼠肾被膜下(移植组)三组。2个月后开始隔天注射孕马血清促性腺激素(PMSG),持续5个月。注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)36 h后裸鼠处死取得移植物。胎儿卵巢组织石蜡包埋后连续切片,进行组织学评价和增殖细胞核抗原(PCNA)的检测。结果冻融组和新鲜组中绝大多数是原始卵泡。与新鲜组相比,冻融组中正常及总的原始卵泡数虽有下降,异常原始卵泡数虽有升高,但均无显著性差异。移植组的原始卵泡数明显少于新鲜组和冻融组(7.2±1.64,20.4±5.68,17.2±4.27,P<0.05),但可见到数个形态正常的初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡。三组的原始卵泡均未见有PCNA阳性表达,PCNA阳性表达见于移植组初级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞、次级卵泡和窦卵泡的颗粒细胞。结论冻融人胎儿卵巢组织异种移植后能存活,卵泡能正常发育到窦卵泡。     

甲状旁腺激素通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路诱导人近曲小管上皮细胞结缔组织生长因子表达

目的 观察甲状旁腺激素（PTH）对人肾小管上皮细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）的影响，并探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径在此过程中的作用。 方法 采用实时定量PCR、Western印迹、报告基因等技术，观察PTH诱导人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞CTGF表达的情况。使用信号通路抑制剂PD98059、U0126阻断信号通路以明确PTH发挥作用的信号途径。 结果 正常HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达水平显著增加。10-10 mol/L PTH作用12 h后，荧光素酶活性较对照组明显升高[（1.8884±0.0780）比（0.9891±0.0300） A，P ＜ 0.01]。正常HK-2细胞有少量p-ERK1/2表达，PTH刺激后p-ERK1/2表达明显升高，以10-10 mol/L PTH作用30 min时效应最强；MAPK通路抑制剂PD98059、U0126作用后，CTGF mRNA、蛋白、基因启动子表达均明显下降。 结论 PTH可诱导HK-2细胞CTGF表达，其作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。     

气管异种移植的现状

气管异种移植目前还处于动物实验阶段,尚不能应用于临床,主要原因是异种气管移植后的免疫排斥问题未能解决,社会伦理学方面还存有争议。移植气管的保存与再血管化也是当前所面临的主要问题。其中,能否解决移植后宿主对气管的免疫排斥是移植成败的关键。该文通过介绍异种气管移植的概况,了解其研究进展及所面临的挑战。     

低温保存对组织工程骨特性影响的实验研究

目的 了解不同低温保存方法对组织工程骨支架生物特性和成骨细胞功能的影响。方法 组织工程骨分别在4℃和-196℃环境下保存3，6个月，以未行保存的组织工程骨和单纯生物衍生骨作为对照。实验分为7组，组织工程骨4℃保存3个月为A3组，保存6个月为A6组，-196℃保存3个月为B3组，保存6个月为B6组，未行保存的组织工程骨为C组，单纯生物衍生骨组为D组，新鲜人体骨为S组（仅作生物力学）。观察细胞的黏附与生长，并行材料的生物力学、碱性磷酸酶活性（ALP）、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率等检查。结果 所有组织工程骨各组均可见成骨细胞在材料表面黏附，细胞在材料孔隙内生长、分化和增殖；材料的力学性能检测显示A3、A6、B3、B6、D组各组间最大载荷比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；A3、A6、B3、B6、D组分别与S组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；各组成骨细胞ALP活性、细胞表面的整合素α2β1表达量、Ⅰ型胶原、钙化能力和成骨细胞成活率依次为C组〉B3组〉B6组〉A3组〉A6组。结论 4℃保存方法和-196℃保存方法对生物衍生骨的生物力学性能无明显的影响。4℃保存方法和-196℃保存方法对细胞的存活率和细胞的生物活力有明显的影响，但均能在一定程度上保存细胞的存活率和的细胞的生物活力。-196℃保存方法优于4℃保存方法，但4℃保存方法操作简单、方便和经济。     

组织工程骨-80 ℃低温保存的初步研究

目的：了解不同冻存方法对组织工程骨生物活性的影响。方法：以骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨，实验分为：A组，组织工程骨用添加冻存保护荆的保存液保存；B组，组织工程骨用不添加冻存保护荆的保存液保存；C组，组织工程骨未行低温保存；D组。单纯MSCs培养。A组和B组的组织工程骨于-80℃深低温保存3个月，3个月后复温冻存的组织工程骨。扫描电镜观察MSCs的黏附和分布情况，MTT法检测细胞活力，对硝基苯磷酸法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AIP）活性，流式细胞仪分析细胞周期。结果：MSCs在材料表面和孔隙内均可黏附和分布，黏附于材料的细胞活力大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01，P〈0．05）。黏附于材料的细胞AIP活性大小依次为C组〉A组〉B组（P〈0．01）。各组细胞周期未见明显变化，未见异倍体细胞。结论：选择适宜的冻存保护荆对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。     

袖套法异种心脏移植模型

采用Heron袖套法进行异种（小鼠→大鼠）心脏移植，异位移植于颈部皮下，供体主动脉接受体颈内动脉，供体肺动脉接受体项外静脉，并对手术方法进行了部分改进。进行正式手术22次，成功率86％，移植后平均存活时间2．10±0．80天；该方法简单、迅速、可靠，移植于颈部易于观察，对于超急性排斥反应的观察以及免疫耐受的诱导，抗免疫排斥药物筛选是一位得推广的动物模型。     

微囊化新生猪甲状旁腺细胞异种移植的实验研究

目的 探讨微囊化新生猪甲状旁腺细胞异种移植治疗大鼠甲状旁腺功能低下症的效果。方法 应用微囊化技术，制备微囊化（海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠生物微胶囊）新生猪甲状旁腺细胞，32只去甲状旁腺的Wistar大鼠随机分成微囊组、非微囊组、空囊组和对照组，分别移植微囊化新生猪甲状旁腺细胞、甲状旁腺细胞、空微囊及生理盐水。移植后监测血钙及甲状旁腺素水平40周，40周后回收移植物，透射电镜检查。结果 移植后，微囊组大鼠血钙及甲状旁腺素水平恢复到正常范围内，直至观察结束时（40周），透射电镜检查显示移植物存活良好；非微囊组、空囊组和对照组大鼠的血钙及甲状旁腺素水平无改善。结论 微囊化新生猪甲状旁腺细胞异种移植在不用免疫抑制剂情况下，可以在大鼠体内存活，且有功能；海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠生物微胶囊对免疫活性细胞及抗体具有屏蔽作用。     

The effect of cryopreservation on hormone secretion in vitro and morphology of human parathyroid tissue

The hormone secretion from human parathyroid tissue autografted after cryopreservation can fail frequently. In this study we examined the effects of the cryopreservation procedure on parathyroid hormone secretion in vitro and the viability of parathyroid cells to identify possible reasons for graft failure. Cryopreservation did not affect quantitative parathyroid hormone release from single-cell suspensions or its calcium-and magnesium-dependent regulatory mechanisms. However, morphometric analysis of thawed 1 mm3 graft particles showed various degrees of necrosis when compared with fresh grafts. Thus partial necrosis of cryopreserved tissue appears to contribute to poor transplantation results compared with immediate replantation of fresh parathyroid tissue. This limitation can be overcome by increasing the number of frozen graft particles used for autotransplantation. The percentage of viable cells should be accounted for by morphometric analysis and this factor used when calculating the number of graft particles employed.     

转人CRP基因在异种移植中的研究

目的：研究转入补体调节蛋白（CRP）DAF、MCP和CD59基因对抑制人补体激活从而克服超急性排斥反应的作用。方法：利用显微注射建立转人衰变加速因子（hDAF)小鼠和猪的模型和转梁hMCP及hCD59真核表达质粒的猪内皮细胞（EC）,研究小鼠和猪EC表达抑制人补体激活的人补体调节蛋白（CRP）对异种移植超急性排斥反应的抑制作用。结果（1）转人DAF基因小鼠心脏用新鲜人血连续丛外灌注,转基因组心脏搏动时间（174．6min)比对照组（106．5min)明显延延长。（2）转hDAF基因猪心脏异位移植给猕猴、移植心最长存活90h,受者死亡前移植心仍有功能,移植心病理检查未见超急性排斥反应病理改变。（3）转DAF基因基因猪EC死亡率在不同浓度血清时均明显低于对照组,在转hDAF基因猪EC上再分别转染hMCP及hCD59真核表达质粒,转hDAF hMCP或hDAF hCD59在不同血清浓度时EC死亡率较单纯hDAF组明显下降（P＜0．05）。结论,转人DAF及MCP、CD59补体调节蛋白基因能克服人对异种器官或组织的超急性排斥反应。     

Pig endogenous retroviruses and xenotransplantation

Xenotransplantation of porcine organs might provide an unlimited source of donor organs to treat endstage organ failure diseases in humans. However, pigs harbour retroviruses with unknown pathogenic potential as an integral part of their genome. While until recently the risk of interspecies transmission of these porcine endogenous retroviruses (PERV) during xenotransplantation has been thought to be negligible, several reports on infection of human cells in vitro and spread of PERV from transplanted porcine islets in murine model systems have somewhat challenged this view. Here, we compile available data on PERV biology and diagnostics, and discuss the significance of the results with regard to the safety of clinical xenotransplantation.     

The effect of cryopreservation on cell viability and hormone secretion in human parathyroid tissue.

BACKGROUND. To explain the decreased success of cryopreserved versus fresh parathyroid autotransplants, we investigated the effect of cryopreservation on parathyroid function. METHODS. Parathyroid cryopreserved tissue from surgical specimens of 18 patients was analyzed in a comparative fashion with 10 fresh abnormal glands. Cell viability was evaluated by a double-fluorescence technique, and parathyroid hormone secretion was detected from individually dispersed parathyroid cells with the reverse hemolytic plaque assay. The plaque area reflected the amount of parathyroid hormone secreted by each cell, and the percentage of plaque-forming cells represented the number of secreting cells. Feedback regulatory mechanisms remained intact for both fresh and cryopreserved tissue as shown over a wide range of calcium concentrations. RESULTS. The percentage of viable cells from fresh and cryopreserved tissue was always in excess of 88%. No significant difference was noted in the percentage of plaque-forming cells nor the amount of hormone released per individual cell comparing fresh and cryopreserved glands (6 months to 2 years). Specifically, at physiologic calcium concentrations no significant differences existed in the secretory behavior between fresh and cryopreserved tissue. CONCLUSIONS. Without showing decreased viability or parathyroid hormone secretion after cryopreservation, the cause of graft failure in cryopreserved tissue still remains unknown.