霍乱弧菌TCP菌毛粘附作用的研究

目的 探讨霍乱弧菌毒素共协调菌毛（TCP）在霍乱弧菌感染动物模型中的粘附作用。方法 使用聚合酶链反应、打点杂交、人小肠粘膜模型及乳鼠半数致死量（LD50）对霍乱弧菌的TCP的粘附作用进行了研究。结果 研究发现,MO45、79005和569B3种菌株具有tcp A基因,而169－68菌株没有。在AKI培养基中30℃,静止培养,前3种菌株的TCP菌毛表达良好,而169－68菌株不能表达此种菌毛;在LB培养基中37℃,震动培养未见以上菌株表达TCP菌毛。通过人小肠粘膜模型粘附实验表明,在表达菌毛时,MO45、79005、569B的粘附能力是169－68的10倍多,在不表达菌毛的情况下这4种菌株的粘附能力相差不大。MO45菌株对乳鼠的LD50测定结果显示,在表达菌毛时的LD50的菌量只是不表达菌毛时的1／10。结论 本实验通过分子生物学技术和动物模型证明有的霍乱弧菌能表达TCP菌毛,而有的不能表达,TCP菌毛在霍乱弧菌感染动物模型中具有重要的作用。     

一株缺失pMT1质粒鼠疫菌的全基因组序列分析

目的通过基因测序及生物信息学分析,确定O-1菌株基因组的一般特征及与参考菌株的差异,确定O-1菌株的pMT1质粒是否整合至染色体以及可能的整合机制。方法提取O-1鼠疫菌株的全基因组DNA,进行测序组装,获得全基因组序列及圈图;通过与参考菌株比较来描述基因组一般特征;通过序列比对(Blast/Mauve)确定整合位点,再通过引物设计和PCR扩增来验证整合位点。结果 O-1菌株基因组包括一个染色体,两个质粒(70.3Kb,9.6Kb);O-1菌株染色体基因数目与CO92菌株有差异,染色体的插入序列(尤其是IS100和IS1541)较CO92菌株多;O-1菌株质粒与CO92菌株很相似,但O-1菌株无独立存在的pMT1质粒。pMT1质粒序列位于O-1菌株染色体中,从1429315至1526240,序列长度为96926bp;且整合位点被PCR扩增证实;O-1菌株pMT1质粒序列含有5个IS序列;pMT1序列的插入位点处于O-1染色体的非编码区。结论 O-1菌株的pMT1质粒整合至染色体,而且是完整序列整合。O-1菌株染色体特征与CO92有差异,且插入序列较多。IS1541A介导的同源重组可能是pMT1质粒整合至染色体的原因。     

外环境水样中杂菌对不同型别霍乱弧菌分离培养干扰情况的研究

目的:了解外环境水样中存在的杂菌对不同型别的霍乱弧菌分离培养的干扰情况。方法:采用稀释法分别将已用巢式PCR证实不含O1和O139群VC及含有ctxA阴性的O139群VC野生株的外环境水样一代、二代增菌液对不同型别的霍乱弧菌进行倍比稀释,观察霍乱弧菌在庆大霉素琼脂平皿上的生长情况。结果:不同厂家购买的庆大平板对霍乱弧菌生长的抑制能力有所不同,A厂家购买的庆大琼脂对霍乱弧菌本身生长的抑制力要差些。用一代增菌液为稀释介质时,CT-的霍乱菌株比CT+的菌株容易检出,同时CT-的小川型VC生长繁殖能力在实验用的不同型别的霍乱弧菌中是最强的。结论:无论是否存在有O139群VC野生株干扰时,以一代增菌液为稀释介质时目的霍乱弧菌均更易于检出。二代增菌液中存在的杂菌对霍乱弧菌分离培养干扰要比一代增菌液严重,更不利于霍乱弧菌的检出。     

云南省四株霍乱弧菌全基因组测序分析

目的选取云南省具有代表性的霍乱弧菌四株,进行了全基因组测序分析,为云南省霍乱弧菌的基因组学研究提供资料。方法根据对云南省历年霍乱菌株资料的分析,结合菌株特征和脉冲场凝胶电泳带型特点等,选取了四株代表性霍乱弧菌,采用WGS Illumina Hi Seq2500进行paired-end测序。对测序结果进行拼接、组装以及注释等。结果基因预测和功能注释结果显示,所有四株霍乱弧菌(YN2011004、YN98296、YN97083和YN89004)均显示携带有2个染色体,同时YN2011004,YN98296和YN89004各自携带有一个质粒。YN2011004的1号染色体具有2 727个基因,2号染色体具有958个基因;YN98296 1号染色体具有2 825个基因,2号染色体具有969个基因;YN97083 1号染色体具有1 948个基因,2号染色体具有955个基因;YN89004 1号染色体具有2 653个基因,2号染色体具有907个基因。所有预测的基因功能主要涉及细菌生理代谢、信号储存和处理以及信号转导等各个方面。结论云南省的四株代表性霍乱菌株均具有两个染色体,其中三个菌株还各自含有1个质粒。     

霍乱弧菌几肿肠毒素基因的检测研究

目的：了解我省分离的霍乱弧菌中几种主要肠毒素基因的携带情况。方法；以地高辛标记基因探针，对我省历年分离的91株霍乱弧菌（包括EVC和VC O139）作霍乱肠毒素基因探针杂交检测。结果：EVC流行株和VC O139菌株中，普遍ctxAB,Zot,Ace等毒素基因，该3种基因的携带率分别达到100％，98．86％，96．59％，而EVC非流行菌株则均不携带上述3种毒素基因。结论：提示EVC流行株和VC O139菌株具备较强的产毒能力，流行性强，应重点加强监测与研究。从ctxAB原RFLP杂交图谱分析，EVC以流行株和VC O1390在遗传特征上具相近的特点，结果均显示2条阳性杂交带。     

霍乱弧菌毒力基因检测与16S rRNA基因分型研究

目的：了解浙江省霍乱弧菌毒力基因携带情况和16SrRNA基因型状况，为霍乱防治提供科学依据。方法：利用16SrRNA基因探针分析了浙江省不同时期分离的88株霍乱弧菌经BglI消化的16SrRNA基因限制性酶谱，以多重PCR法对140株霍乱弧菌进行6种毒力相关基因（ctxA、rtxA、Ace、TcpA、Cri、Zot）检测分析。结果：发现各菌株的杂交片断范围为2～12Kb，每个菌株有6～9条杂交带不等。88株霍乱菌株可分为9个16SrRNA基因型（ribotype，RT），其中埃尔托型霍乱弧菌（el tor vibrio cholerae，EVC）可分为6个RT，0139群霍乱弧菌（vibrio cholerae 0139，VC 0139）分为3个RT；所有VC0139菌株均携带3种以上毒力基因，86．3％的菌株携带全部6种毒力基因，所有EVC流行株均携带2种以上毒力基因，79．1％的菌株携带全部6种毒力基因。结论：认为霍乱流行菌株基因型的变迁可能是引起新一次流行的原因。结合毒素基因检测结果，我们认为VC0139与EVC在遗传特征上有相近的特点，但又有所区别。     

O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株重组特征分析

目的分析霍乱弧菌O1血清群El Tor产毒株基因组的重组特征。方法在美国国立生物技术信息中心数据库中,选取分离时间从1937—2015年的292株霍乱弧菌O1血清群El Tor菌株完成图序列或草图序列,以菌株N16961的基因组序列为参照,使用snippy软件获得菌株的全基因组比对信息,利用ClonalFrameML软件对数据进行重组分析,比较大小染色体间重组数目及重组区域总长度的差异,以及不同分离地区菌株的基因组重组片段数目和总长度的差异。使用KOBAS分析工具对重组热点基因进行基因本体富集分析。结果292株霍乱弧菌菌株中,发生基因重组163株(55.8%);其中,归一化处理的小染色体重组片段数目M(P25,P75)为4.7×10^-(69.3×10^-7,2.0×10^-5),大于大染色体[2.4×10^-(63.4×10^-7,5.7×10^-6)](P<0.001);小染色体重组区域占小染色体长度的比例M(P25,P75)7.1%×10^-(53.7%×10^-6,4.8%×10^-4),大于大染色体[2.2%×10^-(52.4%×10^-6,8.4%×10^-5)](P<0.001)。分离自非洲、亚洲、欧洲、北美洲和南美洲的菌株重组片段数目M(P25,P75)分别为23(1.0,33.0)、1.0(0.0,34.0)、6.0(2.0,13.0)、0.0(0.0,1.0)和29.5(6.8,56.8)(P<0.001);分离自各大洲的菌株重组区域总长度M(P25,P75)分别为233.0(4.0,461.0)、11.0(0.0,695.5)、56.0(4.0,111.0)、0.0(0.0,9.0)和347.5(132.8,1323.5)bp(P<0.001)。富集分析结果显示,62个重组热点编码基因的功能主要集中在趋化、趋性、对外界刺激的反应、受体活性和分子转导活性。结论霍乱弧菌El Tor大小染色体的重组片段数目及区域长度存在差别,不同大洲菌株重组片段数目及重组区域总长度不同。     

5株O139群霍乱弧菌生物学性状研究

目的研究从病人和水产品中分离到的5株O139群霍乱弧菌的生物学性状。方法参照《霍乱防治手册》对5株菌的生长特征、生化特征、血清学反应及药物敏感性进行鉴定；应用多重PCR方法对所试菌株进行毒力相关基因检测，用Vero细胞测定方法检测ctxA阳性菌株霍乱肠毒素的表达。结果5株O139群霍乱弧菌生物学性状和血清学反应与阳性对照菌体O139群霍乱弧菌MO45基本相同；2株来自重型病人和1株来自水产品的菌株ctxA、zot、ace、tcpA、tcpI、hlyA、rtxA、rtxC、ompU、tarR 11种毒力相关基因全部阳性。经Vero细胞测定，其霍乱肠毒素效价达到1：160；在2株来自轻型病人的菌株中仅hlyA、rtxA、rtxC、toxR 4种毒力相关基因为阳性。结论O139群霍乱弧菌致病(泻)的决定基因簇并非仅为ctxA、zot、ace、cep等毒力相关基因。     

荧光PCR和脉冲场电泳技术在一起霍乱弧菌疫情诊断中的应用

目的探讨荧光PCR和脉冲场电泳(PFGE)在霍乱弧菌疫情调查中的应用,为霍乱防治提供依据。方法采集疫情相关标本,进行分离培养鉴定和荧光PCR检测,霍乱弧菌分离菌株基因组进Not I酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果血清分型分离菌株为霍乱弧菌0139群,标本荧光PCR检测结果毒力基因呈阳性,该起疫情分离的8株霍乱弧菌毒株PFGE图谱一致。结论荧光PCR可快速准确鉴定病原体,PFGE具有较强的菌株同源性分析能力,两种方式的联合应用能在突发公共卫生事件的快速诊断及疫情处置中发挥重要作用。     

6株O139霍乱弧菌的实验研究

O139霍乱弧菌是近年来新发现的霍乱血清型 ,也是唯一能引起霍乱暴发流行的非 O1群霍乱弧菌。为了解该菌的生物学特性 ,我室对 6株 O139霍乱弧菌在培养特性、形态、生化反应、血清学方面进行了试验 ,并利用 EL- TOR霍乱弧菌的噬菌体 -生物分型技术对这 6株细菌进行了分型及药敏试验等方面的实验研究 ,现报告如下 :1　材料与方法1.1　菌株来源　菌株采自医院肠道门诊的腹泻病人。1.2　实验材料　培养基 :碱性胨水、肉汤、半固体均由本室自配 ,4号琼脂 ,TCBS琼脂 ,药敏琼脂 ,购自江苏省卫生防疫站微生物试剂厂。生化反应材料 :弧菌属微量…     

外源指导序列转换临床耐药大肠埃希菌表型研究

目的　研究外源指导序列 (externalguidesequence ,EGS)在体外逆转大肠埃希菌临床分离株耐药菌为敏感菌中的作用与能力。方法　构建针对 β 内酰胺酶并含卡那霉素抗性基因的EGS重组质粒 ,常规CaCl2 法将重组质粒导入临床分离耐氨苄西林大肠埃希菌E16菌株中 ,通过菌落PCR鉴定 ,并利用分光光度计A60 0 检测阳性转化菌t E16在含不同浓度氨苄西林LB液体和固体培养基中的生长情况。结果　耐氨苄西林的临床分离大肠埃希菌E16菌株在浓度为 5 0 μg/ml、10 0 μg/ml的氨苄西林LB培养皿中均生长良好 ,而导入EGSAMP的转化菌t E16在浓度为 10 0 μg/ml的氨苄西林LB培养液和培养皿中不能生长 ,在浓度为 5 0 μg/ml的氨苄西林LB培养基中生长受抑 ,表明转化菌t E16部分恢复了对氨苄西林的敏感性。结论　外源指导序列在逆转临床耐药大肠埃希菌耐药性中的作用肯定。     

16S rDNA序列分析法在国际船舶压载舱沉积物病原微生物检测中的应用

〔目的〕探讨16S rDNA序列分析法在国境口岸监测外来病原微生物的可行性。〔方法〕按照0.5 mg/0.5 ml样品接种10 ml增菌液的比例将压载舱淤泥样品分别接种到营养肉汤和碱性蛋白胨水中,37℃过夜,震荡摇匀。增菌后划线接种在选择培养基上,过夜培养后挑取阳性菌落纯培养,按照试剂盒说明提取细菌基因组,扩增细菌基因组16S rDNA片段,将扩增产物纯化后进行序列分析。〔结果〕从48份样品中共检测12种细菌,其中检测到的霍乱弧菌有1株为B33株。这株霍乱弧菌最早在2004年分离自非洲东南部国家莫桑比克的贝拉港,是O1群霍乱弧菌的经典型与Eltor型杂交后产生的菌株,O139群霍乱弧菌尚未检测到。〔结论〕16S rDNA序列分析法可用作国境口岸外来微生物的监测和分析。     

实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB培养基和血中对抗生素的药物敏感性

目的 建立以实时定量PCR快速检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素药物敏感性的方法。方法 临床血培养获得大肠埃希菌株，以常规纸片法检测其对抗生素的药物敏感性。分别在LB液体培养基和健康人新鲜全血中加入该大肠埃希菌至终浓度为0．5麦氏单位，采用不加抗生素的标本作为生长对照组，加入耐受或敏感的抗生素的标本作为耐受药物组或敏感药物组，37℃震荡培养，分别提取0、1、2、3、4小时的基因组DNA，以大肠埃希菌特异β-右旋半乳糖苷酶基因的引物和TaqMan探针，对标本进行实时定量PCR检测。结果 实时定量PCR方法有较好的重复性（CT值变异系数0．26％～1．56％）和精确度（大肠埃希菌DNA提取效率在LB培养基中为43．6％，在血中为26．7％），标准曲线线性关系好（R^2≥0．998）。培养1～3小时后，耐受药物组与生长对照组的大肠埃希菌DNA拷贝数均呈对数增长，在LB液体培养基中增至约19～120倍，在新鲜全血中增至约6～11倍；敏感药物组大肠埃希菌DNA拷贝数呈减少趋势，在LB液体培养基中减至0．22～0．12倍，在新鲜全血中为1．29～0．14倍。上述药敏结果与常规纸片法一致。结论 采用实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素的药物敏感性，结果与常规纸片法一致，但更快速。     

1株不典型非O1群霍乱弧菌的发现及鉴定

目的 对1株从肝硬化患者血液中分离的病原菌进行鉴定.方法 按霍乱弧菌的鉴定标准和方法进行细菌学表型特征(包括形态学、培养特性、生化特征)、血清学鉴定及16S rDNA序列分析.结果 从患者血液中分离获得1株病原菌HN 9837,该菌株的形态学、培养特性、生化特征、血清学诊断和分子生物学诊断结果基本符合非O1群霍乱弧菌定义;但与普通霍乱弧菌在甘露醇发酵及赖氨酸利用、柠檬酸盐利用试验结果存在差异.结论 海南省首次在肝硬化患者血液中分离出非O1群霍乱弧菌,该菌为1株不发酵甘露醇、赖氨酸且柠檬酸盐利用试验阴性的不典型霍乱弧菌.     

抗铅菌株的筛选及对水中铅的去除效果研究

目的 从环境中驯化培养抗铅性微生物,并研究其抗铅与去除铅的效果.方法 从被重金属长期污染的土壤中分离菌株,于含乙酸铅的LB液体培养基中进行抗铅菌株的驯化培养和分离筛选及鉴定.研究不同温度(15～46℃)和pH值(pH=3～10)对菌株生长的影响以及在不同Pb浓度(0～500 μg/ml)培养0～48 h后菌株的生长情况...     

O139群霍乱弧菌在不同水和温度下的存活时间及变异的观察

[目的]探讨O139群霍乱弧菌（VC）在不同水体，不同温度的存活时间及其变异情况。[方法]采集不同水样，选用2个O139VC菌株分别制成模拟标本，放置于不同温度定期观察。[结果]O139VC在4种不同自然水体的存活时间不长，除低温冰冻外，均少于15d，多在1周内转阴；但同样4种水体经高压灭菌后存活期活期长短不一，存活3-287d并与不同水体，置不同温度有关；此外，O139VC在模拟水中生存较长时间后，其菌落特征。菌体形态及其部分生物学特性均会发生变化，直至自发变异成L型菌而延长存活时间。[结论]O139VC在不同水体，置不同温度时的存活时间不同，且可发生各种各样变异，包括自发变异为L型菌。     

活性非可培养状态痢疾志贺菌蛋白分析研究

目的研究处于活性非可培养状态（VBNC状态）的痢疾志贺菌血清1型蛋白表达情况。方法将低温寡营养诱导处于VBNC状态与处于对数生长期的痢疾志贺菌血清型1型全蛋白提取，用2D电泳将蛋白质分开，TOF／TOF二级质谱鉴定差异蛋白。结果共获得14个差异点，11个为酶，3个为具有酶活性的蛋白，这些蛋白质可调节细菌的能量代谢和物质合成。处于VBNC状态的痢疾志贺菌保持较高水平的代谢活性，有氧氧化和底物水平磷酸化水平较高，但是细菌蛋白表达能力下降，分裂能力下降。结论从蛋白水平证实了处于VBNC状态的痢疾志贺茵有活性，并解释了难于在常规培养基上形成茵落的原因。     

O139霍乱弧菌分子遗传学研究动态

O139霍乱弧菌作为一种新出现的霍乱病原体,有许多重要的分子特征:溶源性噬菌体CTXΦ具有生物特异性免疫机制,而且有不依赖TCP菌毛的普遍性转导的感染方式;VPI毒力岛由噬菌体VPIΦ携带,可以在菌株间水平转移,这些都为设计生物安全性菌苗提出了难题。染色体上的RTX毒素家族具有细胞毒性;SXT携带多种抗生素抗性基因,可以发生位点特异性重组;pTLC,一种静息质粒也与噬菌体的复制等功能有关;该菌携带多种菌毛噬菌体,可能参与遗传交换,这些对O139霍乱弧菌的致病性和流行都将产生影响。     

副溶血弧菌RIMD2210633与霍乱弧菌N16961中超级整合子结构差异分析

目的确定副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)RIMD2210633与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)N16961菌株中超级整合子结构特点差异。方法 (1)使用Perl脚本搜寻RIMD2210633和N16961中superintegron(SI)中核心序列(core segment,CS)和反向核心序列(inverted core segment,ICS);(2)配对核心序列和反向核心序列,获得副溶血弧菌重复序列(V.parahaemolyticus repeat,VPR)及霍乱弧菌重复序列(V.cholerae repeat,VCR)基因组位置信息;(3)使用Perl语言脚本获得副溶血弧菌RIMD2210633以及霍乱弧菌N16961的SI中重复序列,并获得基因盒的构成和分布信息;(4)使用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VPR和VCR序列进行多序列比对,使用Perl语言脚本处理比对结果以获得一致性序列;(5)使用MEGA 4.0查看多序列比对结果,并使用Perl脚本计算各位置的变异频率,据此结果来分析副溶血RIMD2210633和霍乱弧菌N16961中的弧菌重复序列以及基因盒分布的特点。结果在RIMD2210633的超级整合子鉴定了69个VPR,其核苷酸长度在91～125bp之间。在包含128个核苷酸的一致性序列中,15个为保守核苷酸位点,113个为可变核苷酸位点。在副溶血弧菌的SI中,共确定了64个基因盒,基因盒的长度范围是420～1 709bp,中位数是648bp。在霍乱弧菌N16961的超级整合子中鉴定了158个VCR,长度在117～124bp之间。在包含126个核苷酸的一致性序列中,37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点。N16961的SI中共存在146个基因盒,基因盒的长度范围是390～5924bp,中位数是1 518bp。结论与霍乱弧菌的VCR相比,副溶血弧菌的VPR可变区序列变异更大,与弧菌重复序列之间序列一致性高的特点不相吻合。