基于位点特异性PCR的黄芪与红芪鉴别方法研究

研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份,所有样品进行总DNA的提取,通过对黄芪及红芪药材trnL-trnF片段进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现黄芪可扩增出136 bp 片段,红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。     

多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别

目的 建立一种同时鉴别九里香药材两基原九里香Murraya exotica和千里香M. paniculata的DNA分子鉴别方法。方法 通过比较九里香、千里香的叶绿体基因组序列差异，根据叶绿体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）变异位点分别设计九里香和千里香的特异性鉴别引物P03和P04，对影响聚合酶链式反应（PCR）结果的退火温度、循环次数、引物浓度比进行优化，建立了九里香和千里香的多重位点特异性PCR鉴别方法，并对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性考察和适用性考察。结果 在该多重位点特异性PCR鉴别方法中，当PCR反应循环数为31次，退火温度为60 ℃，九里香P03和千里香P04引物比为1∶2时，九里香可获得约330 bp的特异性条带，千里香可得到约230 bp的特异性条带，不同来源的九里香和千里香样品使用建立的多重位点特异性PCR鉴别方法均可获得一致结果。结论 该文建立一种快速、准确鉴别九里香药材基原的多重位点特异性PCR鉴别方法，可在单次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别九里香和千里香。     

蒿属外来药用资源中亚苦蒿的特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立了一种中亚苦蒿药材的鉴别方法，可以准确、便捷地鉴别中亚苦蒿及其近缘种。方法 利用Chloroplast Genome Information Resource（CGIR）数据库查找中亚苦蒿及其近源种叶绿体基因组序列，并筛选获得中亚苦蒿特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计一对中亚苦蒿特异性鉴别引物zykh1-F和zykh1-R。采集中亚苦蒿及其常见近缘种的原植物样本，建立中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法并优化反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。利用该方法对从新疆药材市场购买中亚苦蒿药材样本进行鉴别。结果 中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法采用鉴别引物zykh1-F和zykh1-R，退火温度为54 ℃、循环次数为33次。经PCR扩增和凝胶电泳后中亚苦蒿在210 bp处可观察到单一明亮条带，其余近缘种如艾、黄花蒿、白叶蒿、野艾蒿均无条带。结论 该研究所建立的中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中亚苦蒿及其常见近缘种，具有高度特异性，且该方法节约时间和成本，为中亚苦蒿资源引种和利用提供一种方便快捷的物种鉴别方法。     

蒙古黄芪与膜荚黄芪特异性分子标记鉴别研究

目的:通过分析不同基原中药黄芪样本DNA序列,研究特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的方法。方法:通过筛选5条常用DNA条形码序列(ITS,ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK),运用MEGA软件进行序列比对,分析可特异性鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的序列及SNP位点,并设计特异性引物。结果:ITS及ITS2序列可准确区分蒙古黄芪与膜荚黄芪,发现稳定的SNP位点,蒙古黄芪在ITS序列第476位点(位于ITS2序列上游)为碱基C,而膜荚黄芪为碱基T,并设计三对特异性鉴别蒙古黄芪的引物对。结论:ITS/ITS2序列以及特异性引物可准确鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪,为黄芪药材的基原鉴定提供科学依据。     

白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间，并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R，分别采集地龙及其混伪品，建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃，循环次数为36次，地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后，可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分，准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原，也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立烫水蛭（蚂蟥）及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据烫水蛭（蚂蟥）细胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因序列设计引物，筛选出烫水蛭（蚂蟥）的稳定引物区间；在区间内筛选获得烫水蛭（蚂蟥）的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，并设计烫水蛭（蚂蟥）特异性鉴别引物TSZ-F、TSZ-R；分别收集烫水蛭（蚂蟥）及其阴性样品，建立烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒特异性PCR鉴别方法，并对PCR体系进行优化，对该方法的耐受性和适用性进行考察。结果 当退火温度为54 ℃、循环数为34次，烫水蛭（蚂蟥）及其配方颗粒经PCR和凝胶电泳后，可在约133 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别烫水蛭（蚂蟥）饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒，也为可其中药配方颗粒的质量标准研究提供参考。     

蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果 PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。     

位点特异性PCR鉴别桃仁中掺入苦杏仁的方法分析

目的 由于中药材传统真伪鉴别方法的局限性,本研究拟通过位点特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种能够快速鉴别桃仁中掺有苦杏仁的方法。方法 通过比对苦杏仁与桃仁的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）基因序列,寻找单核苷酸多态性（SNP）位点并设计特异性鉴别引物。利用不同的苦杏仁和桃仁样品进行PCR扩增,对影响PCR反应体系的退火温度、引物浓度、循环数等条件进行优化,并对该方法的专属性和检出限进行了考察。另外,利用建立的PCR鉴别方法对不同来源和不同产地桃仁中掺有不同比例苦杏仁的样品进行检测,以验证该方法的稳定性和准确性。结果 建立了桃仁中掺混苦杏仁的特异性PCR鉴别方法,在退火温度63 ℃和引物循环数30个时仅有苦杏仁能扩增得到432 bp的特异性条带,桃仁样品则无此条带。该方法对苦杏仁的最低检出限为0.2 ng,其对桃仁中掺入苦杏仁的检出限为1%,可用于日常桃仁中掺混苦杏仁的检测。结论 建立的位点特异性PCR方法能够准确地检测桃仁中是否掺有苦杏仁,可为桃仁的质量控制提供实验依据,以保障其临床用药安全。     

基于DSS标记特异性PCR鉴别冷背药材木槿皮基原植物及其混伪品

目的 冷背药材作为宝贵的药材资源，但因其本身的特殊性和复杂性，导致其鉴别成为中药鉴定中的难题，因此亟需建立冷背药材的鉴别方法。该研究利用DNA特征序列（DSS）标记，建立一种冷背药材木槿皮基原植物木槿及其混伪品的特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 基于叶绿体基因组序列分析获得木槿皮的候选DSS标记，使用DNA测序手段对DSS标记进行验证，基于得到的可靠DSS标记设计木槿皮基原植物特异性鉴别引物，对PCR反应条件进行优化，并进行耐受性和适用性的考察。结果 将扩增产物的测序结果与DSS比对后得到了1个可用于鉴定木槿的DSS标记，揭示了木槿正混伪品的区别特征，根据DSS标记设计出一对木槿正品特异性鉴别引物，使用该引物进行PCR扩增和凝胶电泳后木槿均出现约270 bp的单一明亮条带，而其4种混伪品均无此条带。结论 该研究得到的1个DSS标记可用于木槿的真伪鉴定，基于此DSS标记设计的特异性鉴别引物可准确、简便的鉴别木槿皮的基原植物及其混伪品，为木槿正伪品的分子鉴定提供了新的方法与思路。     

地骨皮的多重位点特异性PCR鉴别

目的 使用多重位点特异性聚合酶链式反应（PCR）的方法，简单高效地鉴定地骨皮（Lycii Cortex）的2种基原植物枸杞（Lycium chinense）和宁夏枸杞（L. barbarum）。方法 在使用植物叶绿体基因组数据库（CGIR）获取枸杞和宁夏枸杞叶绿体基因组序列的基础上，利用IdenDSS软件筛选出两基原间特定的单核苷酸多态性（SNP）位点，并利用Primer 5.0软件设计获得特异性鉴别引物，包括鉴别枸杞的引物GQ-F/R、鉴别宁夏枸杞的引物NX-F/R。对引物浓度比、退火温度、循环次数、Taq酶进行优化，形成最适的PCR鉴别体系和条件，并对采集自不同地区的地骨皮进行适用性考察。结果 对影响PCR结果的各个条件进行考察优化后，最终确定枸杞和宁夏枸杞的引物浓度比为2∶1、退火温度为59 ℃、循环次数为30次时，来自不同产区地骨皮的2个基原枸杞和宁夏枸杞分别在183、295 bp的位置出现特异性鉴别条带。结论 通过一次PCR即可方便、快捷、高效地鉴定地骨皮的基原，为枸杞和宁夏枸杞的专属性鉴别提供新方法，同时对含有地骨皮成分的经典名方的研发提供一定的技术支撑。     

膜荚黄芪和蒙古黄芪的SSR鉴定

目的:分析蒙古黄芪转录组序列中的SSR位点,设计引物并对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行鉴定。方法:对蒙古黄芪根和叶进行转录组测序、从头组装,利用MISA软件搜索SSR位点并设计引物,随机选取110对引物对蒙古黄芪和膜荚黄芪进行鉴定。结果:蒙古黄芪根、叶转录组共获得74 383条unigene,平均长度781 bp。在长度大于1 kb的18 040条序列中检索到5 640个SSR位点,选取其中110对SSR引物对膜荚黄芪和蒙古黄芪进行鉴定,发现引物CL609在10个膜荚黄芪样品中均能扩增出约700 bp的特异条带,而蒙古黄芪无此条带。结论:蒙古黄芪转录组序列的SSR标记可用于膜荚黄芪和蒙古黄芪的鉴定,这些SSR将为黄芪的遗传分析、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供有利的工具。     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。     

黄芪属植物DNA条形码与聚类分析的研究

目的 通过分析吉林产10种黄芪属植物的ITS2、matk、rbcL、psbA条形码序列,为黄芪属植物的物种分类鉴定及其亲缘关系提供理论依据。方法 共收集30份样品,以ITS2、matk、rbcL和psbA作为条形码序列,对黄芪属10种植物提取基因组DNA、PCR扩增并进行双向测序。所得序列结果经校正处理后,并对其进行聚类分析。结果 ITS2、matk、rbcL和psbA4种片段,单独的每一种片段并不能将10种植物全部鉴别出来,只能鉴别出部分植物,即蒙古黄芪A.membranceus var.mongholicus、扁茎黄芪A.complanatus、糙叶黄芪A.scaberrimus、华黄芪A.chinensis、草木樨黄芪A.melilotoides、细叶黄芪A.angustissimus、兴安黄芪A.dahuricus、新巴黄芪A.hsinbaticus;由聚类分析结果可知,以锦鸡儿Caragana sinica为外类群,10种植物中,华黄芪为单独1支,细叶黄芪与扁茎黄芪聚为1支,糙叶黄芪、斜茎黄芪与新巴黄芪聚为1支,膜荚黄芪A.membranceu、蒙古黄芪与草木樨黄芪聚为1支,并且这3者与兴安黄芪关系较近。结论 ITS2+rbcL+psbA组合可以将8种黄芪属植物鉴别出来。聚类分析结果显示10种黄芪属植物被划分为5支,该聚类分析结果与《中国植物志》中10种黄芪属植物的传统分类相一致。     

NaCl胁迫对膜荚黄芪种子萌发和幼苗生理特性的影响

目的 通过对不同浓度NaCl胁迫下膜荚黄芪种子萌发及幼苗生理特性的研究,寻找提高膜荚黄芪种子及幼苗在NaCl胁迫下抗性能力的途径。方法 测定不同浓度NaCl胁迫下膜荚黄芪种子的发芽势（G_v）、发芽率（G_r）、相对发芽率、相对NaCl害率,并对幼苗的叶绿素量、可溶性蛋白质量、丙二醛（MDA）量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性进行测定。结果 低浓度的NaCl胁迫对膜荚黄芪种子的萌发具有促进作用,当NaCl胁迫浓度＞50 mmol/L时,随着NaCl浓度的增大,种子的G_v、G_r、相对发芽率逐渐降低,相对NaCl害率逐渐增大,对种子萌发有抑制作用。随着NaCl处理浓度的增大,膜荚黄芪幼苗中叶绿素量逐渐减少,可溶性蛋白质量也逐渐降低,二者都与NaCl处理浓度呈负相关;随着NaCl处理浓度的增加,幼苗中MDA量呈增加趋势,呈正相关;SOD、POD活性均不同程度地表现为先上升后下降的趋势,在75 mmol/L时达到最大值。结论 膜荚黄芪具有一定的抗NaCl胁迫能力,具有向盐碱地引种驯化的潜力。     

特异性PCR方法鉴别鳖甲药材和饮片

鳖甲为临床常用的动物药材,炮制加工后鳖甲药材及饮片形态特征丢失,难以鉴别。为建立高效稳定的鳖甲DNA鉴别方法,该研究将SDS法与柱纯化相结合,使用通用引物进行PCR扩增和测序,并根据鳖甲及其混伪品序列差异,寻找特异性SNP位点设计了鉴别引物,对PCR反应条件进行优化,并进行适用性及准确性考察。当退火温度为62℃,循环次数为35,使用设计的鳖甲特异性鉴别引物Biejia-272.F/R进行PCR扩增,鳖甲药材、饮片及醋鳖甲均扩增获得约300 bp的特异性鉴别条带,混伪品无条带。该方法可作为一种快速准确鉴别鳖甲正伪品的鉴定方法。     

香加皮与五加皮、地骨皮的PCR-RFLP鉴别

目的 建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法快速鉴别香加皮与其混淆品五加皮、地骨皮，避免因基原混乱影响用药安全。方法 从CGIR数据库获取的香加皮DSS标记序列，对香加皮DSS序列进行酶切位点分析，筛选香加皮与五加皮、地骨皮间差异位点，选择香加皮的特异性酶切位点Cla I，设计PCR-RFLP反应引物，对影响PCR-RFLP反应的退火温度、循环数、Taq酶、不同型号PCR仪、酶切时间等条件进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地香加皮与五加皮、地骨皮进行适用性考察。结果 在退火温度59 ℃、循环数为40个时，香加皮与五加皮、地骨皮样品经过特异性引物进行PCR扩增后，可出现清晰明亮的片段，酶切时间30 min，香加皮药材及其基原物种均可产生约140 bp和290 bp的目的片段，而2种混淆品五加皮和地骨皮药材及其基原物种只在250~500 bp有一条约430 bp的目的片段。该方法能对香加皮及其混淆品五加皮、地骨皮进行准确鉴别。结论 建立了香加皮与五加皮、地骨皮的PCR-RFLP鉴别方法，稳定性好、灵敏度高、适用性好，为香加皮与五加皮、地骨皮的质量控制提供参考。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

两种黄芪种子的扫描电镜与紫外光谱鉴别

目的；鉴别膜荚黄芪与蒙古黄芪种子，为黄芪药材种植提供品种筛选依据。方法：应用扫描电镜与紫外光谱法对种子进行鉴别研究。结果：两种黄芪种子种皮纹饰有差异，紫外吸收峰的数目和位置有所不同。结论：利用扫描电镜与紫外光谱法可准确鉴别两种黄芪种子。     

蒙古黄芪与膜荚黄芪种子形态特征及其鉴别方法的研究

目的为黄芪种子鉴定提供方法,为按中药材GAP原则制定相关标准操作过程(SOP)提供基础研究资料。方法采用肉眼直接观察、光学显微镜观察和电子显微镜进行扫描观察,比较蒙古黄芪和膜荚黄芪两种药用黄芪的种子形态特征和微观结构;通过萌发试验,比较二者的差异。结果通过肉眼和光学显微镜观察,两种黄芪种子的形态差异不明显,在电子显微镜下观察,两种黄芪种子的萌发孔形状、种脐和种皮的微观结构有明显差异;蒙古黄芪较膜荚黄芪种子硬实率高,萌发不整齐,萌发高峰滞后。结论在电子显微镜下能够对两种黄芪种子准确地做出鉴定,种脐、萌发孔、种皮的微观结构可作为鉴别两种黄芪种子的指标;种子硬实率和萌发动态规律可用于两种黄芪种子的辅助鉴别。