血管内皮生长因子C在人乳腺癌细胞株MCF-7及MCF-7/Adr中的表达

背景与目的：血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)是近期发现的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)家族的新成员。研究发现VEGF－C可特异性作用于淋巴管内皮细胞,并在多种人类肿瘤中表达。为探索VEGF－C在肿瘤发生,发展中的作用,我们分别检测了VEGF－C mRNA蛋白在人乳腺癌细胞株MCF－7及其耐药株MCF－7／Adr中的表达。方法;根据VEGF－C基因序列,设计合成地高辛标记的特异性寡核 探针,运用原位杂交方法检测培养的细胞株MCF－7和MCF－7／Adrk VEGF-C mRNA的表达,并运用免疫组织化学方法检测两种细胞中VEGF－C蛋白的表达,实验中用缓冲液分别代替杂交液和一抗作阴性对照。结果：原位杂交法检测到MCF－7和MCF－7／Adr细胞的胞浆中有阳性蓝色颗粒,免疫组化检测发现两种细胞的胞浆中均有阳性棕黄色颗粒,而阴性对照细胞的胞浆中则均无阳性颗粒。结论：人乳腺癌细胞株MCF－7及其耐药株MCF－7／Adr细胞能够转录VEGF-C mRNA,并在其细胞浆中翻译合成相应的蛋白。     

HER2/neu过表达通过PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞MCF7中p53基因表达及细胞生长和放疗敏感性的影响

目的 研究HER2／neu基因过表达通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路对乳腺癌细胞MCF7野生型p53基因表达、细胞增殖及对γ射线照射敏感性的影响。方法 以脂质体介导的HER2／neu基因转染MCF7细胞,用G418筛选阳性克隆。通过Western blot鉴定HER2／neu蛋白的表达,并检测p53、信号转导分子Akt和p-Akt蛋白含量的变化及PI3K通路抑制剂LY294002对上述蛋白表达水平的影响。以MTT法检测细胞增殖以及细胞对γ射线照射的敏感性。结果 共获得18个稳定转染HER2／neu基因的阳性克隆,其中1个克隆有HER2／neu基因过表达。过表达HER2／neu的MCF7细胞p-Akt蛋白含量升高,p53蛋白含量低于对照组细胞,LY294002能够抑制p-Akt蛋白和p53蛋白的变化。同时,过表达HER2／neu基因的MCF7细胞生长速度高于对照组细胞,对γ射线照射治疗的敏感性降低,而LY294002能够抑制细胞生长并增强放射治疗的敏感性。结论 MCF7细胞中HER2／neu基因的过表达,能够通过激活PI3K通路导致野生型p53蛋白含量减少、细胞增殖加快及放疗的敏感性降低,这可能是某些p53蛋白为野生型的肿瘤患者对治疗产生抗性的原因。     

外源性TNF-α基因克服多药耐药性的初步研究

目的：探索外源性细胞因子TNF－α基因克服多药耐药（multidrug resistnce,MDR)的新途径。方法：以重组逆转录病毒为载体,将TNF－α基因导入具MDR表型的人乳腺癌细胞系MCF－7／Adr ,经G418抗性筛选获阳性克隆MCF－7／Adr－TNF1与MCF－7／Adr－TNF2。以PCR和ELISA法检测目的基因的整合与表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变。MTT法检测外源性TNF－α基因的逆转MDR作用,流式细胞仪分析细胞内ADR积累的变化。结果：MCF－7／Adr－TNF1GN MCF－7／Adr－TNF2细胞中有TNF－α基因的整合和表达,病毒上清中TNF－α含量分别为1737pg/ml(10^6cells/48h)、2875pg/ml。与阴性对照细胞相比,MCF－7／Adr－TNF1GN MCF－7／Adr－TNF2细胞的生长速度明显减慢,生长抑制率分别为32．4％、54．8％,对ADR的耐药性明显降低,耐药逆转倍数分别为5．2倍、19．3倍,细胞内ADR的积累明显增加。结论：外源性TNF－α基因的导入能有效克服耐药性,增加细胞内药物的积累为其逆转耐药性的主要机制。     

细胞周期相关因子与乳腺细胞的癌变及生物学特性的相关性研究

目的：研究正常乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞之间以及不同恶性程度的乳腺癌细胞之间的细胞周期相关因子的表达异同。方法：采用Western印迹法检测正常乳腺细胞株AG11132A、ER阳性和乳腺癌细胞株MCF－7及ER阴性的乳腺癌细胞株MDA－MB－231之间细胞周期蛋白D1、E及P21蛋白表达的异同及与其生物学特性的关系。结果：（1）正常乳腺上皮细胞株高表达P21蛋白,低表达周期蛋白E。与正常细胞相比,乳腺癌细胞株MCF－7、MDA－MB－231细胞高表达周期蛋白E,其中表达的周期蛋白E中存在异常的你分子量周期蛋白E成分,而正常乳腺上皮细胞不表达这种异常 的周期蛋白E。（2）在乳腺癌细胞株之间,相对ER阳性的MCF－7细胞,ER阴性的MDA－MB－231细胞则高表达周期蛋白E,基本无表达P21蛋白。结论L（1）正常细胞与这间、相对低恶性程度的民相对高恶性和蔼的癌细胞之间的差别是多环节的、质和量异常导致的结果;（2）周期蛋白E及P21均可反映乳腺癌细胞的增殖活性和恶性程度,可能是乳腺癌的临床预后指标。     

塞来昔布逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药及其机制探讨

目的观察环氧合酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对肿瘤多药耐药（MDR）的逆转作用,并探讨其初步作用机制。方法在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr中,应用MTT方法检测塞来昔布对多柔比星（阿霉素,DOX）的耐药逆转倍数;RT-PCR及Western blot方法检测基因及蛋白的变化;流式细胞术（FCM）检测细胞膜P-gp的表达、功能、细胞周期和凋亡。结果塞来昔布作用24小时后,MCF-7/Adr细胞对DOX的敏感性明显增加,浓度为10μmol/L及20μmol/L时,耐药逆转倍数分别为1.82和3.80,呈现剂量依赖性。COX-2、mdr1、c-Jun、YB-1、survivin等在基因和蛋白水平明显下调（P〈0.01）,NF-κB无明显差异（P〉0.05）;20μmol/L作用24小时,P-gp的功能受抑制;G0＋G1期细胞增多,S期细胞减少（P〈0.05）,凋亡率明显增高（P〈0.05）。结论选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布可有效逆转MCF-7/Adr细胞多药耐药,在一定的浓度范围内呈现剂量依赖性,初步机制可能涉及干预转录因子的表达而下调mdr1,阻滞细胞周期及增加细胞凋亡。     

抑制MTAl对雌二醇调控ER阳性乳腺癌细胞MMP-9、TIMP-1表达的影响

目的：观察转移相关蛋白1（ Metastasis associated protein 1,MTA1）在雌激素调控雌激素受体（Estrogen Recepto,ER）阳性乳腺癌细胞基质金属蛋白酶－9（Matrix metalloproteinase －9,MMP－9）、基质金属蛋白酶组织抑制因子（ Tissue inhibitor of metalprotease －1,TIMP－1）中的可能作用。方法采用慢病毒转染MTA1－shRNA的方法建立特异性抑制MTA1表达的MCF－7模式细胞株。采用10 nM雌二醇（17β－estradiol,E2）处理细胞48 h,Real－time PCR、Western blot分别检测MMP－9、TIMP－1 mRNA与蛋白表达。结果 MTA1－shRNA最大抑制效率为84．9％,提示成功建立了抑制MTA1表达的MCF－7模式细胞株（MCF－7MTA1－shRNA）。 MCF－7野生株（MCF－7WT）在E2处理后MMP－9 mRNA和蛋白表达水平分别上升了46％（P＜0．05）和37％（P＜0．05）,TIMP－1 mRNA和蛋白表达水平分别降低了32．3％（P＜0．05）和18．2％（P＜0．05）;相对MCF－7WT,MCF－7MTA1－shRNA MMP－9 mRNA和蛋白表达水平分别降低了42．9％（P＜0．05）和36．7％（P＜0．05）,TIMP－1 mRNA和蛋白表达水平未见显著变化;采用E2处理MCF－7MTA1－shRNA后,MMP－9 mRNA和蛋白表达水平未见明显变化,TIMP－1 mRNA和蛋白表达水平分别降低了25．4％（P＜0．05）和32．2％（P＜0．05）。结论 MTA1在雌激素上调ER阳性乳腺癌细胞MMP－9表达的信号转导通路中可能发挥重要作用,但未参与雌激素调控ER阳性乳腺癌细胞TIMP－1表达的信号转导通路。     

诺美孕酮逆转乳腺癌耐药细胞株多药耐药性的研究

目的 研究诺美孕酮（NOM）对乳腺癌耐药细胞株（MCF7／ADR）多药耐药性（MDR）的影响,探讨其调节机制。方法 应用MTT法,研究NOM对MCF7／ADR药物敏感性的影响。采用半定量逆转录聚合酶联反应（RT－PCR）和免疫细胞化学染色,分析耐药基因MDR1、谷胱甘肽S转移酶Pi(GSTπ）、拓扑异构酶Ⅱα（Topo Ⅱα)和多药耐药相关蛋白（MRP）表达的变化。通过流式细胞技术观察NOM对MCF7／ADR细胞内药物积累和细胞周期的影响。结果 NOM对MCF7／ADR的MDR具有明显的逆转作用,在20,10和5μmol/L浓度时的逆转倍数分别为21,12和8倍,逆转强度明显高于前身化合物甲地孕酮,而与维拉帕米相当。5μmol/L NOM处理MCF7／ADR后,MDRI的mRNA表达水平明显降低,呈现时间依赖性变化;P糖蛋白（P－gp)和GSTπ蛋白的变化符合相应mRNA表达的变化;MRP和Topo Ⅱα基因表达未见明显变化。用NOM 20,10和5μmol/L分别处理2h后,ADR在细胞内的积累分别增加到2．7倍、2．3倍和1．5倍。同时,NOM可明显加强ADR对MCF7／ADR细胞在G2M期的阻滞作用。结论 NOM具有较强的逆转MCF7／ADR细胞MDR的作用,其逆转机制为多种途径,包括时间依赖性下调MDRI和GSTπ基因的表达,增加细胞内药物积累,加强ADR对MCF7／ADR在G2M期的阻滞作用等。     

人乳腺癌细胞凋亡与去磷酸化RB蛋白的关系

目的 :研究乳腺癌细胞凋亡与去磷酸化RB蛋白的关系。方法 :以乳腺癌细胞株MCF 7/S(化疗敏感细胞株 )和MCF 7/ADR(耐多柔比星细胞株 )为研究对象 ,用MTT比色法检测乳腺癌细胞的化疗敏感性 ;采用免疫细胞化学法检测多柔比星 (ADR)作用前后RB蛋白的表达状态 ;应用流式细胞术检测ADR诱导乳腺癌细胞凋亡程度。结果 :ADR能抑制敏感细胞MCF 7/S增殖 ,半数抑制浓度 (IC50 )为 0 .12 8μg/ml,而对应的耐药细胞MCF 7/ADRIC50值为 10 .89μg/ml,MCF 7/S细胞较MCF 7/ADR细胞对ADR敏感 86倍。加ADR前两种细胞胞核中的磷酸化RB蛋白均为阳性 ,去磷酸化RB蛋白均为阴性。经不同浓度ADR处理后 ,随着ADR浓度的增加 ,MCF 7/S细胞去磷酸化RB蛋白表达量逐渐增高 ,而MCF 7/ADR细胞去磷酸化RB蛋白表达量无明显增高。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 ,结果表明ADR诱导MCF 7/S细胞凋亡作用比MCF 7/ADR强 (P <0 .0 1)。结论 :乳腺癌MCF 7/S细胞凋亡与去磷酸化RB蛋白表达呈正相关 (P <0 .0 5 ) ,而MCF 7/ADR细胞凋亡与去磷酸化RB无明显相关 (P >0 .0 5 )。     

脂氧合酶抑制剂NDGA对胰腺癌细胞PCNA-1增殖和凋亡的影响

目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA对人胰腺癌细胞株PCNA-1生长抑制、诱导凋亡及其对bcl-2、bax表达的影响。方法：采用MTT法检测NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1增殖活性的影响,流式细胞术检测NDGA处理的胰腺癌细胞株PCNA-1的细胞周期及凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果：NDGA抑制胰腺癌细胞株PCNA-1的增殖活性,呈剂量依赖效应关系;细胞经100μmol／L的NDGA处理后G0／G1期细胞减少（P〈0．05）、S期细胞增多（P〈0．05）,G2／M期细胞无明显变化;细胞经100μmol／L的NDGA处理48h后bcl-2蛋白与对照组相比表达下调（P〈0．01）、bax蛋白与对照组相比表达上调（P〈0．01）。结论：NDGA对胰腺癌细胞株PCNA-1有抑制增殖、诱导其凋亡作用,诱导细胞凋亡的机制可能与细胞凋亡相关基因bcl-2表达下调、bax表达上调有关。     

五味子对乳腺癌细胞抑制作用的体外研究

目的:评估中药五味子抗癌有效成分木酚素及其代谢产物对雌激素受体阳性以及阴性的乳腺癌细胞株的体外作用,并评价五味子对于乳腺癌的体外杀伤作用。方法:利用ATP 生物荧光药物敏感性检测技术(ATP-TCA),检测五味子木酚素对50例乳腺癌的体外杀伤作用,并检测不同浓度五味子木酚素及其代谢物（END、ENL）对于ER（＋）的MCF-7、T47D和ER（－）的MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞株的杀伤作用。评价五味子的体外作用有效率及其与雌激素受体表型是否相关。结果:五味子对乳腺癌患者的乳腺癌细胞具有明显的体外杀伤作用,体外有效率为34.0%(17/50);五味子木酚素以浓度依赖的方式,显著降低乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、MDA-MB-435、MDA-MB-231的存活率,且该抑制作用和细胞雌激素受体的关系并不明显（P＞0.05）,五味子木酚素在较低浓度（0.1-30μmol/L）下对雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7、T47D表现出促进增殖的作用,当浓度提高至100μmol/L后,五味子木酚素对MCF-7、T47D增殖表现出显著的抑制作用,并呈剂量-效应关系。木酚素的低浓度促进乳腺癌细胞增殖作用在雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-435、MDA-MB-231中并不明显,当浓度提高至100μmol/L后,五味子木酚素对MDA-MB-435、MDA-MB-231增殖表现出显著的抑制作用,并呈剂量-效应关系。ENL、END(3-1000μmol/L)在体外对乳腺癌细胞株存在显著抑制作用（P＜0.05）,并有剂量依赖效应,未发现其与细胞雌激素受体表型有关联（P＞0.05）。木酚素在较低浓度区间（0.1-30μmol/L）促进ER(＋)细胞株的增殖,但对ER(－)细胞株作用不显著。结论:五味子对乳腺癌细胞系以及乳腺癌患者细胞均具有较强的杀伤作用,值得进一步临床研究和应用。     

多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/Adr中体外转录的小分子干扰RNA(siRNA)对mdr1基因的干扰作用

目的 探讨多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr中体外转录的小分子干扰RNA（siRNA）对mdr1基因的干扰作用。方法将siRNA转染多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr后，采用共聚焦荧光显微镜、Northernblot和Westernblot分析siRNA在蛋白和mRNA水平对mdr1基因的静止作用；并用MTT法测定siRNA处理后阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结果 特异性siRNA能明显抑制P170蛋白表达及其mRNA，并能明显提高阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结论 siRNA能逆转细胞耐药性，可能将为肿瘤耐药的治疗提供又一新技术。     

中频交变微电流影响人乳腺癌细胞耐药性的初步研究

目的:探究中频交变微电流是否可以改变人乳腺癌细胞株耐药性;针对实验结果,分析其可能机制。方法:对人乳腺癌细胞MCF-7施加不同参数中频交变微电流,选出较优参数。测定人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药株MCF-7/Adr的IC50值。将处于对数生长期的人乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adr接板,分为化疗药物组和联合处理组,施加不同的处理方法。CCK-8法检测以上各组细胞存活率,分析中频交变微电流对乳腺癌细胞株耐药性的影响。将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7分为对照组和电刺激组,用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）定性观察荧光标记的耐药蛋白P-gp,Western blot法半定量P-gp,流式细胞仪FITC标记定量测定荧光标记的P-gp。结果:中频交变微电流能降低耐药株MCF-7/Adr的IC50和耐药指数（≥80μg/ml,协同作用）。定性、半定量和定量三种方法均显示中频交变微电流刺激后,细胞P-gp蛋白表达量均有下降趋势。结论:中频交变微电流能够增强人乳腺癌耐药细胞药物敏感性,有可能成为辅助化疗的治疗手段,其机制尚不明确,有可能是通过降低细胞P-gp的表达,抑制细胞内药物外排发挥作用的。     

洛伐他汀和 BRCA1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响

背景与目的：人乳腺癌和卵巢癌易感基因BRCA1是一个抑癌基因,其编码产物能以细胞周期依赖的方式在细胞中表达,其突变增加了患乳腺癌和卵巢癌的危险。洛伐他汀(lovastatin,LOV)是胆固醇合成的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原抑制剂。本研究探讨BRCA1基因与LOV合用对人乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响及其作用机理。方法：运用脂质体转染法将含有BRCA1基因的表达载体转染MCF-7细胞;RT-PCR和Western blot鉴定转染后BRCA1的表达。MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期相分布,Western blot检测Cyclin D1、Rb蛋白的表达。结果：转染pcDNA3-beta-HA-hsBRCA1的MCF-7细胞能稳定生长。台盼蓝染色结果显示,经LOV处理4天后MCF-7细胞生长受到抑制,MCF-7^BRCA1细胞抑制更显著。与MTT法的结果相类似。流式细胞仪分析表明,LOV处理后,G0／G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,随处理时间的延长,G0／G1期细胞进一步增加,且MCF-7^BRCA1细胞比MCF-7细胞变化更明显。Western blot结果显示,LOV处理48h和72h后,Cyclin D1、Rb蛋白表达水平均下凋,尤其是MCF-7BR^BRCA1细胞下凋更明显。结论：转染BRCA1基因能提高MCF-7细胞对洛伐他汀的敏感性,进而增强洛伐他汀的抗肿瘤作用。     

稳定转染ERβ基因对MCF-7乳腺癌细胞系生长特性的影响

目的研究在不同处理因子作用下,外源基因ERβ的表达对MCF-7乳腺癌细胞系生长特性的影响。方法利用lipofectamine 2000将ERβ真核表达载体pCDNA3,ERβ导入MCF-7乳腺癌细胞系。采用含雌激素应答元件（ERE）的荧光素酶报告基因及Western blot方法,检测转染细胞中ERβ的转录活性和蛋白表达水平,筛选阳性克隆。以亲本细胞MCF-7及转染空载体质粒pCDNA3的MCF-7细胞为对照,在雌激素E2和雌激素受体拮抗剂4-OHT作用下观察细胞的生长特点。结果在转染ERβ基因的MCF3细胞系中,ERβ的转录激活活性明显升高;Western blot检测证实,ERβ的蛋白表达水平显著增高。在无处理因子情况下,外源基因ERβ在MCF-7细胞系中的表达对细胞的形态及生长速度无明显影响。与亲本细胞MCF-7及转染空载体质粒的MCF-7细胞相比,稳定转染ERβ的MCF-7细胞对雌激素的敏感性下降,但对4-OHT处理的敏感性无明显减少。结论外源性ERβ基因在MCF-7乳腺癌细胞中的稳定表达不增加对4-OHT的耐药性,但使之对雌激素的敏感性下降。     

Transfer of p14ARF gene in drug-resistant human breast cancer MCF-7/Adr cells inhibits proliferation and reduces doxorubicin resistance

The INK4a/ARF locus on human chromosome 9p21 encodes two tumor suppressors, p16INK4a and p14ARF, that restrain cell growth by affecting the functions of the retinoblastoma protein and p53, respectively. Overexpression of ARF results in cell cycle arrest in both G1 and G2. To elucidate the effect of p14ARF gene on multidrug-resistant tumor cells, we transferred a p14ARF cDNA into p53-mutated MCF-7/Adr human breast cancer cells. In this report we demonstrated for the first time that p14ARF expression was able to greatly inhibit the MCF-7/Adr cell proliferation. Furthermore, p14ARF expression resulted in decrease of MDR-1 mRNA and P-glycoprotein production, which linked to the reducing resistance of MCF-7/Adr cells to doxorubicin. These results imply that drug resistance might be effectively reversed by the wild-type p14ARF expression in human breast cancer cells.     

Bap29varP, a variant of Bap29, influences the cell surface expression of the human P-glycoprotein

P-glycoprotein (Pgp), a plasma membrane (PM) glycoprotein, is responsible for the development of multidrug resistance. The mechanism by which Pgp is targeted to the PM is not defined. To identify proteins that influence Pgp trafficking, we utilized the yeast two-hybrid analysis procedure, which identified a new isoform of endoplasmic reticulum (ER)-bound Bap29, termed Bap29varP, as an interacting protein with the N-terminus of Pgp. The drug-resistant human breast cancer MCF-7 (MCF-7/Adr(R)) cells express both Bap29varP and approximately 170 kDa Pgp, which are however absent in the drug-sensitive MCF-7 cells. When Bap29varP was overexpressed in MCF-7/Adr(R) cells, Pgp was predominantly localized in the ER and intracellular vesicles, suggesting Bap29varP influences Pgp trafficking. When Pgp was expressed in MCF-7 cells, it was exclusively found in the ER with a molecular mass of approximately 160 kDa slightly smaller than that of the molecular mass of Pgp expressed in MCF-7/Adr(R) cells. On the other hand, when Pgp was expressed in Bap29varP-containing human colon adenocarcinoma HT-29 cells, it was localized at the PM. These findings together suggest that Bap29varP acts as an essential chaperone, influencing the processing and trafficking of Pgp to the cell surface.