沙鼠肝泡球蚴组织中骨桥蛋白与IL-10的表达及相关性研究

目的 检测沙鼠肝泡状棘球蚴组织中骨桥蛋白（OPN）及白细胞介素-10（IL-10）的表达,并进一步探讨两者的相关性。方法 20%泡状棘球蚴组织混悬液开腹直视下肝脏穿刺注射感染长爪沙鼠60只,每只0.1mL,建立肝泡状棘球蚴长爪沙鼠模型。随机分为模型组（无干预,40只）和实验组（抗OPN抗体干预,20只）。感染至100 d时剖杀所有长爪沙鼠,观察泡状棘球蚴生长和转移情况,取长爪沙鼠肝泡状棘球蚴组织和转移灶标本。采用免疫组织化学SP法观察沙鼠肝泡状棘球蚴组织和转移灶中OPN及IL-10的表达情况。 结果 60只长爪沙鼠全部感染肝泡状棘球蚴。免疫组化染色显示肝泡状棘球蚴组织可见OPN及IL-10不同程度的表达。模型组中OPN和IL-10阳性细胞表达率分别为72.5%（29/40）和65%（26/40）,OPN及IL-10主要分布在肝泡状棘球蚴纤维囊壁,阳性产物均定位于细胞浆。65%（26/40）的长爪沙鼠模型经病理证实发生胸廓内淋巴结转移,伴有胸廓淋巴结转移的肝泡状棘球蚴组织中OPN及IL-10阳性细胞表达率分别为84.6% (22/26)、76.9%(20/26),均高于未发生胸廓淋巴结转移的肝泡状棘球蚴组织（50%、42.9%）（P﹤0.05）。实验组OPN和IL-10的阳性细胞表达率分别为40%（8/20）和35%(7/20)。OPN与IL-10表达呈正相关（r=0.605,P=0.000）。结论 OPN阳性表达可能与肝泡状棘球蚴的转移有关,OPN与IL-10可能在肝泡状棘球蚴的生长中起协同作用。     

抗骨桥蛋白抗体对沙鼠肝多房棘球蚴组织中的基质金属蛋白酶2和转化生长因子β1的影响北大核心CSCD

目的观察抗骨桥蛋白(OPN)抗体对长爪沙鼠体内多房棘球蚴组织中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法 180只沙鼠随机均分为3组,即抗OPN抗体组(A组)、兔血清对照组(B组)和模型对照组(C组),3组沙鼠均采用肝内穿刺接种,每鼠注射原头节混悬液0.1 ml(约400个原头节)。A组和B组于接种当天,分别经尾静脉注射抗OPN抗体和兔血清0.15 ml/鼠,每2天1次,7次后改为每周1次,直至处死。C组不作处理。分别于感染后20、60、100、140、180和220 d后每组各处死10只沙鼠,取肝脏多房棘球蚴组织。免疫组织化学法观察多房棘球蚴组织中MMP-2和TGF-β1细胞因子的表达情况。结果所有沙鼠肝脏中均见大小不等的团块状囊泡。多房棘球蚴组织中的MMP-2免疫组化染色结果显示,3组有阳性细胞表达的动物数之间差异无统计学意义(均P>0.05)。而A组有TGF-β1阳性细胞表达的动物数在感染后100、140和180 d(3、2和2只)均显著少于B组(8、8和9只)和C组(8、9和9只)(P<0.05),其他时间点3组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论抗OPN抗体可以在一段时间内减少沙鼠多房棘球蚴组织中TGF-β1的表达,但对MMP-2没有影响。     

抗OPN抗体干预感染泡球蚴沙鼠后细胞因子水平的动态变化

目的观察人工接种泡球蚴(EM)沙鼠在抗骨桥蛋白(OPN)抗体干预下体内白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-5和IL-10水平动态变化,探讨抗OPN抗体对泡球蚴感染免疫机制的影响。方法采用开腹直视下肝脏穿刺注射的方法,用20%泡球蚴组织混悬液感染长爪沙鼠180只,每只0.1ml,建立肝泡球蚴病(AE)沙鼠模型。将感染沙鼠随机分为实验组、对照组和空白组,每组60只。实验组沙鼠接种泡球蚴后当天经尾静脉注射抗OPN抗体,每次0.15ml,每隔两日注射一次,注射7次后,每隔1周注射一次;对照组沙鼠经尾静脉注射兔血清(时间和剂量同上);空白组为单纯模型组。分别于感染1、20、40、60、80和100d后,各组随机选取10只沙鼠,摘眼球取血,离心,收集血清,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-2、TNF-α、IL-5和IL-10含量。结果感染100d时实验组IL-10为(77.93±4.13)pg/ml,对照组为(82.46±4.24)pg/ml,空白组为(84.69±5.57)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05),其余各时间段的IL-10水平及各时间段其他3种细胞因子水平组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Th1细胞介导的细胞免疫与Th2细胞介导的体液免疫共同参与宿主抗肝泡球蚴免疫。抗OPN抗体可能对血清IL-10表达水平有一定的抑制作用。     

抗骨桥蛋白抗体对沙鼠肝多房棘球蚴组织周围血管生成的影响

目的观察抗骨桥蛋白（osteopontin,OPN）抗体对长爪沙鼠肝多房棘球蚴（俗称泡球蚴）组织周围血管生成的影响。方法 90只长爪沙鼠随机分为3组,即模型对照组（A组）,兔血清对照组（B组）和抗OPN抗体干预组（C组）,所有沙鼠均采用开腹肝穿刺法接种泡球蚴原头节悬混液0.1ml（约含原头节400个）。B组于接种当天注射兔血清0.15ml/鼠,1次/2d,连续7次,之后改为每周1次,直至处死;C组采用相同的方法注射抗OPN抗体（效价1∶32）;A组不作任何处理。分别与感染后第20、60、100、140、180d每组各处死6只沙鼠,留取肝泡球蚴组织,制作组织切片采用苏木素-伊红（H-E）法和免疫组化Envision法观察各组沙鼠肝泡球蚴组织MVD-CD34的表达情况。结果感染泡球蚴沙鼠肝脏中均可见团块状泡球蚴组织,部分播散至腹腔。感染20d时A、B、C组MVD分别为（9.83±3.87）/HP,（9.67±2.94）/HP和（7.50±1.87）/HP,感染60d时分别为（33.67±3.67）/HP,（32.83±6.11）/HP和（24.33±5.61）/HP,感染100d时分别为（44.67±4.92）/HP,（42.20±6.26）/HP和（28.00±8.76）/HP,感染140d时分别为（34.17±3.19）/HP,（31.67±4.97）/HP和（20.50±4.72）/HP;感染180d时分别为（32.33±7.42）/HP,（29.67±3.88）/HP和（13.50±3.21）/HP。其中感染60d及以后各时间点C组与A组和B组相比,微血管数差异有统计学意义（P〈0.05）。结论抗OPN抗体可抑制沙鼠肝泡球蚴组织周围血管生成。     

抗骨桥蛋白抗体对沙鼠肝泡球蚴组织细胞因子表达的影响

目的观察抗骨桥蛋白（OPN）抗体对沙鼠肝泡状棘球蚴组织中细胞因子表达的影响,并探讨其免疫机制。方法选长爪沙鼠30只,采用开腹直视下肝脏穿刺接种泡状棘球蚴组织混悬液的方法建立模型后,随机分为实验组（抗OPN抗体干预,10只）、对照组（兔血清干预,10只）和模型组（无干预,10只）。于100d后剖杀所有沙鼠,取肝泡状棘球蚴组织,采用苏木精-伊红（HE）染色法和免疫组织化学SP法观察沙鼠肝泡状棘球蚴组织中IL-2,IL-5,IL-10及TNF-α因子的表达情况。结果感染泡状棘球蚴的沙鼠肝脏和腹腔中见大小不等的团块状囊泡。IL-2,IL-5及TNF-α在实验组、对照组与模型组间免疫组化染色阳性细胞率比较差异无统计学意义（P〉0.05）,而实验组IL-10的阳性细胞率明显低于对照组与模型组（P〈0.05）。结论 Th1细胞介导的细胞免疫与Th2细胞介导的体液免疫共同参与了宿主抗肝泡状棘球蚴免疫。抗OPN抗体可使IL-10的表达减低。     

骨桥蛋白与肝泡型棘球蚴转移的相关性研究

目的研究骨桥蛋白(OPN)在肝泡型棘球蚴组织中的分布和表达,探讨骨桥蛋白在肝泡型棘球蚴转移中的作用。方法采用开腹直视下肝脏穿刺注射的方法,用20%泡型棘球蚴组织混悬液感染长爪沙鼠40只,每只0.1ml,建立肝泡型棘球蚴长爪沙鼠模型。感染100 d后剖杀所有长爪沙鼠,观察泡型棘球蚴生长和转移等情况,取长爪沙鼠肝脏、肝泡型棘球蚴组织和转移灶标本。采用苏木素-伊红(HE)染色法和免疫组织化学SP法观察沙鼠肝泡型棘球蚴组织和转移灶中骨桥蛋白的表达情况。结果感染泡型棘球蚴的长爪沙鼠的肝脏和腹腔中见大小不等的团块状囊泡。免疫组织化学染色显示,肝泡型棘球蚴长爪沙鼠模型中肝泡型棘球蚴组织中可见骨桥蛋白不同程度的表达,其阳性细胞检出率为70%(28/40),骨桥蛋白主要分布在肝泡型棘球蚴纤维囊壁、炎症细胞和部分肝细胞中。60%(24/40)的长爪沙鼠模型经病理证实发生胸廓内淋巴结转移,伴有胸廓淋巴结棘球蚴转移的肝脏泡型棘球蚴组织的OPN阳性细胞检出率(83%,20/24)高于未发生胸廓淋巴结转移的肝脏泡型棘球蚴组织(50%,8/16)(P<0.05)。淋巴转移灶中骨桥蛋白阳性细胞检出率(92%,22/24)明显高于泡球蚴组织(...     

抗骨桥蛋白抗体抑制肝泡型棘球蚴侵袭性生长和转移

目的外源性给予抗骨桥蛋白(osteopontin,OPN)抗体,观察其对肝泡型棘球蚴生长和转移的抑制作用。方法采用开腹直视下肝脏穿刺接种泡型棘球蚴组织混悬液的方法(0.1 ml/只,约含原头节400个),建立肝泡型棘球蚴沙鼠模型180只,随机分为3组。实验组和对照组于接种后当天经尾静脉分别注射0.15 ml抗OPN抗体(效价1∶32)和沙鼠注射用的兔血清,共注射17次,前7次每次间隔2 d,后10次每次间隔1周。模型组未作处理。上述3组沙鼠分别于感染后1、20、40、60、80和100 d随机各处死10只沙鼠,观察泡型棘球蚴的生长和转移情况,采用免疫组织化学SP法观察各组沙鼠肝泡型棘球蚴组织中OPN的表达情况。于感染后100 d乙醚轻度麻醉沙鼠后,摘眼球取血,分离血清,用ELISA测定沙鼠血清中OPN的含量。结果感染后1、20、40、60和80 d,实验组与对照组和模型组囊湿重、胸腔淋巴结转移率间的差异均无统计学意义(P>0.05)。感染后100 d,实验组囊湿重、胸腔淋巴结转移率[(7.28±0.38)g、20%]均低于对照组[(9.70±0.61)g、70%]和模型组[(9.32±0.73)g、70%](...     

大鼠作为泡球蚴保种动物模型的实验观察

目的研究大鼠作为泡球蚴保种模型动物的可行性。方法选取Wistar、SD大鼠,使用在长爪沙鼠体内保种的泡球蚴组织碎片进行腹腔接种,并对接种成功鼠种进行种内二次传代和抗泡球蚴组织多克隆抗体的免疫组化鉴定。同时用新西兰白兔、豚鼠、长爪沙鼠建模,观察泡球蚴感染情况。结果新西兰白兔、豚鼠、未能通过腹腔接种感染,Wistar大鼠、SD大鼠获得感染,感染率分别为85%和80%,长爪沙鼠感染率100%;感染大鼠可有一个较长的存活期,体内可见到生长活跃的泡球蚴虫体组织和原头节;泡球蚴能在Wistar大鼠、SD大鼠中稳定传代。结论 Wistar和SD大鼠是较理想的泡球蚴保虫动物。     

PD-1/PD-L1及相关炎症因子在细粒棘球蚴感染致肝损伤中的免疫调节作用北大核心CSCD

目的探讨程序性死亡受体-1(programmed cell death receptor 1,PD-1)、程序性死亡受体配体1(programmed cell death-Ligand-1,PD-L1)及相关炎症因子在棘球蚴感染免疫损伤中的免疫调控机制。方法将BALB/c小鼠分为2个组:对照组(40只)、模型组(40只)。采用原头蚴腹腔注射制备细粒棘球蚴感染模型,腹腔接种后2 d、8 d、1个月、3个月、6个月时每组取8只小鼠行内眦静脉取血,采用流式细胞术微球阵列法试剂盒(Cytometric Bead Array,CBA)检测小鼠外周血中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。取肝脏进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,采用免疫组织化学染色法检测小鼠肝组织中PD-1、PD-L1的表达。结果对照组腹部未见异常。模型组小鼠腹部出现明显膨隆,腹腔中有包囊。对照组小鼠肝组织结构正常,模型组小鼠6个月时肝脏有大片肝细胞坏死变性,可见大量炎性细胞浸润。对照组小鼠肝组织PD-1、PD-L1表达均呈阴性,模型组小鼠3个月时肝脏开始出现明显PD-1表达的阳性细胞,主要位于肝损伤区域,6个月时小鼠PD-1的表达主要集中于肝坏死区域周围,可见明显增多的阳性细胞存在。模型组2 d和8 d时均可见PD-L1表达的大量阳性细胞,1个月肝脏PD-L1呈低表达,3个月开始表达又升高。模型组小鼠TNF-α在感染2 d时高于对照组(t=15.587,P<0.05),后开始下降,从3个月开始时TNF-α升高,至6个月时达高峰,模型组小鼠血清中IL-17A在感染8 d时高于对照组(t=0.067,P<0.05),后一直呈上升趋势,至6个月时达高峰,IL-6在感染2 d开始即高于对照组,6个月时达高峰。结论IL-6、TNF-α、IL-17A参与了细粒棘球蚴感染导致的炎症反应。细粒棘球感染模型小鼠肝脏出现高表达的PD-1/PD-L1,随着时间延长,PD-1表达逐渐增强,尤其是细粒棘球蚴感染早期,PD-L1高表达,PD-1、PD-L1在感染前期、中期就开始发挥负调节作用,可进一步促进棘球蚴组织在体内迅速生长,参与肝脏的损伤作用。在细粒棘球蚴感染早、中期,阻断PD-1/PD-L1信号通路,将有助于抗棘球蚴感染。     

泡球蚴感染小鼠肝脏中IL-10和TGF-β1的动态变化

目的观察泡球蚴感染小鼠肝脏中白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β1)的动态变化。方法将60只雌性BALB/c小鼠随机均分为实验组和对照组,实验组腹腔注射活原头节悬液0.2ml(约含400个原头节),对照组腹腔注射等量生理盐水,分别于接种后2、8、30、90、180和360d各处死5只小鼠,取肝组织进行病理学检查,并用免疫组织化学法检测肝组织中IL-10和TGF-β1的表达情况。结果实验组小鼠,腹腔和肝小叶出现多处直径不等的小囊泡,随感染时间的延长逐渐增多增大,与周围肝组织分界不明显。HE染色显示,实验组小鼠肝脏出现炎症细胞浸润,泡球蚴纤维囊壁与肝细胞和囊壁之间炎症反应带的形成等不同程度的病理改变;对照组小鼠肝小叶结构完整,偶见少量炎症细胞浸润,肝细胞胞浆疏松化和脂肪变性。实验组小鼠肝组织表达水平随着泡球蚴感染时间的延长而逐渐上升,感染后90d,实验组小鼠肝组织中IL-10和TCF-β1的表达水平均达高峰,细胞阳性率分别为(16.39±1.73)%和(23.69±2.29)%,与对照组比较[(1.09±0.10)%和(0.98±0.09)%]差异均有统计学意义(P<0.01),而且之后均维持在较高水平。结论小鼠泡球蚴感染中晚期,IL-10和TGF-β1表达水平均提高,其免疫抑制作用不利于清除和控制肝脏中泡球蚴。     

肿瘤坏死因子-α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达。方法40只雌性昆明小鼠随机分为实验组(n=20)和假手术对照组(n=20),实验组小鼠开腹直视下肝脏穿刺注射0.1 ml泡型棘球蚴混悬液,对照组注射等量生理盐水。感染6个月后处死小鼠,取肝组织,观察泡型棘球蚴的生长和转移情况;用苏木素-伊红(HE)染色法观察组织病理变化;免疫组织化学法检测TNF-α和caspase-3在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围组织中的表达;原位末端标记技术(TUNEL)检测肝组织和泡型棘球蚴病灶周围单核细胞的凋亡。结果感染6个月后,实验组小鼠肝脏可见大小不等的结节状或团块状的泡型棘球蚴组织,淋巴结转移率为45.0%(9/20)。HE染色后观察发现,实验组肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有大量单核细胞浸润。免疫组化染色结果显示,实验组TNF-α和cas-pase-3蛋白在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有不同程度的阳性表达,单核细胞阳性细胞检出率分别为100%、100%和95%、100%,与对照组肝组织中阳性细胞检出率(5%和0)比较均有统计学意义(P<0.01)。TUNEL结果显示,肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围单核细胞发生凋亡,单核细胞阳性细胞检出率为100%,与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。结论泡型棘球蚴在感染宿主过程中,引起TNF-α蛋白高表达,可能参与了诱导肝泡型棘球蚴周围宿主单核细胞的凋亡,从而抑制宿主的免疫功能。     

已酮可可碱联合阿苯达唑治疗小鼠泡球呦病的疗效观察

目的观察己酮可可碱(PTX)和阿苯达唑(ABZ)单独及联合用药对小鼠继发性泡球蚴病的疗效。方法对小鼠继发性泡球蚴病进行药物治疗,各治疗组药物用量分别为:ABZ组50mg/(kg·d);PTX高剂量组360mg/(kg·d);PTX低剂量组180mg/(kg·d);联合组ABZ50mg/(kg·d) PTX180mg/(kg·d);感染对照组(未治疗组)和空白对照组均给予等体积生理盐水,用小鼠灌胃针经口每天灌胃给药1次,连续治疗100d后(其间14只死亡),检测各小鼠泡球蚴湿重、抑囊率及小鼠血清细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-10;并对泡球蚴组织进行病理组织学和超微结构观察。结果PTX在体外能有效地杀灭原头节(高剂量组为100%),在体内对泡球蚴抑制作用虽较弱(高剂量组为37%),但能增强小鼠的免疫力。联合用药对泡球蚴有明显的抑制作用,抑囊率为88%,ABZ抑囊率为58%(P<0.05)。结论PTX联合ABZ治疗小鼠继发性泡球蚴病疗效明显优于ABZ。     

多房棘球蚴病患者肝病灶组织差异表达基因的研究

目的探讨多房棘球蚴感染小鼠肝差异基因在多房棘球蚴病患者肝病灶组织中的表达情况及意义。方法选取高通量基因表达数据库中编号为GSE24376的小鼠感染多房棘球蚴基因芯片数据集,分析感染小鼠和未感染小鼠之间的差异表达基因,对差异表达基因进行基因本体(GO)分析。取6例多房棘球蚴病患者肝病灶组织和距离病灶组织2 cm的周围肝组织,采用荧光定量PCR检测2个高表达差异基因mRNA相对转录水平。取45份多房棘球蚴病患者石蜡包埋肝组织样品(炎性反应和肝纤维化改变严重的病灶29份,较少炎性细胞浸润和肝纤维化病变的肝组织16份),采用免疫组化法分析2个高表达差异基因的表达情况。用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析。结果生物信息学分析结果显示,共筛选出21个差异表达基因,其中9个基因表达上调,12个基因表达下调。GO分析结果显示,差异基因主要位于细胞内囊泡及细胞外基质等细胞成分中,参与了中性粒细胞的脱颗粒及活化等生物过程,并且具有CC趋化因子受体结合活性及趋化因子活性。高表达差异基因CHI3L3 (在人体中为CHI3L1)和CCL8荧光定量PCR结果显示,6例多房棘球蚴病患者肝病灶组织中CHI3L1和CCL8 mRNA相对转录水平均高于病灶周围肝组织(P <0.01),最高倍数分别达7倍和9倍。免疫组化分析结果显示:29份多房棘球蚴病患者肝组织炎性反应和肝纤维化改变严重的病灶样品中,有20份(占69%)呈CHI3L1蛋白高表达,其主要着色部位位于细胞浆;有22份(占76%)呈CCL8蛋白高表达。16份多房棘球蚴病患者肝组织轻微炎症样品中,2份(占13%)呈CHI3L1蛋白阳性;4份(占33%)呈CCL8蛋白阳性。炎性反应和肝纤维化改变严重的病灶组织中,CHI3L1和CCL8蛋白的阳性表达率分别达96%和97%,均高于轻微炎症肝组织的3%和8%(P <0.01)。结论 CHI3L1和CCL8蛋白在多房棘球蚴病患者肝组织中表达增高,提示二者在机体对虫体的免疫应答过程中发挥了一定作用。