胚胎肝细胞移植治疗小鼠肝纤维化

目的 观察移植胚胎肝细胞减轻小鼠肝纤维化的作用.方法 孕14 d的BALB/C小鼠胚胎肝细胞移植到雌性BALB/C小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝纤维化.60只雌性小鼠随机分为对照组,模型组及治疗组.3个月后测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)浓度及肝脏羟基脯氨酸(Hyp)含量.免疫组织化学检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及Y染色体性别决定区域蛋白(SRY)表达来确定移植的胚胎肝细胞在肝内的增殖分化.结果 移植胚胎肝细胞能显著降低血清ALT、AST、HA和LN的水平(P＜0.01).胚胎肝细胞移植组肝脏Hyp含量也明显低于模型组(P＜0.01).移植组肝脏α-SMA的表达明显低于模型组.胚胎肝细胞移植及诱导肝纤维化3个月后,胚胎肝细胞能增殖分化为肝细胞和胆管细胞,占肝脏的30%～50%.结论 在诱导肝纤维化过程中,移植胚胎肝细胞有向肝细胞和胆管细胞高增殖分化的能力,并有效地减轻肝损害和肝纤维化.     

人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD/SCID小鼠重建多系造血

目的探讨人脐血单个核细胞（MNC）体外扩增后植入能力的改变，以及对NOD／SCID小鼠造血重建的影响。方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增，比较扩增后的效果及细胞凋亡的变化；将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内，观察小鼠6周后的存活率和造血重建情况。结果人脐血MNC在干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶受体3配基（FL）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素3（IL-3）细胞因子共同作用下，培养6～11）d获得最佳扩增效果，同时细胞表面膜联蛋白V（Annxin V）的表达明显减少；移植6周后有55．6％的小鼠存活，存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中均能检测出人类CD45、CD34、CD33、CD3和CDl9抗原，外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—Ⅰ基因和Alu基因。结论SCF＋FL＋IL-6＋IL-3细胞因子协同作用能有效扩增人脐血MNC，MNC扩增6d后可成功植入N（）D／SCID小鼠体内，并帮助小鼠重建多系造血。     

人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡增强纤维化肝脏再生能力

目的 探讨人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡（h UC-MSC-EV）在纤维化肝脏再生中的作用。方法将C57BL/6小鼠随机分为正常肝脏70%肝切除组（Oil+PHx组）、肝纤维化70%肝切除组（CCl4+PHx组）、肝纤维化70%肝切除+间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EV）治疗组（CCl4+PHx+MSC-EV组）,每组8只。将LX-2细胞分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、转化生长因子（TGF）-β组、TGF-β+MSC-EV组。检测各组小鼠肝部分切除术后丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）水平,分析各组小鼠肝组织纤维化及增殖相关指标的表达情况。检测各组LX-2细胞表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维母细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）信使RNA(m RNA)的表达水平。观察对小鼠肝脏HGF表达的影响。结果 与Oil+PHx组比较,CCl4+PHx组小鼠血清AST、ALT、LDH水平升高,纤维化程度较高,天狼星红及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）染色阳性区域面积增大,α-SMA蛋白表达水平升高;与CCl4...     

肝细胞移植治疗急性肝功能衰竭的免疫排斥研究

目的研究肝细胞腹腔移植治疗急性肝功能衰竭的免疫排斥反应。方法用胶原酶灌注法分离幼猪及BALB/c和C57BL/6小鼠肝细胞;用腹腔注射CCl4的方法建立C57BL/6急性肝功能衰竭模型;将实验动物分为同基因移植组、同种异基因移植组和异种移植组。各组动物肝细胞移植入急性肝功能衰竭小鼠腹腔内,观察受体小鼠存活情况,比较各组动物T细胞亚群、免疫球蛋白水平和细胞因子的变化。结果①受体小鼠存活情况:同基因移植组为8/10,同种异基因移植组为6/10,异种移植组为3/10,同基因移植组和同种异基因移植组受体的生存情况明显好于异种移植组(P<0.05)。②T细胞亚群变化:移植后7 d内,同基因移植组外周血中CD4+和CD8+T细胞均无明显变化,同种异基因移植组CD4+T细胞于移植后3 d时达高峰(P<0.05),而CD8+T细胞7 d内无明显变化,异种移植组CD4+和CD8+T细胞移植后7 d内均明显升高,且于移植后3 d时达高峰(P<0.05)。③免疫球蛋白水平:同基因移植组血清免疫球蛋白IgM和IgG水平在移植后0.5、1和3 d时未见明显变化,同种异基因移植组和异种移植组的IgM在移植后1 d时达高峰(P<0.05),而IgG在移植后3 d时达高峰(P<0.05)。④血清细胞因子水平:移植后7 d,同种异基因移植组和异种移植组的IFN-γ、TNF-α及IL-2血清浓度明显高于同基因移植组(P<0.05);异种移植组的IL-6血清浓度明显高于同基因移植组和同种异基因移植组(P<0.05)。结论无论同种还是异种肝细胞移植,初期均发生了强烈的CD4+及CD8+T细胞参与的细胞免疫和较强体液免疫反应。     

早期效应细胞因子对脐血AC133+细胞表面趋化因子受体和粘附分子的调节作用

目的　探讨不同细胞因子组合对脐血AC133+ 细胞表面趋化因子受体 (CXCR4 )和粘附分子VLA4 (CD4 9d)表达的影响。方法　采用双色直接免疫荧光标记法 ,使用流式细胞仪测定新鲜分离的、不同培养条件下体外培养 7d的脐血AC133+ 细胞表面CXCR4和VLA4 (CD4 9d)的表达情况。结果　 2 6例新鲜脐血AC133+ 细胞中CXCR4的表达率为 (46 .3± 11.5 ) % ;VLA4的表达率为(5 1.2± 17.3) %。在无血清、有细胞因子存在的条件下 ,短期液体扩增培养后 ,脐血AC133+ 细胞中CXCR4和VLA4的表达率发生变化 ,其中在早期效应细胞因子SCF、FL和TPO组合下 ,CXCR4和VLA4表达率为 (6 8.9± 15 .8) %和 (73.6± 19.8) % ,与新鲜脐血比较 ,差异非常显著 ,P <0 .0 1。结论　在体外短期扩增培养过程中 ,早期效应细胞因子能显著上调脐血AC133+ 细胞CXCR4和VLA4的表达 ;用SCF、FL和TPO组合扩增脐血 ,不仅能获得足够数量的造血干 /祖细胞 ,还能增加造血干 /祖细胞的迁移和归巢能力。     

人脐血造血干/祖细胞的磁力搅拌悬浮培养及移植实验

目的 探讨磁搅拌大规模培养体系对人脐血造血祖细胞的扩增效果以及扩增的人造血祖细胞植入动物体内后的造血重建情况.方法 从新鲜抗凝脐血中分离出单个核细胞(MNC),以添加干细胞因子、酪氨酸激酶受体3配基及血小板生成素的无血清培养体系进行培养.静态扩增组的细胞置于T25培养瓶中培养,磁搅拌悬浮扩增组(磁搅拌扩增组)的细胞采用Celstir装置进行培养,培养体系为50～100 ml.培养7 d后进行细胞计数、集落培养检测和细胞表面分子表达的测定.以不进行培养者为对照组.非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠在接受2.5 Gy的亚致死剂量X射线照射后分别从尾静脉输入上述静态扩增组、磁搅拌扩增组和对照组的MNC(5×106个),另设不移植的空白对照组.观察小鼠的存活情况,6周后处死存活小鼠,检测骨髓细胞中CD34+细胞、CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 经过7天的培养,磁搅拌扩增组的造血祖细胞扩增倍数为(2.8±0.45)倍,明显高于静态扩增组的(2.1±0.48)倍(P<0.01).磁搅拌扩增组形成的红系集落、粒-巨噬细胞集落数均明显高于静态扩增组(P<0.05).静态扩增组扩增后的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CD133+细胞含量均高于磁搅拌扩增组(P<0.05),而CD184+细胞和CD62L+细胞含量低于磁搅拌扩增组(P<0.01).移植后6周,对照组、静态扩增组和磁搅拌扩增组分别有3、4、5只小鼠存活,三组间两两比较,6周存活率的差异无统计学意义(P>0.05).存活6周的小鼠,其骨髓中能检人特异性CD34+细胞,以及CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞,也检测到人Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达.结论 磁搅拌培养能大规模扩增脐带血造血祖细胞,扩增的细胞能植入x射线照射的NOD/SCID小鼠,并重建其多系造血.     

肝纤维化大鼠血液微环境对人脐带MSCs向肝细胞分化的影响及机制研究

目的探讨肝纤维化大鼠血液微环境对人脐带MSCs(human umbilical cord MSCs,HUCMSCs)向肝细胞分化的影响及作用机制。方法取成年清洁级雄性SD大鼠18只,体质量(200±20)g;其中12只采用腹腔注射硫代乙酰胺方法制备肝纤维化模型,组织学观察确定模型制备成功后取大鼠全血分离血清;剩余6只正常大鼠同法分离血清。ELISA法检测血清中EGF、b FGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、抑瘤素(oncostatin M,OSM)含量。取第3代HUCMSCs分组培养7 d,其中肝纤维化血清组(A组)、正常血清组(B组)分别以含5 m L/L肝纤维化大鼠血清、正常大鼠血清的DMEM/F12培养基(含10%FBS)培养;对照组(C组)以DMEM/F12培养基(含10%FBS)培养。培养期间采用倒置显微镜观察细胞形态变化;7 d后取各组细胞行免疫荧光检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)表达,Western blot检测肝细胞功能蛋白白蛋白(albumin,ALB)、色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TPH2)、CYP3A4及MAPK/ERK信号通路蛋白(P-ERK)表达,二乙酰肟法测定细胞上清液中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量。结果组织学观察示大鼠肝组织符合纤维化改变,模型制备成功。正常大鼠血清中EGF、OSM含量均高于纤维化大鼠,差异有统计学意义(t=14.989,P=0.000;t=37.172,P=0.000);肝纤维化大鼠血清中HGF含量为(1.03±0.12)ng/m L,正常大鼠血清中未检出;两种血清中均未检出b FGF。诱导培养后,倒置显微镜下观察各组细胞形态均未见明显变化且组间无明显差异。培养7 d时,A组细胞可见AFP、CK18绿色荧光,B、C组染色均为阴性。Western blot检测示A组细胞可表达肝细胞功能蛋白ALB、TPH2及CYP3A4,B、C组均未见上述蛋白表达。各组细胞均可表达P-ERK,其中A组P-ERK蛋白相对表达量显著高于B、C组(P0.05);B、C组间比较差异无统计学意义(P0.05)。A组细胞上清液中BUN含量亦显著高于B、C组(P0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论在肝纤维化条件下,大鼠血液中的HGF水平升高、EGF、OSM水平降低,形成的血液微环境会激活HUCMSCs的MAPK/ERK信号通路,使其向肝细胞分化。     

胚胎干细胞源性肝细胞的获得及体内移植研究

目的 探讨体外定向诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为肝细胞的方法及肝损伤模型肝内移植的可行性.方法 常规培养ES细胞后,继续悬浮培养4 d以形成拟胚体(EBs),转移EBs到铺有明胶的6孔板中贴壁培养,并添加3 mmol/L丁酸钠开始诱导分化,7 d后加入淤胆血清筛选、纯化ES源性肝细胞,分化过程中用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及超微结构的改变;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肝细胞特异性标志基因:白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、α1抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖6磷酸酶(G6P)、酪氨酸转氨酶(TAT)mRNA水平的表达;以荧光示踪剂CFDA-SE标记诱导获得的肝细胞,并移植到肝损伤小鼠肝内,观察移植细胞在肝内的定居、增殖情况.结果 诱导分化过程中,ES细胞形态逐渐出现肝细胞样改变,其超微结构与小鼠肝细胞超微结构十分相似;RT-PCR结果显示,随着诱导时间的推进,标志肝细胞发育过程的ALB、AFP、TTR、AAT、G6P、TAT mRNA顺序表达;肝内移植实验结果显示:ES源性肝细胞可在肝损伤小鼠肝内定居并增殖.结论 丁酸钠联合淤胆血清可以诱导ES细胞分化为肝细胞,ES源性肝细胞肝损伤模型体内移植是可行的,这有可能为细胞移植治疗难治性肝病提供一种新的细胞来源.     

人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.     

半成熟树突状细胞在胚胎干细胞源性肝细胞移植中诱导耐受的研究

目的 在小鼠胚胎干细胞(ESC)源性肝细胞移植中,应用半成熟树突状细胞(smDC)诱导免疫耐受.方法 绿色荧光蛋白(GFP)标记的129小鼠ESC按前期方法向肝细胞诱导分化,129小鼠smDC亦按前期方法由骨髓单核细胞诱导获得.smDC注入BALB/C小鼠3d后,再将ESC分化的肝细胞移植入BALB/C小鼠肝被膜下.检测肝转氨酶、外周血白细胞介素-2(IL)-2和IL-10水平变化,观察移植细胞生长及淋巴细胞浸润情况.结果 移植后7d,smDC组肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)为212.58 U/L,较对照组512.27 U/L明显改善(P＜0.05),7d和14 d外周血IL-10水平较对照组明显升高,而IL-2水平较对照组明显降低(P＜0.05).移植细胞存活率在14、21 d smDC组较对照组明显增高,CD4 +T细胞浸润较对照组明显减轻.结论 在ESC源性肝细胞异基因移植中,smDC预输注可诱导部分免疫耐受,有望作为一种良好的移植耐受原应用于ESC分化细胞移植研究中.     

转染大鼠白细胞介素10基因的骨髓源性肝干细胞移植治疗大鼠肝纤维化

目的 探讨转染大鼠白细胞介素10(IL-10)基因的β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对大鼠肝纤维化的治疗效果.方法 分选Wistar大鼠的β3m-/Thy-1+BDLSC,转染大鼠IL-10基因.Wistar大鼠皮下注射CCl4,制作肝纤维化模型,分为3组:(1)模型组,经大鼠门静脉分支输注无菌生理盐水1 ml;(2)BDSC组,经大鼠门静脉分支输注β2m-/Thy-1+BDLSC悬液1ml(含2×105个细胞);(3)IL-10组,经大鼠门静脉分支输注转染1L-10基因的β2m-/Thy-1+BDLSC悬液1 ml(含2×105个细胞);另以皮下注射橄榄油的Wistar大鼠为对照(正常组).用细胞核染色剂二脒基苯基吲哚(DAPI)标记β2m-/Thy-1+BDLSC,以观察该细胞在肝内的定位情况.观察各组大鼠肝组织病理学改变和胶原的沉积情况,检测其肝功能和凝血功能.结果 大鼠肝组织中可见DAPI标记的β2m-/Thy-1+BDLSC.模型组大鼠的肝组织病理学改变明显,BDLSC组病理学改变有所减轻,IL-10组的组织形态最接近正常组.模型组大鼠肝组织内胶原沉积明显增多,BDLSC组胶原沉积较少,IL-10组胶原沉积明显减少.IL-10组大鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和胆红素总量(TBIL)以及全血凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血激酶时间(APTT)均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05),其中ALT、TBIL、PT和APTT均降至正常组水平,与BDLSC组相比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 转染大鼠IL-10基因的β2m-/Thy-1+BDLSC移植对大鼠肝纤维化有一定的治疗效果.     

紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究

目的:探讨紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及其分子机制。方法:将30只Wistar大鼠随机均分为正常对照组、肝纤维化模型组,肝纤维化模型+紫衫醇组,肝纤维化模型用腹腔注射二甲基亚硝胺每日1次连续7 d诱导,之后,肝纤维化模型+紫衫醇组大鼠给予尾静脉注射紫杉醇液,隔日1次,共3次;实验结束时,处死大鼠观察肝脏病理学和血清学指标变化,及肝组织中肝星状细胞标志物α-SMA的表达。将大鼠肝星状细胞HSC-T6分别用TGF-β1、紫杉醇+TGF-β1处理,以无处理的HSC-T6细胞为对照,分别检测各组细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白的表达。结果:正常对照组肝组织无病理学改变,肝纤维化模型组出现肝纤维化病变,肝纤维化模型+紫杉醇组可见肝组织中度坏死,无明显坏死结节;与正常对照组比较,肝纤维化模型组与肝纤维化模型+紫杉醇组转氨酶、总胆红素(TIBL)、透明质酸(HA)水平均明显升高,白蛋白(ALB)水平明显降低(均P0.05),后者较前者在TBIL、ALB、HA方面有明显改善(均P0.05);正常对照组肝组织无明显α-SMA表达,肝纤维化模型组和与肝纤维化模型+紫杉醇组肝组织均有α-SMA表达,后者的α-SMA阳性细胞数明显少于前者(P0.05);与无处理的HSC-T6细胞比较,TGF-β1与紫杉醇+TGF-β1处理后的HSC-T6细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白均明显上调(均P0.05),后者的上调程度明显低于前者(均P0.05)。结论:紫杉醇可抑制大鼠肝纤维化的产生和发展,机制可能与其抑制肝星状细胞中TGF-β信号通路从而减少肝星状细胞活化有关。     

由脐血单个核细胞和富集的CD34+细胞扩增的造血干/祖细胞的生理功能比较

目的 探讨由脐血单个核细胞(MNC)和富集的CD34+细胞起始扩增所得的造血干/祖细胞在体内植入及造血重建的能力.方法 从人脐血中分离出MNC和CD34+细胞,在体外扩增7 d.将非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠分为四组,在接受亚致死剂量铯源照射后,进行细胞移植,实验A组接受由MNC培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;实验B组接受由富集的CD34+细胞培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;阳性对照组接受从脐血新鲜分离的CD34+细胞和CD34-细胞;阴性对照组不接受细胞移植,仅输注相同体积的IMDM培养基.6周后处死存活的小鼠,取其骨髓、脾脏和外周血细胞,分别进行细胞表型分析、集落和人特异性基因的检测.结果 经过体外扩增,以富集的CD34+细胞起始培养者的细胞总扩增倍数为39.8倍,远高于以MNC为起始细胞者的1.88倍.移植6周后,所有接受细胞移植的小鼠均存活,存活小鼠的骨髓和脾脏细胞中均能检测到人源细胞(CD45+细胞)及人源的各系血细胞,实验A组各类细胞的含量稍高于实验B组,且接受细胞移植小鼠的骨髓和脾脏细胞中可检测出人特异的Alu序列.结论 与从脐血中新鲜分离的细胞相比,扩增后的造血干/祖细胞的体内植入能力有所下降,以MNC起始扩增的造血干/祖细胞体内植入能力优于以富集的CD34+细胞起始扩增者,但二者体内造血重建能力的差异不显著.     

脐血单个核细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨含有细胞因子的无血清培养基对脐血单个核细胞(MNC)体外培养后的扩增情况和用于移植的安全性.方法 从新鲜脐血中分离出的MNC,在含细胞因子的无血清培养体系中培养.分别将培养前和培养第10天时的造血细胞进行细胞计数、细胞活力分析、集落分析、流式细胞仪检测表面标记、彗星试验分析DNA的损伤情况、无菌性分析及移植至NOD/SCID小鼠体内等项研究.结果 经过体外短期培养,脐血中MNC、CD34+、CD133+、CD34+CXCR4+及CD34+ VLA-4+细胞扩增倍数均比培养前增高(P<0.05);半固体培养基可支持多系集落的生长;培养前和培养第10天时脐血细胞DNA损伤率均低于5%;无菌性分析提示细胞未受污染.将体外扩增后的脐血造血细胞移植入NOD/SCID小鼠体内,与新鲜脐血移植相比,小鼠的存活时间及植入能力的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 脐血造血细胞体外扩增是解决脐血造血细胞数量不足的有效方法.脐血造血细胞经短期培养能为造血干细胞移植提供安全而具植入能力的造血细胞.     

肝细胞生长因子对大鼠减体积肝移植术后肝再生的作用

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对大鼠减体积肝移植术后再生的影响。方法建立大鼠减体积(60%)肝移植模型,将大鼠随机分为生理盐水对照组(A组)和肝细胞生长因子治疗组(B组),每组动物60只。受体于术后皮下注射给药(HGF,100mg/kg)每天一次,直至处死。观察术后1、2、3、5、7天受体残肝重/减体积前全肝重,肝细胞有丝分裂指数(MI)、增殖细胞核抗原标记指数(PCNA LI)和溴脱氧核苷尿嘧啶的掺入指数(BrdU LI)以及术后血清丙氨酸氨基转移酶(ATL)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平。结果HGF能显著提高受体肝细胞MI、PCNA LI、BrdU LI及残肝重/减体积前全肝重(P<0.05,P<0.01),两组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平无显著差异(P>0.05)。结论肝细胞生长因子能显著促进大鼠减体积肝移植术后肝组织的再生,而对术后肝脏功能无明显损害作用。     

重组肝细胞生长因子促进大鼠移植肝细胞的再生

目的探讨术后应用重组肝细胞生长因子(r HGF)对大鼠移植肝细胞再生的促进作用。方法采用改良“二袖套法”建立SD大鼠原位部分肝移植模型,受鼠分为实验组和对照组,术后经尾静脉分别给予r HGF和相同体积的生理盐水,2次/d。两个组分别在术后第1、2、4、7d时随机挑取5只大鼠处死,称取移植物湿重,采血检测血清丙氨酸转氨酶及白蛋白,流式细胞仪检测移植肝的增殖活性,免疫组织化学法检测移植肝Ki-67的表达情况。结果术后第1、2d,实验组移植物湿重较对照组同时间段明显增加;术后第4、7d,实验组血清丙氨酸转氨酶水平较对照组同时间段明显降低,而白蛋白水平较对照组同时间段明显增高;术后第2、4d,实验组的移植肝增殖指数和Ki-67表达较对照组高(P<0.05)。结论大鼠部分肝移植后使用r HGF能够明显促进移植肝细胞的再生。     

乌司他丁逆转大鼠肝纤维化的实验研究

目的 探讨乌司他丁对大鼠肝纤维化过程的影响.方法 18只TAA诱导的肝纤维化模型大鼠分为3组:正常大鼠为A组(3只),模型鼠+生理盐水为B组(9只),模型鼠+乌司他丁为C组(9只)并干预3周.对比干预前后大鼠血清中的丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、透明质酸(hyaluronic acid、HA)、层粘连蛋白(laminin,LN)水平变化.病理学检查及免疫组化观察各组大鼠肝形态学变化及转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、caspase-3蛋白表达.结果 C组干预后大鼠肝脏弹性数值及SSS评分与干预前相比显著降低,差异有统计学意义(t=2.472,P＜0.05).C组的ALT、AST、SOD、MDA、HA、LN生化指标均有不同程度的好转(分别F=3.862、5.774、3.442、4.157、4.173、3.674,均P＜0.05).HE及Masson染色可见干预后C组大鼠肝组织有少量炎性细胞浸润,肝细胞坏死灶并未增多,胶原纤维略有增生.C组TGF-β1、caspase-3阳性细胞率明显低于B组大鼠. 结论 乌司他丁对大鼠肝纤维化具有逆转作用,使大鼠肝脏纤维化程度逐渐减轻,减少胶原纤维的沉积,抑制肝细胞炎症.     

小鼠骨髓源性肝干细胞筛选及其分化潜能的研究

目的从骨髓细胞中筛选肝干细胞。方法供体为纯系BALB／C雄性小鼠，从其骨髓细胞中分离CD34^＋Lin^-、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞。受体为35Gy全肝照射预处理的同龄同系BALB／C雌性小鼠，A、B、C、D组分别为CD34^＋Lin、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞移植。术后30d活杀小鼠，取肝作小鼠Y染色体性别决定基因Sry的原位分子杂交和白蛋白的免疫组化染色，镜下观察并记录双阳性细胞数量。结果A、B、C、D组小鼠肝组织中均检测到双阳性细胞，其中C组的双阳性细胞数量显著多于其它各组。结论CD34^＋Lin^-、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞都含有骨髓源性肝干细胞、都有分化形成肝细胞的潜能，但CD117^＋Lin^-细胞分化形成肝细胞潜能最大。     

门静脉输注供者脾细胞诱导的供者特异性免疫低反应性

目的 探讨经门静脉输注供者脾细胞能否诱导皮肤移植小鼠产生供者特异性的免疫低反应性及其可能机制.方法 取Balb/c小鼠,随机分为空白对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液)、受者脾细胞组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞)、供者脾细胞组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞)、空白移植对照组(经小鼠门静脉输注RPMI 1640培养液,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验对照组(经小鼠门静脉输注Balb/c小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)、实验组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C57BL/6小鼠的皮肤)以及第三方移植组(经小鼠门静脉输注C57BL/6小鼠脾细胞,7 d后移植C3H小鼠的皮肤).记录空白移植对照组、实验对照组、实验组和第三方移植组移植皮肤的存活时间,并观察移植皮肤的病理学变化;脾细胞输注后7 d,分别获取空白对照组、受者脾细胞组和供者脾细胞组小鼠的外周血、脾脏和肝脏,用流式细胞仪测定样本中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)的比例.结果 实验组移植皮肤的存活时间为(19.8±4.6)d,明显长于空白移植对照组、实验对照组和第三方移植组,但仍未达到长期存活.皮肤移植后7 d,空白移植对照组和实验对照组的移植皮肤呈现重度急性排斥反应的病理学改变,而实验组移植皮肤呈现中度急性排斥反应的病理学改变.供者脾细胞组外周血、肝脏和脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例明显高于空白对照组和受者脾细胞组.结论 门静脉输注供者脾细胞可特异性地延长供者皮肤移植物的存活时间,减轻移植物的排斥反应,该效应可能与受者体内的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞增加有关.     

开腹手术与射频消融术对原发性肝癌患者肝功能、免疫功能及血清HGF、TGF-β1及IL-17水平的影响

目的探讨开腹手术与射频消融术对原发性肝癌患者肝功能、免疫功能及血清肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF-β1)及白细胞介素-17(IL-17)水平的影响。方法选取2015年2月-2016年2月本院收治的82例原发性肝癌患者为研究对象,依据医师建议及患者自愿原则分为对照组(接受经开腹手术治疗,n=42)和研究组(接受射频消融术治疗,n=40),比较两组治疗效果,观察手术前后两组肝功能指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBi L)]、免疫功能指标[淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)]、血清HGF、TGF-β1、IL-17水平变化及安全性。结果研究组术后2年随访生存率较对照组明显高(P0.05),术前两组ALT、TBi L、AST、CD3+、CD4+、CD8+、HGF、TGF-β1、IL-17相较无明显差异(P0.05);与术前相较,术后两组ALT、TBi L、AST、CD8+、TGF-β1、IL-17明显降低,CD3+、CD4+、HGF明显升高,且术后研究组ALT、TBi L、AST、CD8+、TGF-β1、IL-17较对照组明显低(P0.05),CD3+、HGF较对照组明显高,差异有统计学意义(P0.05);研究组并发症发生率7.50%明显低于对照组28.57%(P0.05)。结论与开腹手术相较,射频消融术治疗原发性肝癌患者的临床疗效优,在改善患者肝功能、免疫功能、调节机体血清相关因子方面的效果更具优势。