不同细胞移植修复兔全层关节软骨缺损的比较研究

目的 :比较软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞对全层关节软骨缺损的修复作用。材料和方法 :取幼兔的软骨细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞 ,共 3种有生成软骨潜力的细胞进行体外分离培养 ;以聚乳酸 (PLA)为载体 ,将培养的原代细胞植入PLA支架上 ,形成细胞 -PLA复合物。于 2 8只成年新西兰大白兔的股骨滑车关节面上造成直径 4 5mm、深 3 0mm的全层关节软骨缺损 ,将 3种细胞 -PLA复合物分别植入关节软骨缺损处。植入细胞 -PLA复合物为实验组 ,单纯植入PLA支架为对照组。术后 6周、12周观察缺损修复情况及新生组织类型。结果 :软骨细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨部分重建 ;细胞排列紊乱。骨髓基质细胞移植组为软骨样组织修复 ,分界不明显 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阳性 ;软骨下骨重建良好 ,软骨下潮线恢复 ;细胞排列趋于正常。成纤维细胞移植组为纤维组织修复 ,甲苯胺兰及Ⅱ型胶原染色阴性 ;软骨下潮线消失。对照组为纤维组织修复。结论 :软骨细胞、骨髓基质细胞移植修复软骨缺损明显优于成纤维细胞及对照组。骨髓基质细胞与软骨细胞移植组的修复结果无统计学差异 ,但骨髓基质细胞修复组织的细胞排列有序 ,软骨下骨重建良好 ,与周围组织融合密切 ,更接近正?     

转化生长因子β1联合软骨源性形态发生蛋白-2体外诱导成肌细胞向软骨细胞的分化

目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)联合软骨源性形态发生蛋白-2(CDMP-2)体外诱导犬成肌细胞向软骨细胞表型定向分化的可行性。方法:取成年比格犬大腿股直肌肌肉,以机械分解法与二步酶消化法分离获得成肌细胞,取第4代成肌细胞,以2.0×104细胞/cm2的密度接种于24孔培养板,使用含CDMP-2和(或)TGF-β1的完全培养液诱导分化成肌细胞,观察细胞生长情况。诱导14 d后获取细胞,进行HE染色、甲苯胺蓝染色,观察细胞形态及胞内高硫酸化的蛋白聚糖变化。免疫细胞化学染色检测II型胶原蛋白着色情况。RT-PCR检测I型、II型胶原蛋白、aggrecan及Sox9 mRNA表达。阿尔新蓝法定量检测细胞糖胺聚糖(GAG)含量。结果:3个加入细胞因子的实验组成肌细胞形态由长梭形向多角形、类圆形转变;HE染色、甲苯胺蓝染色和软骨特异性I型和Ⅱ型胶原免疫组化法检测及RT-PCR检测中,实验组均有不同程度的阳性表达;TGF-β1与CDMP-2联合应用组糖胺聚糖含量明显高于其他三组(P<0.05)。结论:CDMP-2和TGF-β1可以单独诱导高密度单层培养的犬成肌细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,并且CDMP-2和TGF-β1有协同作用。     

组织工程重建兔颞下颌关节盘软骨

目的 应用组织工程学方法重建颞下颌关节盘软骨。方法 分离6只日本大耳白兔髁状突软骨细胞。进行细胞的微载体大规模扩增,将扩增后的软骨细胞接种于组织引导再生胶原膜,体外适当培养后植入4只同种成年兔皮下,植入后12周,对所获组织进行组织形态学观察。结果 髁状[突软骨细胞在胶原膜内生长良好,植入动物体内12周后可形成乳白色类软骨样组织,其表面光滑,有弹性。甲苯胺蓝染色,细胞周围基质呈异染性。结论 应用胶原膜结合软骨细胞共同培养,可形成软骨样组织,该方法将有可能成为软骨缺损及关节盘破损修复的有途径。     

股骨外髁髁间侧壁软骨组织学结构特点及其临床意义

目的 :观察分析成人股骨外髁髁间侧壁软骨组织结构特点。方法 :1 4例患者行膝前交叉韧带重建术、髁间窝成形时取股骨外髁髁间侧壁软骨标本进行HE、甲苯胺蓝染色 ,分析组织学结构。结果 :浅表层软骨细胞伸长且长轴与关节表面平行 ,甲苯胺蓝染色淡染或失染。中间层较宽 ,含有较多随机分布的细胞 ;软骨细胞外观近似圆形 ,排列较散在 ,无明显方向一致性 ,细胞分布不均匀。深层软骨细胞呈球形 ,柱状层不明显 ,或具有不典型柱状层。组织HE染色“潮线”较完整。结论 :股骨外髁髁间侧壁软骨因其解剖位置特殊 ,在组织结构上虽有一般软骨的共性 ,但不同于负重区软骨 ,有细胞散在 ,方向性不明显 ,并且不具备典型柱状层的特性     

组织工程软骨移植物修复兔关节软骨缺损

目的　观察组织工程软骨移植物修复兔关节软骨缺损的效果。　方法　经软骨起源诱导后的兔骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),与牛Ⅰ型胶原及人纤维蛋白相混合制成组织工程软骨移植物。60只5个月龄的日本大耳白兔均分为软骨移植物组、单纯载体对照组和空白对照组,观察各组修复兔股骨髁关节软骨全层缺损的效果。　结果　软骨移植物组12周时已形成正常厚度的软骨层及完整的软骨下骨板,O'drilscoll组织学评分18.22±2.45,Ⅱ型胶原含量97.9%,甲苯胺蓝变色反应表明其与周围正常软骨无明显区别,为透明软骨组织修复。而对照组12周时为纤维软骨修复,后期为纤维组织和板层骨修复。　结论　该组织工程软骨移植物作为软骨移植的替代物是可行的。     

软骨细胞在微载体中的培养和快速扩增

目的：探索在短期内获得大量成活率高、分化良好的兔关节软骨细胞的方法,方法：应用胰蛋白酶、胶酶消化的方法从新生新西兰兔关节软骨处分离、培养软骨细胞,并将获得的软骨细胞在旋转生物反应应（RCCS）内应用Cytodex-3微载体进行培养。应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。结果：并节软骨细胞可快速贴附于Cytodex-3微载体表面,细胞伸展后生长加速,到培养后期,细胞密度可达最初接种的20倍。在微载体上收获的软骨细胞Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论：微载体细胞培养技术是一种简便、快速的体外细胞扩增方法,可为构体建组织工程化人工软骨提供大量软骨软件。     

猪腹膜脱细胞基质联合微骨折技术修复兔膝关节软骨缺损

目的:检测猪腹膜脱细胞基质(pig peritoneum-derived acellular matrix,PPAM)支架材料联合微骨折修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法:采用CCK-8 Kit测定SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)在PPAM支架上的生长状态,Live/Dead染色观察细胞在PPAM支架上的活性。用直径4mm环钻造成深度约1.5 mm的新西兰大白兔膝关节软骨缺损,微骨折术后将PPAM支架植入软骨缺损处,单纯微骨折技术(Microfracture,MF)作为对照组,分别在第6周、12周和24周取材。大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色和II型胶原(COL II)免疫组化染色检测软骨缺损修复的效果。结果:CCK-8 Kit和Live/Dead染色结果显示PPAM支架支持细胞生长和增殖,无细胞毒性。大体观察和组织学检测显示PPAM联合MF修复软骨缺损能促进软骨缺损填充组织的质量,组织学评分优于单纯MF组。结论:PPAM支架是一种有良好生物相容性的天然材料来源组织工程材料,联合MF技术能促进关节软骨缺损的修复。     

硅橡胶植入对关节软骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的观察植入硅橡胶对兔关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原合成的影响.方法18只成年新西兰大白兔,每只动物右膝为实验组,在膝关节滑车处植入硅橡胶;左膝为对照组,膝关节滑车处造成关节软骨缺损后不植入硅橡胶.分别于术后4周、24周和48周取材,采用原位杂交的方法观察关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,同时运用免疫组织化学的方法观察关节软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白的合成.结果实验组中关节软骨可见Ⅱ型前胶原mRNA和胶原蛋白的稳定表达.Ⅰ型前胶原mRNA从术后4周起即有表达,且随时间延长而表达增加.但Ⅰ型胶原染色仅在24周时方开始呈现阳性.Ⅲ型前胶原的mRNA则在各期均未探测到,但从24周起Ⅲ型胶原染色呈阳性.对照组关节软骨在术后4周时即可见到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原蛋白同时表达,且对照组中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原蛋白表达均呈减少趋势.结论(1)前胶原mRNA的表达早于胶原分泌.Ⅰ型前胶原mRNA表达在实验组中比对照组晚,而且实验组中Ⅰ型前胶原mRNA的表达时间较长,容易观察到阳性的表达信号,所以Ⅰ型前胶原mRNA可以成为早期骨关节炎(OA)的分子标志物.(2)Ⅲ型前胶原mRNA由于表达时间可能较短,所以即使在实验组有Ⅲ型胶原蛋白分泌,但不易查到有Ⅲ型前胶原mRNA的表达,因此Ⅲ型前胶原mRNA不是一个合适的早期OA的分子标志物.(3)硅橡胶植入对关节软骨的胶原合成有一定影响,但对关节软骨的影响小于对照组.硅橡胶植入修补关节软骨缺损可延缓骨关节炎的发病过程.     

运用双重免疫组织化学方法研究骨性关节炎关节软骨细胞的胶原表型

目的 :研究原发性骨性关节炎 (osteoarthritis,OA)关节软骨中软骨细胞的胶原表型。方法 :运用抗Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅹ型胶原单克隆抗体 ,对OA关节软骨标本分别进行Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原双重免疫组织化学染色。结果 :在原发性OA关节软骨的深层和钙化层软骨细胞中 ,存在Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原的共同分布现象。同一个簇聚软骨细胞团中不同细胞的胶原表型也各不相同。结论 :原发性OA关节软骨细胞在疾病环境中发生进一步分化 ,在不同的分化阶段细胞的胶原表型不同 ,其中早期肥大软骨细胞能够同时合成Ⅹ型和Ⅱ型胶原以及Ⅹ型和Ⅲ型胶原。     

细胞学方法促进腱骨愈合研究进展

<正>正常的腱骨连接界面是一个逐渐从软组织向骨转化的过渡区域,该区域结构复杂,包含四层组织结构:纤维结缔组织、非钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨、骨组织[1]。它们的组成成分各不相同,纤维结缔组织层主要包含I型胶原,非钙化的纤维软骨层则主要包含了II、III型胶原,钙化的纤维软骨层包含了II、X型胶原,而骨组织部分仅仅包含了I型胶原[2,3,4]。这种结构有传递、缓冲应力的作用,还可以在肌腱修复、胶原重塑中起到     

Osteochondritis dissecans (OCD), an endoplasmic reticulum storage disease?: a morphological and molecular study of OCD fragments

Osteochondritis dissecans (OCD) fragments, cartilage and blood from four patients were used for morphological and molecular analysis. Controls included articular cartilage and blood samples from healthy individuals. Light microscopy and transmission electron microscopy (TEM) showed abnormalities in chondrocytes and extracellular matrix of cartilage from OCD patients. Abnormal type II collagen heterofibrils in “bundles” and chondrocytes with abnormal accumulation of matrix proteins in distended rough endoplasmic reticulum were typical findings. Further, Von Kossa staining and TEM showed empty lacunae close to mineralized “islands” in the cartilage and hypertrophic chondrocytes containing accumulated matrix proteins. Immunostaining revealed: (1) that types I, II, VI and X collagens and aggrecans were deposited intracellulary and (2) co‐localization within the islands of types I, II, X collagens and aggrecan indicating that hypertrophic chondrocytes express a phenotype of bone cells during endochondral ossification. Types I, VI and X collagens were also present across the entire dissecates suggesting that chondrocytes were dedifferentiated. DNA sequencings were non‐conclusive, only single nucleotide polymorphism was found within the COL2A1 gene for one patient. We suggest that OCD lesions are caused by an alteration in chondrocyte matrix synthesis causing an endoplasmic reticulum storage disease phenotype, which disturbs or abrupts endochondral ossification.     

髌骨关节软骨体视学研究

采用体视学的方法，测量家兔髌骨软骨负重区的软骨体视学变化，包括软骨细胞数、体密度、面密度、比表面等各项指标。利用图象分析技术进行关节定量化的形态学分析，对于研究关节软骨损伤，修复过程及软骨疾病的发病原理均有重要意义。实验结果表明，透明软骨与钙化软骨具有显著差别。透明软骨除单个细胞面积数值较小外，其体密度、面密度、数密度和比表面均较钙化软骨的数值为高。透明软骨细胞核的体密度和面密度亦高于钙化软骨细胞核。这些数据对研究关节软骨功能和病理变化有重要意义。     

关节软骨表层组织的免疫防护作用

文中的实验采用免疫荧光组织学方法观察到正常的关节软骨表层组织可阻止抗Ⅱ型胶原抗体侵入软骨深部组织,防止抗体与软骨细胞结合,具有免疫防护作用。     

雌激素对软骨细胞胶原表型表达的影响

目的 :观察雌激素对体外培养兔关节软骨细胞胶原表型表达的影响。方法 :体外培养雌兔关节软骨细胞 ,随机分为A、B两组 ,A组中加入 1 7β -雌二醇 0mol/L、1 0 - 6 mol/L、1 0 - 7mol/L、1 0 - 8mol/L、1 0 - 9mol/L、1 0 - 10 mol/L、1 0 - 11mol/L、1 0 - 12 mol/L干预 72小时 ;B组先用 1 0ng/mlIL - 1 β干预 2 4小时 ,随后分别加入 0mol/L、1 0 - 6 mol/L～ 1 0 - 12 mol/L 1 7β -雌二醇作用 72小时。采用RT-PCR方法观察软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达。结果 :1 0 - 6 mol/L雌二醇或单用IL - 1 β均抑制正常软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达 ,低浓度雌二醇 (1 0 - 11、1 0 - 12 mol/L)能够对抗IL - 1 β的抑制作用 ;所有软骨细胞均未表达Ⅲ型胶原mRNA ;几乎所有浓度雌二醇 (1 0 - 12 mol/L除外 )均诱导软骨细胞表达Ⅰ型胶原。结论 :雌激素对关节软骨细胞胶原表型表达的调控作用随其浓度变化而不同。对变性软骨细胞而言 ,低于生理浓度的雌激素 (1 0 - 12 mol/L)对维持其胶原表型最适宜。     

Membrane-seeded autologous chondrocytes: cell viability and characterization at surgery

The implantation of chondrocytes, seeded on matrices such as hyaluronic acid or collagen membranes, is a method that is being widely used for the treatment of chondral defects. The aim of the present study was to evaluate the distribution, viability and phenotype expression of the cells seeded on a collagen membrane just at the time of the implantation. Twelve patients who were suffering from articular cartilage lesions were treated by the MACI^® procedure. The residual part of each membrane was tested by colorimetric assay (MTT) and histochemical and ultrastructural analyses were carried out. In all of the samples a large number of viable cells, quite homogenously distributed, was detected. The cells expressed the markers of the differentiated hyaline chondrocytes. These data reassure in that the MACI procedure provides a suitable engineered tissue for cartilage repair, in line with the clinical evidences emerging in the literature.     

Sonographic evaluation of apophyseal ossification of the iliac crest in forensic age diagnostics in living individuals

Due to the requirement to minimise exposure to radiation, it is desirable to develop non-ionising imaging procedures for the analysis of skeletal maturation for forensic age diagnostics in living individuals. The present pilot study analyses the applicability of ultrasound examinations for the evaluation of apophyseal ossification of the iliac crest. With reference to the sonographic staging of clavicular ossification, the maturation stages of the iliac crest apophysis of 23 male and 16 female subjects, aged 11–20 years, were determined. Ossification stage I occurred in the male subjects at a minimum age of 15.7 years. Ossification stage II was diagnosed in boys at a minimum age of 14.1 years and in girls at a minimum age of 11.7 years. The earliest observation of ossification stage III was at a chronological age of 16.2 years in males and 15.2 years in females. The earliest age of occurrence of ossification stage IV was at least 18.0 years in male test persons and at least 17.1 years in female test persons. The results obtained should be reassessed in a larger number of cases. It is to be expected that sonographic examination of the iliac crest apophysis will become established as a valid and efficient method for forensic age diagnostics in living individuals.     

移植基质诱导的自体软骨细胞修复关节软骨缺损临床研究

 目的 探讨基质诱导的自体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的方法与疗效.方法 2004年11月～2006年11月,对7例膝关节软骨炎患者行关节镜取软骨、基质诱导自体软骨细胞移植(Matrix-induced Autologous chondrocyte implantation,MACI)膜植入术.对患者行MRI检查确定损伤位置,并进行IKDC2000评分.术后按照特定的康复计划进行循序渐进的功能锻炼.结果 随访时间6个月到24个月.术后半年多数患者各项症状逐渐消失,IKDC2000评分大部分增高.复查MRI和关节镜,显示原来缺损的关节软骨已基本修复,并伴有软骨下骨的修复.结论 与传统自体软骨细胞移植(Autologous chondrocyte implantation,ACI)技术相比,利用MACI技术修复软骨缺损具有术后恢复时间短、操作简便、创伤小、生成更多透明软骨等优点,具有良好的应用前景.