牛心包脱细胞支架的制备研究

组织工程支架材料是构建组织工程器官或组织的重要基础,天然脱细胞基质由于具有其优良特性而成为理想的支架材料。本研究采用胰酶去污剂法、冻融去污剂24 h法、冻融去污剂48 h法、冻融核酸酶法和去污剂核酸酶法等5种方法对牛心包组织进行脱细胞处理。通过HE染色、扫描电镜观察、含水量检测、力学检测、DNA含量检测和细胞毒性试验,判断不同脱细胞方法的脱细胞效果及其对牛心包基质的影响,从而筛选出对牛心包进行脱细胞的最佳方法。结果显示冻融后去污剂24 h法可以完全脱除牛心包的细胞成分,同时细胞外基质和力学特性保持完好,细胞毒性低,且经济实惠,是制备牛心包脱细胞支架的较好方法。     

动物血管脱细胞方法及细胞外基质材料评价研究

采用独立设计的反复冻融方法,去除兔颈总动脉中的血管细胞,对所获得的细胞外基质进行组织、生化、力学等分析。在分离兔颈总动脉后,首先用低渗缓冲液处理,然后经低温反复冻融,最后用非离子型去污剂处理。所得的支架行组织染色和扫描电镜分析,显示基质的微观结构;荧光染色和基因组DNAPCR分析,检测细胞DNA残留;分别行羟脯氨酸定量分析和轴向拉伸强度分析,检测胶原蛋白和血管生物力学性能的变化;支架没有明显的细胞毒性,溶血率低于医用材料的标准;支架随时间缓慢降解。种植兔的骨髓干细胞,研究细胞在支架上的粘附生长能力。应用本方法能彻底去除血管细胞,没有细胞碎片和DNA的残留,并保留了较完整的细胞外基质和力学性能,具有开放的大孔径结构,细胞生物相容性好,是一种理想的组织工程血管支架材料。     

新型脱细胞动脉基质的制备及理化性能评估

目的探索新型脱细胞动脉基质的制备方法,并分析评估其各项理化性能。方法采用自主设计的三联脱细胞程序,逐步去除动脉血管中的细胞和抗原成分。通过甲苯胺蓝、HE及天狼猩红染色和羟脯氨酸定量分析,对比脱细胞前后血管基质成分与天然半月板之间的差异;并采用Hoechst33258荧光染色法观察脱细胞前后动脉中DNA残留情况;通过MTT法考察材料经脱细胞程序后的毒性强弱以及对细胞活性的影响;将兔半月板细胞接种到脱细胞血管基质后培养,观察两者的相容性。结果三联脱细胞方法制备的牛大动脉基质的组织学染色结果与正常半月板类似,进一步胶原定量证实,材料经脱细胞后胶原含量无明显统计学差异;通过Hoechst33258染色,未发现血管基质中细胞核和DNA残留;甲苯胺蓝及天狼猩红染色证实脱细胞血管基质支架可以很好地保留胶原成分;MTT结果显示脱细胞动脉基质无细胞毒性,具有良好的生物相容性。半月板细胞接种材料后扫描电镜结果显示,脱细胞血管基质能很好促进细胞黏附,并诱导细胞的增殖。结论自主设计的脱细胞程序能完全去除主要抗原成分,无DNA及细胞碎片的残留,并保留了大部分细胞外基质成分、完整组织结构和良好的力学性能,同时具有良好的细胞生物相容性。对比性分析研究得出,在结构和成分上,脱细胞血管基质与半月板具有高度相似性,是未来非常有应用潜力的组织工程半月板支架之一。     

海藻糖对大鼠肾脏冻融法脱细胞效果的影响

目的应用海藻糖溶液辅助冻融法脱细胞获得脱细胞支架,优化大鼠肾脏冻融脱细胞工艺。方法首先采用不同浓度的海藻糖溶液对大鼠肾脏进行预处理,放入-20℃环境下进行冷冻,12 h后在37℃的温水中进行水浴复温;然后采用Triton X-100以04 mL最后通过血管网络CT三维重构、染色切片、蛋白质定量检测以及力学性能检测等手段评估所得大鼠脱细胞肾脏支架,同时与新鲜组做对比。结果未添加海藻糖实验组血管网络损伤较大,洗脱效果一般,无法制取有效的脱细胞支架。添加不同浓度海藻糖实验组的血管网络也均有一定的损伤。但5%海藻糖组保留最为完整,能够为脱细胞支架提供良好的血管网络,细胞外基质保留完整且洗脱细胞效果良好。结论在一定浓度下海藻糖能够更好地辅助冻融法脱细胞获得更优大鼠肾脏脱细胞支架,这为下一步研究冻融脱细胞获取脱细胞肾脏支架提供了重要的实验依据。     

低渗冻融联合生物酶法制备组织工程化静脉瓣脱细胞支架

目的:采用低渗冻融联合生物酶法制备组织工程化静脉瓣脱细胞支架,并与先前方法制备的静脉瓣脱细胞支架比较,以期获得一种性能较好的带瓣静脉脱细胞支架材料.方法:手术获得Beagle犬带瓣静脉分为4组,对照组、脱氧胆酸钠组、Triton组和冻融+生物酶组.处理后对各组标本行H-E染色,透射电镜观察,DAPI荧光染色,细胞相容性测试等观察.结果:3种脱细胞方法均能彻底去除细胞,DAPI荧光检测显示各组支架材料均无DNA成分残留;H-E染色及透射电镜显示,冻融+生物酶组胶原纤维排列整齐,未见明显的胶原纤维结构改变,其他2组可见胶原纤维断裂及结构紊乱现象;与其他2组脱细胞支架材料相比,冻融+生物酶组的组织细胞相容性好,可见内皮祖细胞在支架材料上生长良好.结论:结合渗透压改变的反复冻融加生物酶法,既可以较彻底除去带瓣膜静脉细胞成分,又保留了较完整的细胞外基质结构,具有良好的组织和细胞相容性,是较理想的带瓣膜静脉脱细胞支架制备方法.     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架:生物相容性及力学性能评价(英文)

背景:组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架。猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用。目的:应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架。方法:对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能。将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性。结果与结论:用1%的TritonX-100溶液处理猪主动脉84h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120℃热交联处理12h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70MPa。在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构。表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性。     

灌注法制备离体大鼠心脏脱细胞基质

目的 探索制备离体大鼠心脏脱细胞生物支架材料的新方法,为心脏组织工程研究提供三维立体天然支架.方法 取30只成年SD大鼠心脏,运用冻融加化学萃取的组织工程学方法 (胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100)处理离体大鼠心脏,同时观察心脏大体形态及颜色变化,并对脱细胞支架进行基因组DNA分析;HE染色,免疫荧光法,扫描和透射电镜进一步检测鉴定脱细胞支架的生物学特征.结果 心脏脱细胞支架外观透明,包膜完整,维持心脏三维立体结构,肉眼可见心脏内脉管系统;脱细胞支架DNA残留量不及对照组的3%;HE染色、扫描和透射电镜结果 显示,心脏脱细胞生物支架去细胞彻底,细胞外基质网状结构保留完整;免疫荧光结果 表明,胶原、弹性蛋白等细胞外支架成分保留较完整,未见明显细胞核成分残留.结论 运用冻融加化学萃取法所制备的离体心脏脱细胞生物支架去细胞彻底,细胞外基质保留较完整,是较为理想的心脏三维立体生物支架材料.     

生物交联剂京尼平交联牛心包生物支架材料的性能

脱细胞牛心包膜因其具有优良特性而成为组织工程生物瓣膜中理想的支架材料.采用冻融+表面活性剂法对牛心包组织进行脱细胞处理后,用戊二醛或京尼平对其进行表面修饰固定.通过HE染色及扫描电镜观察脱细胞效果,并对交联组织进行厚度检测、含水量和接触角测试、力学检测、交联指数和差示扫描量热(DSC)测定、体外降解、溶血试验以及细胞毒性试验,判断两种交联方法对脱细胞牛心包基质的影响,从而选择出交联脱细胞组织的最好方法.结果显示,冻融+表面活性剂法脱除细胞彻底,戊二醛或京尼平交联后组织厚度明显增加分别约20%,25%,亲水性良好,力学特性稳定,交联指数都高达90%,且28 d降解率分别为5%和3%,交联后组织稳定性高.但京尼平组溶血率(0.37%)远小于戊二醛组溶血率(13.77%),且细胞毒性很低.作为瓣膜组织工程支架材料,京尼平交联脱细胞牛心包膜比戊二醛交联效果具有更好生物相容性,交联效果好,是较好的交联方法.     

比较两种方法制备脱细胞小血管支架

目的:比较0.5%Triton X-100 0.05%NH4OH和酶法制备脱细胞小血管支架的效果.方法:分别用含0.5%Triton X-100 0.05%NH4OH处理3 d或1.0H Triton X-100 0.125%胰蛋白酶 Dnase Rnase孵育48 h,脱去犬股静脉中的细胞成分,50Co辐照消毒,血清浸泡24 h,将平滑肌细胞和内皮细胞接种到脱细胞支架中;进行H-E染色、胶原纤维和弹力纤维染色,扫描电镜观察及力学检测.结果:0.5%Triton X-100 0.05%NH4OH法完全地脱去了血管细胞;细胞外基质较完整地保留下来,其形态结构与脱细胞前无明显改变;见种植细胞在支架内生长良好,连成片,支架具有良好的生物相容性;力学结果显示其弹性回复率和最大断裂强度好于酶组.结论:两种方法比较,0.5%Triton X-100 0.05%NH4OH法简便易行,成本低,脱细胞效果好,组织相容性佳,对力学性状影响小,是比较理想的制备脱细胞小血管支架的方法.     

骨膜去细胞生物支架的制备和鉴定

目的 制备兔骨膜去细胞生物支架,为骨缺损、骨不愈的组织工程研究提供天然的生物支架材料。 方法 取健康新西兰大白兔,游离双侧胫骨近端内侧骨膜,通过物理冻融（-80℃,24h）、去污剂洗脱（triton-X 100、SDS）和酶消化（DNA酶、RNA酶）获取骨膜去细胞生物支架。通过HE染色、DAPI染色、琼脂糖电泳和基因组DNA定量分析(n=5)测定细胞结构及DNA成分残留;Masson染色和羟脯氨酸测定法(n=6)定性定量检测骨膜细胞外基质的主要成分（胶原）的保留情况;扫描电子显微镜下观察骨膜去细胞生物支架的表面微结构;CCK8法检测支架浸提液毒性;皮下包埋实验(n=4)观察该支架的免疫排斥反应。 结果 HE染色和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色表明去细胞支架无残留细胞;琼脂糖电泳未见明显DNA条带;DNA定量检测显示组织去细胞率达95%以上;Masson染色及羟脯氨酸测定表明去细胞支架胶原成分被保留;扫描电子显微镜下细胞外基质呈现三维网状疏松结构;不同体积分数的浸提液对骨膜细胞的增殖与对照组（普通培养基）比较无明显抑制作用（P＞0.05）;异体皮下包埋实验显示,该去细胞支架免疫排斥反应不明显。 结论 运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜去细胞生物支架细胞去除彻底,细胞外基质的结构及主要成分保留完好,生物相容性良好。     

人包皮组织脱细胞基质的制备与生物相容性

目的 制备人包皮组织脱细胞基质移植物（AMGs）,探讨其浸提液对兔尿道黏膜细胞毒性。方法 制备人包皮组织脱细胞基质后,通过Masson 染色观察脱细胞后基质的表征,扫描电子显微镜观察其孔径大小。体外培养尿道黏膜细胞,采用免疫荧光鉴定其AE3表达。 尿道黏膜细胞与AMGs 基质浸提液体外共培养,MTT法检测 AMGs 浸提液对 尿道黏膜细胞毒性。结果 Masson 染色显示细胞去除干净,只有胶原蛋白构成的支架,扫描电镜显示支架的孔径为20～50 μm,分布均匀,形态良好。适当浓度的AMGs 基质浸提液对尿道黏膜细胞无明显毒性。结论 人包皮组织脱细胞基质为理想的 AMGs 支架材料,制备的 AMGs 材料细胞毒性小,有一定的实用价值。     

猪胆总管脱细胞支架的制备及组织学评价

目的 用不同的脱细胞方法对猪胆总管进行处理,比较脱细胞前后的组织学变化,筛选适宜的脱细胞方法,为组织工程胆管支架材料的应用提供理论依据。 方法 30例猪胆总管随机分为5组：对照组（A组）：0.05% 胰蛋白酶+核酸酶（B组）：0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）+核酸酶（C组）：1.0% Triton X-100+核酸酶（D组）：1.0% Triton X-100+0.1% SDS +核酸酶（E组）。通过HE染色光学显微镜下观察脱细胞基质的组织结构和细胞残留情况;用紫外分光光度法检测脱细胞基质的DNA含量,计算脱细胞率。结果 脱细胞B组有少量细胞残留,纤维有损伤;脱细胞C组、D组、E组的细胞均被去除,纤维无明显损伤。A组的DNA含量为（71.24 ± 2.56）μg /100 mg。B、C、Ｄ、Ｅ4个脱细胞组的DNA含量与A组的差异有统计学意义（F =15.29, P<0.01）,均有明显的脱细胞效果（P<0.01）。Ｂ组的脱细胞率为77.03%,比C组、Ｄ组、Ｅ组的脱细胞效果稍差（P<0.05）,Ｅ组的脱细胞率高达99.03%。 结论 应用1.0% Triton X-100+0.1% SDS +核酸酶的脱细胞效果好,能更好地降低胆总管的免疫原性,是一种比较理想的猪胆总管脱细胞方法。     

版纳小型猪脱细胞骨基质的抗原检测及力学性状

制备版纳小型猪脱细胞骨基质，进行组织学和生物力学观察，并进行了异种抗原a—gal表达的检测，结果表明经脱细胞处理后，去除了骨组织的细胞成分，同时消除了抗原性，力学性质上与正常对照无明显差异，可以作为一种合适的骨组织工程支架材料。     

异种脱细胞角膜基质囊袋移植的生物相容性研究

目的探讨脱细胞猪角膜基质移植入兔角膜囊袋后的生物学反应。方法猪角膜通过不同方式去除细胞及免疫源性成分，保留角膜组织基质的弹力纤维及胶原纤维，将其切取为直径为4mm的植片，植入兔角膜囊袋内，在不同时间点观察生物材料在角膜内生物学反应。结果材料植入兔角膜囊袋3个月，生物相容性良好，材料逐渐降解，材料内有胶原和角膜基质细胞长人。结论新型可降解角膜基质材料植入后未见兔角膜有明显的炎症反应，材料的组织相容性好，可作为组织工程角膜的支架材料。     

冻干韧带脱细胞支架材料的生物相容性及优势

背景：韧带脱细胞基质是通过各种脱细胞方法将韧带组织内的细胞成分清除,降低免疫原性,同时对纤维支架结构破坏轻微,保留了细胞外基质的机械性能。 目的：评价冻干兔髌韧带脱细胞支架的生物相容性及优势。 方法：取兔髌韧带,利用1%脱氧胆酸钠行脱细胞处理,制备冻干和未冻干脱细胞韧带支架。 结果与结论：冻干韧带脱细胞支架保持了冻干前的胶原结构与力学特征,无细胞残留,其浸提液对细胞生长无抑制作用,无全身急性毒性反应,无热原存在,且原发刺激指数为0分,皮内刺激实验阴性。体内埋植实验显示冻干韧带脱细胞支架表现为免疫原性小,炎症反应轻的特点。说明冻干韧带脱细胞支架具有较好的生物相容性,且制作简单,便于消毒、包装、保存。     

大鼠胰腺去细胞天然支架生物相容性的鉴定

目的通过离体灌注化学去垢剂的方法制备大鼠胰腺去细胞天然生物支架,并对支架的完整性、生物相容性进行检验。方法健康成年SD大鼠30只,分别经胆管与血管两条途径灌注十二烷基硫酸钠和曲亚通X-100等药品洗脱,获取胰腺去细胞生物支架。通过HE染色、扫描电子显微镜和透射电子显微镜等观察细胞残留于去细胞支架的生物学特性,分光光度计法鉴定残留去垢剂量,酶联免疫吸附剂测定法测定残留支架蛋白含量及生长因子,并用腹壁与皮下包埋实验检验其炎症反应,MTT法测定支架细胞毒性,内皮细胞共培养测定支架生物相容性。结果 HE染色、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察均表明去细胞支架无细胞残留,细胞外支架连续性完好,脉管支架保存完整;药物残留小于规定标准;细胞外支架生长因子及支架蛋白存留量等指标上血管组均优于胆管组;腹壁与皮下包埋实验显示,去细胞支架炎性反应较对照组明显减轻;MTT法显示无细胞毒性;内皮细胞共培养有黏附趋势。结论使用两种灌注法制备胰腺去细胞生物支架,均可将细胞去除彻底,支架生物相容性好。但就血管组细胞外支架保留完整性,生长因子保留更多,则血管灌注途径优于胆管灌注途径。     

脊髓脱细胞支架对大鼠脊髓缺损修复的影响

目的 用振荡法制备脊髓脱细胞支架修复同种异体大鼠脊髓缺损,观察术后大鼠行为学及组织再生情况。为脊髓缺损后修复提供新的研究思路。方法 将30只SD大鼠脊髓分别用50 ml 3%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和2%脱氧胆酸钠溶液在摇床上做振荡处理,对比处理前后细胞残留情况及组织的空间结构,了解支架本身的组织构成。将90只SD大鼠随机分成空白对照组、单纯脊髓缺损组和支架移植组。切除单纯脊髓缺损组和支架移植组大鼠腰椎9～10节段,移植脱细胞支架至支架移植组大鼠。术后饲养12周,期间进行行为学评分观察,分别在4、8及12周时取大鼠损伤部位的脊髓进行HE染色及神经再生相关蛋白免疫荧光检测。结果 通过HE、Masson、甲苯胺蓝染色显示,脱细胞处理后的脊髓脱细胞支架上神经细胞及轴突彻底清除,保留了脊髓细胞外基质。扫描电子显微镜观察发现,支架保留一定多孔网状支架结构。脱细胞支架在体实验中,Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分显示,移植有脱细胞支架的大鼠后肢运动功能恢复优于单纯损伤组大鼠。组织学HE染色显示,脱细胞支架能够填补缺损的脊髓节段,加快损伤脊髓的修复过程。免疫荧光显示,支架移植组大鼠的损伤部位有一定轴突再生。结论 脊髓脱细胞支架保留了细胞外基质并具有一定空间结构,能够一定程度加快脊髓缺损修复,对神经再生具有一定的促进作用。     

Study on the Preparation of Decellularized Scaffold of Bovine Pericardium

Objective: To search for the best procedure on preparation of acellular bovine pericardium,so to provide scaffolds for constructing tissue-engineering Methods:The bovine pericardiums were treated with 5 methods,which were divided into 6 groups.Group A:Fresh bovinepericardium;GroupB:Trypsin-detergentgroup;GroupC:Freeze-thaw-detergent24 h group;Group D:.Freeze-thaw-detergent 48 h group;Group E:Freeze-thaw-nuclease group;Group F:Detergent-nuclease group.Then,by HE staining and scanning electron microscope to observe the effects of decellularization and fibrous changes among the 6 groups;by water content testingmechanical testing to observe the changes in physical properties of the matrix;by detecting the DNA content of each group to determine the effect of decellularization qualitatively;by cytotoxicity test to detect the biocompatibility of bovine pericardium in each group.Results:The 5 methods can all remove the cellular components effectively,compared with the fresh bovine pericardium,the water content of each decellularized group were increased (P＜0.05),while the DNA content decreased (P＜0.05),with statistically significant differences.Of group E,the fibers were a little disorder,with the largest tension and the elastic modulus increased,while the rupture tensile rate decreased.Compared with fresh bovine pericardium,the largest tension of the other decellularization groups were all decreased (P＜0.05).The fibers of group B,group D were irregularly arranged and also with ruptures,both the elastic modulus and the rupture tensile rate decreased(P＜0.05).In group C and F,the fibers were dense and their direction was normal,the elastic modulus and the rupture tensile rate were similar to the fresh bovine pericardium (P＞0.05).Cytotoxicity results showed that the cell toxicity of group B,group C,group D,group E and group F were respectively 0.9,0.6,1.0,1.0 and 0.5,each group were qualified toxicity test,in which group C and group F were with the lowest cytotoxicity.Conclusion:Group C and group F can remove the cell components of bovine pericardium successfully,while maintaining the major structural components and the histological and biological properties of bovine pericardium,and with low cytotoxicity.However,group C is more economical than group F,and easier to operate.So the method on freeze-thaw-detergent 24 h can be the best choice to produce a decellularized bovine pericardium.     

三种方法构建去细胞肌肉生物支架：组织学和生物力学比较

背景：目前构建去细胞肌肉生物支架的方法有化学方法、物理冻融法和冷冻法。 目的：比较化学方法、物理冻融法和改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架组织学和生物力学差异。 方法：将6只SD大鼠竖脊肌截成36段,随机分3组(n=12),分别采用化学方法、物理冻融方法、改良化学方法构建去细胞肌肉生物支架。将荧光标记的骨髓间充质干细胞接种于3组支架上进行组织学与生物力学检测。 结果与结论：苏木精-伊红染色显示3组支架均可见平行排列结构,化学方法组连续性较物理冻融组、改良化学组差;Masson染色显示3组支架结构主要为胶原纤维,物理冻融组残留一些肌纤维,间隙不均。物理冻融组第7天荧光标记种子细胞计数明显少于化学方法组、改良化学组(P < 0.01),第14天物理冻融组少于改良化学组(P < 0.05);扫描电镜可见细胞贴附各组支架生长、大量存活;物理冻融组最大载荷高于化学方法组(P < 0.05),与改良化学组无明显差别,各组弹性模量无差异;物理冻融组孔隙率低于化学方法组、改良化学组(P < 0.05)。表明改良化学方法可以兼顾支架的组织学和生物力学特性,彻底清除肌细胞,较多保留更完整的细胞外基质。