不同因子对药用植物毛状根次生代谢产物积累的影响

<正>毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术[1]。近年来,毛状根培养已广泛应用于植物次生代谢产物生产、品种改良和特种植物栽培等领域[2]。相对于常规细胞培养和组织培养,毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定,并能向培养液释放部分代谢产物等优点,通过改变培养条件,毛状根甚至可以合成比原植物中高出数倍的活性物质,以及原来植物所不含有的活性成分[3]。     

丹参毛状根培养的建立和丹参酮的产生

丹参毛状根培养的建立和丹参酮的产生张荫麟,宋经元,吕桂兰,刘惠灵(中国医学科学院药用植物研究所北京100094)丹参SalviamiltiorrhizaBunge是治疗心血管系统疾病的重要中革药,主要成分如丹参酮具有活血、抗菌等活性,同时也是一种红色色素。利用细胞培养方法来生产这些活性成分,不仅对满足临床用药需要有重要意义,作为一种具有生理活性的色素开发也有良好前景。植物毛状根培养是80年代发展起来的植物基因工程和细胞工程相结合的?...     

药用植物毛状根药用成分合成调控机制研究进展与应用前景北大核心

植物毛状根是药用成分的天然优质原料,具有生长快速、生产时间短、次生代谢产物产量高、遗传稳定等优点,目前利用毛状根技术高效生产药用原料和改良药用植物品质已经成为研究热点。该文总结了与毛状根中药用成分合成途径及其调控方式相关的研究资料,发现目前提高药用植物毛状根中次生代谢物含量的途径一是改变毛状根的外在培养条件,二是对毛状根内在的次生代谢物生物合成通路进行调控;而有关毛状根次生物质代谢合成调控机制的研究主要集中于双子叶草本植物中,以研究生物碱类、黄酮类、皂苷类、萜类、苯丙素类和蒽醌类药用活性成分生物合成的调控机制为主,其中对丹参毛状根中丹参酮和甘草毛状根中甘草酸的生物合成调控机制进行了深入研究。该综述主要从调控毛状根药用成分生物合成的关键酶基因、转录因子以及新颖分子调控因子三个方面进行了系统总结,为药用植物毛状根次生代谢产物合成调控与生产提供参考。     

不同氮源对丹参和藏丹参毛状根有效成分积累的影响

目的氮素是中药材有效成分积累的重要影响元素,为探讨不同氮源对丹参Salviamiltiorrhiza和藏丹参Salvia castanea毛状根生长和活性成分积累的影响。方法分别采用硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物6种氮源处理对丹参和藏丹参毛状根的影响,分析毛状根生长及活性成分积累的变化。结果硝酸铵最有利于2种丹参毛状根的生长。水解乳蛋白能够显著促进丹酚酸类成分的积累,与硝酸铵对照相比,丹参迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高了2.94倍和3.27倍,藏丹参二者含量分别提高了13.74倍和2.01倍。酵母提取物对2种丹参毛状根二氢丹参酮Ι和隐丹参酮积累的促进效果最为显著,水解乳蛋白能显著促进丹参根中丹参酮IIA的积累,牛肉浸膏则对藏丹参中丹参酮IIA积累的促进作用最为显著。结论硝酸铵是2种丹参毛状根生长的最佳氮源,水解乳蛋白是丹酚酸积累的最佳氮源,不同氮源对4种丹参酮的影响不一致,丹参和藏丹参对不同氮源的响应也不一致。该研究不仅对丹参毛状根规模化培养及活性成分工业化生产具有一定指导意义,也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴作用。     

不同碳源对丹参和藏丹参毛状根生长及活性成分积累的影响

为探讨不同碳源对丹参和藏丹参毛状根的产量和活性成分积累的影响,以丹参和藏丹参的毛状根为试验材料,采用半乳糖、果糖、乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和蔗糖(对照)等6种碳源处理,测定毛状根的鲜重、干重以及丹酚酸类、丹参酮类成分的含量与产量。结果表明,半乳糖对丹参和藏丹参毛状根的生长最为有利,而乳糖和阿拉伯糖不利于2种毛状根生长。对于丹参毛状根,果糖显著促进了丹酚酸B的积累,含量与产量分别比对照组提高了5.801,10.151倍;葡萄糖显著促进了丹酚酸的积累,其中迷迭香酸的含量和产量分别为对照组的7.674,9.260倍,丹酚酸B的含量和产量分别为对照组的5.532,6.675倍。对于藏丹参毛状根,半乳糖显著提高了迷迭香酸的含量和产量,分别达到对照组的7.820,9.944倍;果糖显著促进了隐丹参酮的含量和产量增加,分别达到对照组的9.242,6.609倍。该研究确定了丹参和藏丹参毛状根培养的最佳碳源,为丹参药源性成分的大规模生产以及藏丹参的资源开发利用提供理论支持与指导。     

赤霉素及其合成抑制剂对丹参酮类活性物质含量的影响

目的研究赤霉素及其合成抑制剂对丹参毛状根中丹参酮类活性物质含量的影响.方法分别将不同浓度的赤霉素和多效唑加入到丹参毛状根的液体培养基中,培养25 d后对毛状根中的隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮Ⅱ.含量进行测定.结果赤霉素可以促进丹参毛状根中丹参酮类活性物质的积累,而多效唑则抑制了它们的积累.结论推测多效唑是丹参毛状根中丹参酮ⅡA等化合物的合成抑制剂,且赤霉素可以作为一种有效的丹参酮类活性成分的诱导子.     

稀土元素镧对丹参活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响

该文研究了镧对丹参毛状根中活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响,为揭示土壤因子镧影响丹参药材品质形成的环境机制奠定基础。采用HPLC测定丹参毛状根中活性物质含量;采用Tiangen多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,采用Takara反转录试剂盒合成c DNA,采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量分析,采用SPSS软件进行数据分析。结果显示镧处理对丹参毛状根内丹参酮类和酚酸类的积累表现出显著的促进效应,处理后9 d其酚酸类成分含量达到峰值,丹参酮类成分含量随处理时间的延长而增加(15 d内);镧处理后丹参体内活性物质积累的峰值时间相对滞后于酶基因表达的峰值时期,FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因与丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量变化趋势相似,暗示FPPS,TAT,HPPR 3个酶基因在镧诱导的丹参活性物质积累中发挥重要作用。     

不同元素对丹参毛状根生长及丹参酮类成分积累的影响

目的:研究不同浓度大量、微量、有机元素对丹参毛状根生长量及丹参酮类成分积累的影响。方法:以6,7-V液体培养基为基本培养基,分别将其大量、微量和有机元素的含量设定为缺失(0)、1/8、1/4、1(对照)、4、8倍,取培养相同时间的毛状根测定其增长倍数,利用HPLC法测定二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_A的含量。结果:大量元素可显著影响丹参毛状根的生长和丹参酮类成分的积累,其中大量元素缺乏时可显著促进丹参酮类成分的积累,但其生长量受到明显抑制,而过量大量元素虽可在一定程度上提高生长量,但丹参酮类成分并无显著增长;微量元素和有机元素的改变对毛状根的生长和丹参酮类成分的积累无显著影响。结论:大量元素是影响丹参毛状根生长和丹参酮类成分积累的主要因素,大量元素缺乏(逆境)可显著促进丹参酮类成分积累,为毛状根培养及不同品质丹参形成机理研究提供了一定的基础。     

丹参毛状根不同培养时期有效成分的积累研究

丹参是唇形科草本植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的根及根茎,具有活血祛瘀,凉血清心,养血安神的功效,是临床常用的中药。毛状根是农杆菌中R i质粒的一段DNA嵌入植物基因组中并表达的结果,许多植物受发根农杆菌感染后在受伤部位能长出大量毛状根。由于其生长速度快,不需外源植     

丹参酮生物合成途径CYP76AH1基因RNA干扰体系的建立及干扰效果研究

丹参酮类化合物多属于二萜类化合物,是药用植物丹参的主要活性成分之一,在植物体内的生物合成需要多个基因的参与.CYP76AH1是丹参酮生物合成途径的第一个P450基因,前期的酵母表达以及体外酶促反应已经验证了其体外功能.为了对该基因的功能进行进一步研究,该文构建了该基因的丹参毛状根RNA干扰体系:通过Gateway技术构建能形成具有目标基因发卡结构的RNA干扰载体,转化发根农杆菌,转染丹参叶片,将干扰片段整合至丹参基因组中,获得了高效干扰的CYP76AH1干扰型丹参毛状根.     

茉莉酸参与介导镧诱导丹参毛状根活性物质的积累

目的:验证氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子。方法:采用HPLC法测定丹参毛状根中活性物质含量;采用"loss and gain"策略对信号分子进行验证。结果:茉莉酸甲酯对镧的响应规律与丹参毛状根中活性物质对镧元素响应规律相符且对丹参毛状根活性物质积累起促进作用;经茉莉酸甲酯淬灭剂和抑制剂处理验证发现,抑制剂和淬灭剂对丹参毛状根中活性物质积累起抑制作用,而抑制剂与氯化镧同时处理能逆转抑制剂对活性物质的抑制作用。结论:茉莉酸甲酯是氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子,但不是唯一的信号分子。     

诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响

目的:考察生物诱导子真菌菌丝提取物和非生物诱导子茉莉酸甲酯及二者协同作用对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的综合性影响.方法:在继代培养21 d的丹参毛状根中添加不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生长量和两大类成分的积累量.结果:3种处理均显著抑制了丹参毛状根的生长,促进了隐丹参酮和二氢丹参酮Ⅰ的积累,但对酚酸类成分的积累却有不同的作用,茉莉酸甲酯可以促进酚酸类成分的积累,真菌诱导子在一定程度上抑制了酚酸类成分的积累.结论:真菌诱导子和茉莉酸甲酯以及二者协同作用对丹参毛状根不同成分的积累具有不同的影响,3种处理条件下水溶性成分的积累和脂溶性成分的积累基本不存在关联性.     

不同产地丹参其主要化学成分的分离和测定

丹参是唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎[1] 。其味苦性微寒 ,归心、肝经。具有祛瘀止痛 ,活血通络 ,清心除烦的功效。其分布广泛。其中以安徽、山西等地产量最大 ,此外尚有甘肃丹参、褐毛丹参、滇丹参等几种植物的根亦作丹参入药 [2 ]。丹参的活性成分为两类 ,一类为脂溶性的二萜醌类 ,具有抗菌、抗炎及扩张血管作用 ,另一类为水溶性的酚酸类化合物 ,具有明显的抗凝 ,溶纤及很强的抗脂质过氧化作用。本文作者用高效液相色谱法对丹参中丹参酮 A 和原儿茶醛进行测定 ,比较了不同产地丹参中丹参酮 A 和原儿茶醛的含…     

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。     

ABA及其生物合成抑制剂对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响

目的:研究脱落酸(ABA)及其生物合成抑制剂氟啶酮(fluridone),对丹参毛状根酚酸类成分和关键酶的影响。方法:继代培养18 d的丹参毛状根添加不同浓度的ABA及ABA与氟啶酮组合,处理1 d后测定关键酶PAL和TAT活性;处理6 d后测定不同处理的丹参毛状根中酚酸类物质的含量。结果:在一定浓度范围内,低浓度的ABA促进丹参毛状根的生长,高浓度的ABA抑制丹参毛状根的生长;ABA显著促进酚酸类物质的积累,对咖啡酸的诱导表现出正相关,但是迷迭香酸和丹酚酸B的效果,表现出在低浓度效果较好,随浓度增大,诱导效果降低,直到ABA浓度至200μmol.L-1,含量开始上升;当ABA与氟啶酮组合处理时,氟啶酮抑制ABA对丹参毛状根酚酸类的积累,但是有差异;不同浓度的ABA会不同程度的提高PAL和TAT酶的活性,添加ABA生物合成抑制剂,酶活性诱导效果降低。结论:ABA能诱导丹参毛状根中酚酸类化合物积累,同时也能激活合成相关酶的活性;ABA生物合成抑制剂氟啶酮不同程度抑制ABA的诱导效果。     

农杆菌转化后丹参植株再生

用发根农杆菌15834,LBA9402株和根癌农杆菌C58株感染丹参无菌苗,完成质粒转化后诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化后的丹参再生植物,再生植物移植到土壤中能够成活。用发根农杆菌转化后的再生植物的具有节间缩短,植株矮化、地下部毛状须根发达等特征。用根癌农杆菌转化后的再生植物生长旺盛,地上部分较原植物高大,根系发达,根产量和丹参酮含量都高于原植物。     

丹参毛状根对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究丹参毛状根对麻醉大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用大鼠冠脉结扎致心肌缺血模型。结果:丹参毛状根能显著降低缺血所致室速(VT),室颤(VF)的发生率,降低血浆乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)增高程度,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,与丹参药材比较无显著性差异。结论:丹参毛状根具有和丹参相似的药理作用,为其进一步的研究与开发利用,提供了实验依据。     

复方中丹参提取工艺及含量测定的研究

丹参为唇形科植物丹参Salviam iltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,具有活血化瘀、消肿止痛、清心除烦的功效,现代药理研究表明丹参具有扩张血管、改善微循环,增加心肌供血量和供氧量、降低心肌耗氧量等作用[1]。丹参中以酚酸类成分为代表的水溶性成分,是治疗心血管疾病的主要成分     

聚乙二醇-6000胁迫对丹参毛状根中丹参酮积累的影响

目的 研究聚乙二醇-6000(polyethylene glycol-6000,PEG-6000)胁迫对丹参毛状根丹参酮类成分积累的影响.方法 用发根农杆菌ATCC 15834诱导生产丹参毛状根,经20 d悬浮振荡培养后,分别采用1.2％、2.0％、5.5％、10％的PEG-6000处理,并用HPLC法测定PEG-6000处理1周后丹参毛状根中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的量.结果 PEG-6000能够抑制丹参毛状根的生长,PEG-6000为1.2％、2.0％、5.5％和10％处理条件下,丹参毛状根干质量分别减少为对照组的75.1％、83.0％、76.2％、76.1％; PEG-6000处理能够显著提高丹参毛状根中4种丹参酮的量,2.0％、5.5％的PEG-6000能够显著促进丹参酮Ⅰ量的提高,1.2％PEG-6000能够显著提高隐丹参酮量的;二氢丹参酮Ⅰ的量以2.0％PEG-6000处理条件下最高;丹参酮ⅡA的量以5.5％ PEG-6000处理条件下最高.结论 PEG-6000能显著促进丹参毛状根中丹参酮类成分的积累.     

稀土元素镧与丹参毛状根中活性成分及其生物合成中关键酶的量效关系

目的:研究稀土元素镧与丹参毛状根中活性物质及其生物合成中关键酶基因表达的量效关系,结合Hormesis效应理论探讨镧调控丹参次生代谢产物的阈值,以期为丹参中次生代谢产物调控及镧肥的开发提供依据。方法:采用HPLC法测定丹参毛状根活性成分含量,采用TIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA,采用Takara反转录试剂盒合成cDNA,采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量检测,采用SPSS软件进行数据分析。结果:镧处理对丹参活性成分积累及关键酶基因表达量影响显著,丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B表现出低浓度促进高浓度抑制的"抛物线"趋势;AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五个关键酶基因表达量同样表现出低促高抑的"抛物线"趋势,该趋势符合Hormesis理论曲线。结论:根据Hormesis理论分析,镧对丹参的促进浓度阈值上限在0.1~1.0 mmol·L~(-1)之间。