青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测,聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段,69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株,其中耐药株13株,敏感株5株;SSCP泳动正常者51株,其中耐药株14株,敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变,可弥补常规药敏试验的不足。     

结核分支杆菌链霉素耐药的快速检测

【目的】探讨用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)方法快速诊断结核分支杆菌链霉素 (Sm)耐药的临床意义。【方法】用PCR SSCP技术检测了 30株Sm敏感的结核分支杆菌临床分离株 ,30株Sm耐药的临床分离株 ,以结核分支杆菌H37RV标准株作对照。先用PCR方法扩增rpsL基因 ,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变。【结果】所有临床分离株均观察到rpsL基因PCR扩增产物。 30株Sm敏感的临床分离株与H37RV标准株呈现一样SSCP泳动条带 ,30株Sm耐药株中 19株有rpsL基因泳动异常 ,提示约有 6 3 %Sm耐药菌株有rpsL基因突变。【结论】本研究提示用SSCP方法容易鉴定出rpsL基因的点突变 ,PCR SSCP技术可作为快速鉴定结核分支杆菌Sm敏感性的有用工具 ,对结核分支杆菌Sm耐药的快速诊断有较大价值。     

部队军人及其驻地人群结核菌分离株分子标记分析

目的：探讨部队军人与驻地地方人群之间结核病的传播关系。方法：应用结核分支杆菌DNA插入序列IS6110作为引物，扩增结核分支杆菌参考株H37RV DNA，以同位素^32P-dCTP标记纯化的245bp扩增片段作探针，应用Southern免疫转印技术，与预先用限制性内切酶PvuⅡ消化的结核分支杆菌DNA杂交，得到限制性片段长度多态性图谱，结合患者的一般流行病学资料进行分析。结果：146株从部队和地方分离到的结核分支杆菌分离株，拷贝数在5以上的有138株，将这部分菌株按IS6110指纹特征分型可分为14个类型，部队和驻地患者分离株均以3个型别为主。且部队和地方分离菌株在各型中的分布无统计学差异。而耐药菌株指纹特征在三个主要型别中的分布与敏感菌株有显著性差异。结论：部队结核病与驻地地方结核病在传播中有密切的关系。提示部队结核病防治应与驻地地方结核病防治措施紧密结合。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

结核分支杆菌rpsL基因突变的快速检测

目的建立快速检测结核分支杆菌rpsL基因突变的方法。方法用聚合酶链反应(PCR)直接从结核分支杆菌基因组扩增rpsL基因,并直接进行测序鉴定。结果用引物P1,P2扩增H37Rv DNA获得约460bp片段,经序列测定后,显示与GeneBank中公布的序列一致(同源性99％)。28株结核分支杆菌耐SM分离株中,20株rpsL基因突变位于43住密码子,另8株分离株未出现rpsL基因突变。结论rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,本研究为进一步研究链霉素作用方式和耐药机制提供了有力手段。     

广东省结核病流行菌株研究

目的：从分子流行病学的角度探讨广东省结核分支杆菌菌株流行的分布。方法：构建广东省74株临床分离的以RFLP为基础的结核分支杆菌的IS6110 DNA指纹图谱技术，确诊结核分支杆菌菌株的流行分布。结果：24．3％（18／74）的结核菌株的IS6110 DNA指纹相似值在1－0．65之间，鉴定结果为它们均是“北京家族”结核分支杆菌菌株。结论：广东省结核菌株流行主要存在着遗传关系接近，在基因水平上相关程度较高的“北京家族”结核分支杆菌菌株，且该家族菌株正以一定的比例在我省流行。     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼（INH）分离株KatG基因突变情况，探讨其在INH耐药性中的可能作用。方法采用PCR和PCR—SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株KatG基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性，其中11株SSCP图谱异常，其敏感性为34．37％。结论新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变，其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。     

结核分枝杆菌宁夏分离株MPT64基因的生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)MPT64基因进行生物信息学预测和分析,通过与结核杆菌标准株序列的比对,观察其变异情况。方法提取结核分枝杆菌H37Rv(宁夏分离株NXT1024)基因组,以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR),从中扩增出MPT64基因,并测序,测序结果利用DNA star软件初步预测出该蛋白的分子特征、抗原性和二级结构等生物信息学信息。结果 MPT64基因全长为687bp,BLAST结果显示基因序列与GeneBank公布的标准株的基因序列的核苷酸同源性为93.6%,对该序列编码蛋白质的构象测试发现,该MPT64编码蛋白含有多个β转角结构,及多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点。结论以结核分枝杆菌宁夏分离株为模板成功扩增MPT64基因,该株与标准株的核苷酸同源性为93.6%。通过生物信息学分析获得了该蛋白的蛋白构象、抗原活性的结构域及T细胞表位等相关的生物学信息特征。     

Polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis

Polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of a 169 bp DNA fragment specific for the Mycobacterium tuberculosis complex was evaluated for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis (TBM). A total of 105 CSF specimens from clinically suspected cases of TBM were studied. Clinical details of the cases and cytochemical parameters of the CSF specimens were recorded. For PCR 10 CSF specimens from cases other than TBM, 4 non-mycobacterial culture isolates (one strain of E coli, one strain of proteus species and 2 strains of salmonella species) and one sample of sterile distilled water were processed as negative controls. For positive control standard culture of Mycobacterium tuberculosis H37Rv was processed with every batch of specimens. Besides PCR, smear for AFB by the Ziehl-Neelsen (ZN) and the fluorochrome method and culture on Lowenstein-Jensen medium was also carried out. By PCR, 31.42% specimens were found positive, whereas by conventional culture on Lowenstein-Jensen medium only 3.8% specimens were positive.     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定

目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌的aceA基因的克隆、序列测定及生物信息学分析

目的克隆编码结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的基因aceA(1915-1916),对其全序列进行测定,并以生物信息学方法和软件分析其生物学特性．为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法用PCR系统扩增出异柠檬酸裂合酶基因片段,将其插入载体pET28a,对其全序列进行测定;利用序列对比分析、蛋白氨基酸序列分析及结构预测软件进行生物信息学分析和模拟。结果克隆的基因序列与报道的序列完全一致,aceA与icl及其他编码异柠檬酸裂合酶基因同源性很高,具有保守氨基酸共有序列;初步模拟出了该蛋白的三级结构。结论本研究通过对aceA基因序列和氨基酸进行生物信息学分析,获取了该酶的信息特征．并与现有的报道结果进行对比分析。为分子生物学诊断、治疗和药靶筛选提供理论依据。     

Molecular cloning and expression of the immunodominant protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain]

OBJECTIVE: To provide the target gene and target antigen for the development of new vaccine against tuberculosis. METHODS: According to the gene sequence encoding protein Ag85A from Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, we designed a pair of oligonucleotide primers, obtained the gene by using polymerase chain reaction, and inserted the gene into the BamH I and EcoR I site of plasmid pBK-CMV to construct recombinant plasmid, and after that, the recombinant plasmid was transferred into E. coli XL1-Blue MRF' and induced with IPTG. The expression product of the gene was analyzed by using SDS-PAGE and western-blotting. RESULTS: The gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was successfully amplified by using PCR. A recombinant shuttle plasmid was constructed. The recombinant plasmid stably expressed recombinant Ag85A protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. CONCLUSION: A recombinant plasmid which contains the gene encoding the protein Ag85A of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain has been successfully constructed. The recombinant plasmid can stably express recombinant protein relative molecular mass 32 x 10(3) in E. coli XL1-Blue MRF'. These results could serve as a basis for further studies on the usefulness of the gene and its expression product in the development of new vaccine against tuberculosis.     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

巢式PCR法在结核病与结节病鉴别中的应用

目的观察结核病和结节病病理组织中结核分支杆菌DNA检出情况，探讨巢式PCR方法在结核病与结节病鉴别中的作用。方法以结核分支杆菌内插入序列IS6110为扩增靶序列，用巢式PCR法检测37例结核病和31例结节病石蜡包埋病理组织中结核菌DNA，以H37RV标准结核菌株作阳性对照，鼠胎肺作阴性对照，并与同步进行的普通PCR结果作比较。结果对照组分别均为阳性及阴性结果，37例结核病组中36例呈阳性结果（阳性率为97．3％），31例结节病组中8例呈阳性结果（阳性率为25．8％），经统计学分析两组阳性率有显著差异；与普通PCR方法比。采用巢式PCR方法对结核菌DNA检出阳性率明显提高。结论用巢式PCR法检测石蜡包埋病理组织中结核菌DNA可作为鉴别结核病和结节病的方法之一。