CIK细胞诱导及对K562细胞毒作用的研究

目的 体外诱导细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),并研究其生物学活性.方法 从外周血分离单个核细胞(PBMC),经过细胞因子诱导、培养并扩增CIK细胞,以LAK细胞作比较,检测CIK的增殖能力,流式细胞仪检测CIK细胞表面标志CD3、CD56,MTT法检测对K562细胞系杀伤活性.结果 CIK细胞第二周进入快速增殖期,到第21d扩增倍数超过120倍,CD3 、CD56 细胞扩增倍数达15倍以上;CIK对K562细胞的杀伤能力明显优于LAK细胞.结论 CIK细胞是一种具有很强杀瘤活性的免疫活性细胞,具有临床应用前景.     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及生物学活性研究

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)是外周血淋巴细胞经多种细胞因子如γ-IFN、IL-2、CD3单克隆抗体等体外刺激、活化扩增出来的新型、广谱、杀瘤的免疫活性细胞,具有体外扩增能力强,杀伤活性高等优点而逐渐引起人们的研究兴趣。本实验通过对淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、CD3因子激活的杀伤细胞(CD3AK)、CIK细胞在体外培养。     

CIK细胞治疗乳腺癌的临床疗效评估

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）体外细胞毒活性,并观察CIK细胞治疗乳腺癌的近期临床疗效、免疫学活性及副反应。方法35例乳腺癌患者经规范化治疗后,取外周血分离单个核细胞（PBMC）,体外诱导出CIK细胞培养后,观察CIK细胞表型,用MTT法测体外细胞毒活性;所有患者均接受一定剂量的CIK细胞过继免疫治疗,观察其近期临床疗效、免疫反应、不良反应。结果35例患者中,完全缓解24例,部分缓解6例,病情稳定1例,近期有效率为85．71％,疾病控制率为88．57％,无肿瘤进展时间为2～31个月,中位无肿瘤进展时间为15个月。细胞毒活性检测结果显示,当效靶比为16：1时,CIK细胞体外细胞毒活性为77．06±11．62。与CIK细胞回输前相比,患者CD3^＋,CD4^＋,CD8^＋均有明显的升高（P〈0．001）。35例患者在输注CIK过程中1例出现一过性发热（37．5℃）反应。结论CIK细胞在乳腺癌免疫治疗中能诱导机体产生特异性的免疫反应,亦是新的杀伤肿瘤细胞的效应细胞,结合传统的手术和化疗,有较好的临床疗效。     

血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

目的采用自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者的外周血单个核细胞,经体外培养扩增出树突状细胞(dendritic cell DC)/细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell CIK),应用DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤患者,观察其不良反应。方法采集10例血液肿瘤自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞,在体外经GM-CSF、IL-4、TNF-α等诱导产生DC,经IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2等诱导产生CIK,观察其细胞形态及临床应用的不良反应并分析其细胞免疫表型。结果培养产生形态学典型的DC/CIK。诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示CD80、CD83、CD86、CD1a等阳性细胞比率大幅上升。CIK随着培养时间的延长,CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性细胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK细胞免疫治疗过程中,3例患者DC注射部位出现轻微疼痛,可自行缓解。2例患者输注CIK后出现低热,持续时间2～6h,可自行消退。4例患者输注完CIK后出现乏力,约2h可自行缓解。结论自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞对DC/CIK的培养不受影响。DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者,安全性好,不良反应少。     

自体与异体CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与异体CIK细胞的抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导CIK细胞,以自体细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果异体CIK细胞增殖能力明显高于自体CIK细胞(P<0.01),CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比率较相同条件下自体CIK细胞组显著增多(P<0.05),培养7 d,上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比自体CIK细胞培养的水平高(P<0.05),对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于自体CIK细胞(P<0.01)。结论异体CIK细胞比自体CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

应用FACS检测CIK的抗肿瘤活性

目的 探讨体外CIK细胞(cytokine-induced killer)对肿瘤细胞的细胞毒作用.方法 从健康人外周血分离淋巴细胞,经过IFN γ、CD3McAb、IL-2诱导、培养,获得CIK细胞.FACS检测CIK细胞的表型;用CFSE标记靶细胞以区分效应细胞,再以PI染色,FACS检测靶细胞的死亡率.结果 CIK细胞高度表达CD3、CD8 、CD3 CD8 、CD3 CD56 ,依次为089.33%、46.26%、58.98%、30.83%.CIK对NK敏感的K562及不敏感HL60、Hela均表现出较强杀伤活性.结论 细胞因子IFN γ、CD3McAb、IL-2体外诱导的单核细胞具有强大的增殖力和杀伤活性及非MHC限制性.     

重组人IL-21对人外周血淋巴细胞的活化作用

目的 观察重组人白细胞介素21(IL-21)对健康人外周血淋巴细胞的活化作用,检测IL-21对外周血B细胞表面抗原提呈相关分子的表达及对淋巴细胞亚群的影响.方法 重组人IL-21与健康人外周血单个核细胞(PBMC)共培养48h,用流式细胞技术检测T、B淋巴细胞表面CD69的表达,并与未加IL-21组进行比较;同时用流式细胞术检测B细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ及Ⅱ类分子(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)、CD80及CD86的表达量.细胞培养96h后检测淋巴细胞亚群的变化.结果 重组人IL-21能显著提高T、B淋巴细胞表面CD69的表达量,与未加IL-21组相比差异有统计学意义(P<0.05),但却不能提高B细胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表达量.经IL-21刺激后人淋巴细胞亚群中自然杀伤细胞(NK)细胞及自然杀伤T细胞(NKT)细胞比例明显增加.结论 重组人IL-21可以活化人的T、B淋巴细胞,同时IL-21刺激后人淋巴细胞亚群中自然杀伤细胞(NK)细胞及NKT细胞比例明显增加.     

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗对恶性肿瘤患者免疫功能的影响

<正>近年来恶性肿瘤的发病率越来越高,严重影响到患者的生活质量,特别是其病程凶猛,很多失去了手术机会。目前细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是继手术化疗放射之后第4种抗肿瘤及细胞免疫治疗的有效方法[1]。我们选择2011年7月至2012年3月恶性肿瘤患者进行CIK细胞治疗共31例,采用流式细胞仪检测患者经CIK治疗前后,淋巴细胞亚     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞体内外抗肺癌的实验效应研究

目的探讨树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在体内外对肺癌的影响。方法正常人外周血单个核细胞经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,单个核细胞经贴附塑料平皿获得单核细胞,加入GM-CSF,IL-4及TNF-a诱导获得DC,悬浮细胞加入IFN-g,24h后IL-1a,IL-2及CD3McAb诱导获得CIK,将A549制备成肿瘤细胞冻融物,作为肿瘤抗原刺激DC,并将DC与CIK细胞联合培养（DC＋CIK,负载抗原的DC＋CIK）,以CIK细胞单独培养作为对照。用流式细胞仪分析细胞表型,自体混合淋巴细胞反应和异体混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞的的增殖活性。Cytotoxicity TOX96体外杀伤实验测定体外细胞毒活性,同时用A549细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肺癌活性。结果在培养的第15d,与负载抗原的DC共同培养的CIK与CIK细胞单独培养细胞相比,增殖速率明显提高[（23.4±2.3）倍vs（16.7±2.7）倍,P〈0.05],CD3＋CD56＋细胞表达水平也明显提高,[（64.3±3.6）%vs（43.9±2.1）%,P〈0.05],同时负载抗原的DC的CIK对A549细胞的体外下细胞毒活性增强,体内实验显示,与单独培养的CIK细胞相比,与负载抗原的DC共同培养的CIK,可明显抑制接种瘤细胞的裸鼠成瘤率,DC＋CIK与负载抗原的DC＋CIK在抗六效应上没有明显差异。结论 DC与CIK细胞共培养后可提高CIK细胞的增殖速率,提高CIK细胞表型的表达水平,增强CIK体内抗肺癌的活性。将来可作为一种临床有效的过继免疫治疗策略。     

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗中晚期胃癌的疗效

目的 评价应用细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)过继免疫治疗晚期胃癌的有效性.方法 用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,将诱导后的CIK细胞回输给晚期胃癌患者.采用流式细胞术分析CIK培养过程中与55例晚期胃癌患者治疗前后外周血中的T细胞亚群(CD3 ,CD4 ,CD8 )、CIK细胞(CD3 CD56 )及NK细胞(CD3-CD56 )的变化,并应用生化比色法与免疫分析技术检测患者治疗前后血清恶性肿瘤相关物质(TSGF)、胃癌相关抗原(MG7-Ag)、糖类抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)含量.结果 CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14～21 d时达峰值.CD3 CD56 细胞由起初的(0.7±0.4)%上升到14d的(31.6±5.5)%与21 d的(35.8±9.7)%.经CIK细胞治疗后患者的肿瘤标志物水平下降,而NK与T细胞亚群水平明显升高,且CIK升高尤为显著,同时提高了患者的生活质量.总缓解率61.8%.结论 用CIK细胞回输治疗晚期胃癌患者可提高患者的细胞免疫功能,并改善其临床体征,无明显毒副作用.     

Inhibition of human ovarian tumor growth by cytokine-induced killer cells

Despite the recent improvement in the treatment of ovarian cancer, this disease is still leading cause of cancer death in women. In this study, the anti-tumor activity of cytokine-induced killer (CIK) cells against human ovarian cancer was evaluated in vitro and in vivo. Although CD3+CD56+ cells were rare in fresh human peripheral blood mononuclear cells, they could expand more than 1,000-fold on day 14 in the presence of anti-CD3 antibody plus IL-2. At an effector-target cell ratio of 30:1, CIK cells destroyed 45% of SK-OV-3 human ovarian cancer cells, which was determined by the 51Cr-release assay. In addition, CIK cells at a dose of 23 million cells per mouse inhibited 73% of SK-OV-3 tumor growth in nude mouse xenograft assay. This study suggests that CIK cells may be used as an adoptive immunotherapy for patients with ovarian cancer.     

化疗联合CIK输注对晚期NSCLC患者T细胞哑群及生存的影响

目的：探讨化疗联合细胞因子诱导的杀伤细胞（ cytokine induced killer ,CIK）治疗晚期非小细胞肺癌（ non small cell lung cancer,NSCLC）患者的近期疗效。方法将61例确诊的晚期非小细胞肺癌患者给予化疗联合CIK治疗,观察治疗前后外周血中T细胞亚群及细胞因子的变化和临床疗效,并观察其对1年总生存率和无进展生存期的影响。结果 CIK回输后患者CD3、CD8、CD56的比例较治疗前明显上调（P＜0．05）,且CIK输注可明显提高患者Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平（P＜0．05）。治疗总体有效率为47．3％,临床获益率为67．3％。该研究患者的中位总生存期为10．3个月,1年生存率为22．9％,而无进展生存期7．2个月,1年无进展生存为14．0％。结论化疗CIK治疗能提高患者的免疫功能及生活质量,有望成为非小细胞肺癌有效的过继免疫治疗方法。     

CD_3单克隆抗体加白细胞介素2活化的杀伤T细胞系治肿瘤的安全性

目的 :探讨CD3单克隆抗体 (CD3McAb)与小剂量白细胞介素 2 (IL 2 )活化的杀伤T细胞系治疗肿瘤病人的安全性。方法 :从健康人外周血、脐血、人胎胸腺或病人自体血分离淋巴细胞 ,经诱导、激活传代后获淋巴因子活化的杀伤细胞 (LAK)和CD3AK细胞系 ,先分别试用 10例病人 ,(1～ 5 )×10 8,iv ,每个疗程 5次 ,显示安全有效后增加病例 ,LAK细胞组 5 0例 ,CD3AK细胞组 4 0例。结果 :效应细胞生长形态良好 ,多数能长出细胞集落。生长曲线表明CD3AK细胞比LAK细胞增殖快 ,生长时间长 ;CB CD3AK和PBL CD3AK细胞对数生长期为d 9～ 18,能从 10 6 扩增到 10 8,而其他细胞对数生长期为d 6～ 15 ,扩增到 10 7,110例病人经iv 5 48次治疗 ,不良反应主要为发热和寒颤 ,偶有恶心、呕吐 ,眩晕 ,皮疹 ;HFT LAK发生率为 11% ,其他约 5 % ,CD3AK平均不良反应发生率为 3.6 %。结论 :CD3McAb与小剂量IL 2活化的杀伤T细胞系可以安全地用于治疗肿瘤。     

耐药乳腺癌免疫治疗的实验研究

目的:探讨耐药乳腺癌抗原负载的树突细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合培养后对同种乳腺癌荷瘤小鼠的可能治疗机制.方法:分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为DC和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC(AP-DC),分别将DC与CIK细胞共培养(AP-DC+CIK组、DC+CIK组),将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,观察不同组荷瘤标本中MDR1的表达、肿瘤细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达.结果:AP-DC+CIK组、DC+CIK组、CIK组及生理盐水组MDR1/β-actin比值分别为0.14、0.57、0.81及0.98.生理盐水组、CIK组、DC+CIK组和AP-DC+CIK组平均凋亡指数差异有统计学意义(P＜0.001).各组Bcl-2及Bax蛋白表达的OD值差异有统计学意义(P＜0.01),Bcl-2/Bax值AP-DC+CIK组＜DC+CIK组＜CIK组＜生理盐水组.结论:经耐药乳腺癌抗原负载的DC与CIK共同作用后,诱导同种乳腺癌细胞凋亡强于单纯DC与CIK共同作用后及单独CIK的治疗效果.     

耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探

目的 耐药乳腺癌表现为治疗效果差,转移率高,死亡率高的一种恶性程度极高的肿瘤性疾病。有研究表明,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在树突细胞（DC）辅助下,对耐药肿瘤细胞的杀伤能力可能超过T细胞。本实验利用DC与CIK联合培养,比较在不同条件下对乳腺癌多药耐药细胞株的杀伤效应。 方法 分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为树突细胞（DC）和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC（AP-DC）,分别将DC与CIK细胞共培养（AP-DC+CIK 、DC+CIK）,CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,酶联免疫吸附法（ELISA）测定分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,MTT法测定细胞毒效应。结果 DC和CIK细胞共孵育,使CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例及分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平增高,DC的成熟表型和分泌IL-12的水平增加,其中均以AP-DC+CIK组增高最为明显,和其他组间比较差异有统计学意义。对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒效应,AP-DC+CIK组杀伤效应最强, 与DC+CIK组和CIK组比较差异均有统计学意义;结论 经耐药肿瘤抗原负载的DC与CIK共同作用后,其对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抗瘤免疫能力最强,为临床治疗耐药肿瘤带来希望。     

CD_(137)对宫颈癌患者CIK细胞功能调节的实验研究

目的探讨CD137mAb对宫颈癌患者CIK细胞的功能调节。方法分离宫颈癌患者外周血单个核细胞(PBMCs),常规CIK培养体系中加入CD137mAb为实验组(CD137-CIK组),同时对照组加入鼠IgG1同型对照(IgG1-CIK组)。动态观察CIK细胞体外增殖;流式检测CIK细胞凋亡率、细胞表型及CD3+CD56+细胞内因子的表达;LDH酶释放法检测CIK细胞杀伤活性。结果两组CIK细胞均有很强的增殖活性,实验组细胞浓度最高达(20.92±3.57)×106/mL,对照组为(14.02±2.68)×106/mL(P<0.05);第21天实验组和对照组CD3+CD56+细胞比例分别达到(35.48±5.46)%和(25.12±4.18)%(P<0.05);CD137-CIK组细胞凋亡坏死率明显低于IgG1-CIK组;实验组CIK细胞体外杀伤宫颈癌HeLa细胞株活性明显高于对照组(P<0.05);流式检测CD137-CIK组中CD3+CD56+细胞内IL-2,IFN-γ表达上调,IL-4,IL-10表达下调。结论 CD137mAb介导的共刺激信号可以显著提高宫颈癌患者CIK细胞的体外增殖活性和抗瘤作用。     

DC、CIK治疗在急性白血病中的临床应用与疗效观察

【摘要】目的 通过体外培养获得树突状细胞（DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）,应用于急性白血病（AL）患者体内白血病微小残留病（MRD）的清除,探讨其临床应用方法、疗程、安全性和疗效评估。方法 34例共45例次AL患者均通过血细胞单采获得外周血单个核细胞,以细胞因子体外诱导获得DC和CIK,分别行腹股沟淋巴结区皮下注射和静脉输注;治疗过程中观察不良反应及安全性;治疗前、中、后期进行T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子、微小残留病灶、骨髓涂片和融合基因等方面检测,进行疗效评估。结果 DC、CIK治疗不良反应少,安全性好,偶见发热等症状,可自行消退;所有患者治疗结束后均处于血液学和遗传学缓解状态,T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子和微小残留病灶检测取得满意结果。结论 DC、CIK治疗AL安全有效,副作用少,患者易于耐受,短期疗效肯定,为AL患者MRD的清除以至AL的治愈提供了一条新的有效途径,对其远期疗效需扩大例数进一步观察。 【关键词】 树突状细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞;急性白血病;白血病残留病灶     

Antitumor activity of cytokine-induced killer cells in nude mouse xenograft model

Malignant glioma is the most common primary brain tumor in adults and the median survival for patients is less than a year. Despite aggressive treatments including surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, only modest improvement has been achieved in the survival of patients with glioma. In this study, the antitumor activity of cytokine-induced killer (CIK) cells against human glioma cancer was evaluated in vitro and in vivo. Human peripheral blood mononuclear cells were cultured with IL-2-containing medium in anti-CD3 antibody-coated flasks for 5 days, followed by incubation in IL-2-containing medium for 9 days. The number of cells increased more than 200-fold and the viability was >90%. The resulting populations were consisted of 96% CD3⁺, 2% CD3⁻CD56⁺, 68% CD3⁺CD56⁺, 2% CD4⁺, <1% CD4⁺CD56⁺, 80% CD8⁺, and 49% CD8⁺CD56⁺. This heterogeneous cell population was called as CIK cells. At an effector-target cell ratio of 30:1, CIK cells destroyed 43% of U-87 MG human glioma cells, as measured by the ⁵¹Cr-release assay. In addition, CIK cells at doses of 0.3, 1, and 3 million cells per mouse inhibited 23%, 40%, and 50% of U-87 MG tumor growth in nude mouse xenograft assays, respectively. This study suggests that CIK cells may be used as an adoptive immunotherapy for glioma cancer patients. These authors contributed equally to this work.     

西黄丸氯仿提取物对荷瘤大鼠免疫清除功能的影响

目的研究西黄丸氯仿提取物对Walker256荷瘤大鼠免疫清除功能的影响,探讨其抗肿瘤作用机制。方法70只Wistar大鼠随机选取10只作为空白对照组,剩余60只建立荷瘤大鼠模型后随机分为阴性对照组、香菇多糖对照组、西黄丸氯仿提取物高、中、低剂量组、西黄丸组。各实验组灌胃给药14d后腹主动脉采血;ELISA法检测外周血白细胞介素2（IL-2）、干扰素γ（IFN—γ）水平的变化;流式细胞术检测外周血黏附分子B7—1、CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T细胞的变化,观察西黄丸氯仿提取物对荷瘤大鼠免疫清除功能的影响。结果与阴性对照组比较,西黄丸氯仿提取物中剂量组大鼠外周血IL-2、IFN-γ含量明显增高,黏附分子B7-1、CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T细胞比例显著升高,差异具有统计学意义（P〈0．05）;氯仿提取物中、低剂量组荷瘤大鼠外周血中CD3^＋、CD4^＋T细胞比例明显升高,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论西黄丸氯仿提取物能通过促进T淋巴细胞的增殖与活化增强荷瘤机体的免疫清除功能。