辐射小鼠肠上皮细胞损伤相关基因的初步鉴定

目的;寻找肠上皮细胞辐射损伤相关基因,探讨辐射致肠上皮损伤的分子发生机制。方法：用ｍＲＮＡ差异显示技术比较研究１２Ｇｙγ射线辐射损伤前后小鼠小肠上皮细胞间基因表达的异同,分离并克隆差异表达基因片段,斑点杂交验证其表达特异性。结果;寻找并成功地克隆到一条辐射损伤特异表达基因片段ＲＳ２。     

差异表达基因的几种筛选方法

多种因素导致的基因差异性表达与疾病的发生发展密切有关,分离差异表达基因,对于研究细胞生命过程的调节机制及致病机制具有重要意义. 20世纪90年代以来,先后出现了mRNA差异显示PCR(mRNA DDRT-PCR)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(SSH)、基因表达连续性分析(SAGE)和DNA微阵列(DNA microarray)等多种分析差别表达基因的方法. 我们对以上方法的原理、基本步骤及其应用进行简要综述.     

缺氧预适应小鼠海马组织差异表达基因的研究

为了研究缺氧预适应的分子机制 ,分离并分析预缺氧预适应小鼠海马组织的差异表达基因 ,运用mRNA差异显示技术 ,共获得 5 6条差异基因片段 ,对其中 1 4条进行纯化、克隆、测序以及BLAST分析 ,其中 9条为已知基因 ,5条可能为未知基因。对这些差异基因的研究将为研究缺氧预适应的分子机制提供新思路     

大鼠小肠甘丙素在肠型放射病时的变化

本文用免疫细胞化学(ICC)、H.E染色及显微分光光度计测定等技术,对20Gyγ线肠型放射病时大鼠小肠GAL神经的免疫反应性结构做了定性和定量分析。结果如下(1)照后小肠粘膜层损伤随时间延长而加重。(2)照后各组小肠GAL-LI神经元胞体无明显改变,而GAL纤维出现排列紊乱。(3)照后大鼠小肠内GAL的含量有下降趋势,且照后48h和72h组与非照射组之间存在显著差别(P<0.01)。作者结合GAL在肠道的生理功能,将照射后小肠GAL的变化规律与肠型放射病的病理特征及过程相联系,推测照后GAL的变化可能与受照后小肠运动机能、供血障碍以及粘膜损伤等病理改变有关。     

低剂量的氢醌诱导细胞损伤耐受差异表达基因的研究

目的 探讨低剂量氢醌（HQ）诱导人胚肺成纤维细胞（HLF）损伤耐受差异表达的基因。方法 参照本实验室用MTT法所得的HQ对HLF毒性的剂量效应关系,选择100pmol／L的HQ为低剂量,100μmol／L的HQ为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒：空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组（先用低剂量预刺激24h,再用高剂量刺激6h,然后用荧光差异显示PCR寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定同源性比较。结果 按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR．找到33个差异条带。对其中的8个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中1个已知基因,7个未知基因。结论 用荧光差异显示PCR方法寻找HQ诱导HLF损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究低剂量HQ诱导HLF损伤耐受的机制提供科学依据。     

烟碱诱导基因的差异表达

目的 通过测定分析烟碱诱导出现的差异表达片段的序列,观察与烟碱相关的动脉粥样硬化的致病基因。方法 提取以烟碱处理培养的胎儿脐静脉内皮细胞的RNA,利用mRNA差异显示技术显示差异表达cDNA片段（EST）,经Northern 印迹证明并测序,经基因库比较查询。结果 发现60条EST,Northern 印迹证实23条cDNA确属差异表达片段,测序发现11条未见报道同源序列的EST。结论 确定了11条差异表达片段的序列,为全长cDNA筛选和克隆打下基础。     

应用差异显示法研究低密度脂蛋白诱导内皮细胞差异表达基因

目的 克隆、分离血管内皮细胞在致动脉粥样硬化因素作用下差异表达的基因。了解动脉粥样硬化发生的分子机制。方法 培养血管内皮细胞系（ＥＣＶ３０４）在低密度脂蛋白（ＬＤＬ）的诱导下,用改进的差异显示－聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术分析表达水平明显差异的ｃＤＮＡ。对差异显示基因进行序列测定和同源比较。用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实差异显示基因片段。结果 ＬＤＬ诱导ＥＣＶ３０４细胞出现 上调和下调表达的ｃＤＮ     

mRNA差异显示筛选卵巢癌相关基因

目的：利用ｍＲＮＡ差异显示技术研究正常卵巢上皮和卵巢上皮癌之间的基因表达差异状况,筛选和克隆卵巢上皮癌相关基因。方法：通过ＤＤ－ＰＣＲ分析正常卵巢上皮和卵巢上皮癌总ＲＮＡ将差异片段分离并显示出来,将其回收,利用基因克隆技术将其筛选和克隆出来作为探针进行斑点杂交鉴定、ＤＮＡ序列测定、通过国际互联网络检索ＧｅｎＢａｎｋ进行同源性分析。结果：共筛选克隆鉴定６个差异显示片段。其中４个为未知基因片段,已收录     

mRNA差异显示法筛选和克隆胎肝中差异表达基因

0　引言　胎肝正处于生长发育阶段 ,其中表达的一些基因在成人肝脏中处于关闭状态 ,当成人肝脏部分切除或肝细胞广泛受损时 ,剩余肝细胞表现出很强的再生能力 ,再生成年肝脏和肝癌细胞中都出现有发育早期基因的表达 [1 ] .克隆这类胎肝中差异表达的基因 ,将有助于了解肝脏的发育过程 ,并为肝脏再生及肝脏相关疾病的研究提供线索 .1　材料和方法1.1　材料　胎肝和成人肝组织分别由西京医院妇产科和肝胆外科提供 .差示 PCR引物为 5′端 10碱基随机引物 I(RPI) :5′- AGCCACCATG- 3′ ;5′端 10碱基随机引物 II(RPII) :5′- TAGCAG…     

肾癌差异表达基因克隆的研究

目的 克隆并鉴定肾癌与正常肾之间差异表达的基因。方法 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌组织与正常肾组织差异表达的cDNA消减文库,并从中克隆鉴定出肾癌差异表达的基因。结果 构建成功了高消减效率的人肾癌cDNA消减文库,对其中5个克隆插入的cDNA片段进行测序后经Genbank检索表明,5个片段均为未知新序列,其中GYIZ-RCC18为3个拷贝,提示以上5个cDNA征段可能来自3个新基因。Northern杂交分析显示,GYIZ-RCC18在肾癌组织中有明显表达,而在正常肾组织中无表达,这证明GYIZ-RCC18是肾癌相关的新基因。结论 人肾癌cDNA消减文库的建立为进一步筛选,克隆肾癌特异性表达的新基因奠定了基础。     

人骨肉瘤差异表达基因的筛选

目的 研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因,探讨骨肉瘤的基因改变,为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础。方法 采用mRNA差异展示技术,应用3条锚定引物和8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因,对其进行,是序,用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因,将筛选出差异表达基因在GenBank检索进行序列同源性分析。结果 筛选及克隆出6条差异条带,为ZOL03,ZOL51,1C82,1C74,2A21及2G12,RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达,在正常骨组织中不表达。6条差异片段经序列测定,在GenBank数据库中进行序列相似性分析,证实ZOL03,ZOL51同源性极低,1C82,1C74,2A21,2G12同源性较低,此6条片段为新基因序列ORF finder分析未发现具有开放读框,均属于非编码区序列,其中ZOL03和ZOL51两个序列在GenBank数据库中登录,接受号为BI894276和BI936370。结论 分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的6条差异表达基因,同源性差,均确认为新基因,可能是骨肉瘤差异表达相关基因。     

老年性白内障与正常晶体上皮细胞中差异表达基因的筛选

目的：筛选老年性白内障与正常晶体上皮细胞的差异表达基因．方法：利用改良消减杂交法获得差异cDNA，利用PCR法扩增其中大片段差异cDNA，将其克隆入质粒载体，通过反向点杂交排除假阳性克隆后，阳性克隆测序与GenBank中的序列进行比较，新序列进行计算机分析。结果：在库中随机挑选约600个克隆酶切鉴定，获得≥750bp片段400个。经反向点杂交，排除假阳性克隆后，共得到阳性克隆150个；测序的50个片段中，有30个已知基因(包括20个功能已知基因、10个序列已知但功能未知基因)，3个新序列．新序列中有一个的氨基酸序列与假想的锌指蛋白有45％同源性，可能参与细胞生长调控与代谢．结论：改良消减杂交法可以快速有效地获得老年性白内障差异表达基因，对稀有基因及新基因的发现与功能鉴定有重要意义。     

小鼠肠型放射病时小肠壁肥大细胞的动态变化及其与一氧化氮的关系

目的：探讨肥大细胞在肠型放射病中的作用．方法：应用免疫组化、组织化学和常规组织染色方法，观察受辐照小鼠小肠壁肥大细胞、一氧化氮合酶（ＮＯＳ）阳性成分、组织结构及其变化．结果：受照后随着存活时间从２４ｈ，４８ｈ至７２ｈ的延长，小鼠出现进行性加重的肠管扩张、肠壁充血水肿和组织损伤坏死，肥大细胞出现脱颗粒、含着染颗粒的肥大细胞数目呈进行性下降，并伴随着肠壁ＮＯＳ活性或数量的增加．给予特异性ＮＯＳ抑制剂后，肥大细胞脱颗粒受到抑制，肠壁的病理改变明显减轻．结论：肠壁肥大细胞通过释放其胞浆颗粒活性物质参与肠型放射病病理过程；一氧化氮可能调节肥大细胞颗粒的释放；肥大细胞释放的活性物质如单胺和神经肽（如ＶＩＰ），可能是肠道放射病病理过程如肠壁充血、肠腔扩张和粘膜上皮组织变性坏死等的重要因素     

利用荧光mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs

目的:获取短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs.方法:应用荧光mRNA差异显示技术进行筛选,并利用反向Northern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性.结果:共获得32个与盐胁迫相关的cDNA序列,并获得GenBank 注册号.BLAST同源性分析结果表明,13个与已知基因序列有同源性,19个为未知ESTs.其类型分别为:诱导表达型,22个;增强表达型,7个;抑制表达型,3个.结论:通过荧光mRNA差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的ESTs,对它们的进一步研究将为短芒大麦耐盐分子机制的发现提供思路.     

大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的克隆和鉴定大剂量辐射前后大鼠空肠上皮细胞IEC-6差异表达基因,为探索肠上皮细胞辐射损伤修复的分子机制提供线索.方法IEC-6细胞经35Gyγ射线照射后由抑制性消减杂交(SSH)方法和T/A克隆技术进行差异表达基因消减cDNA文库的构建,用反向Northerm杂交法对库中的EST序列进行筛选,挑取阳性克隆测序,和GenBank比对后挑选有限克隆进行正向Northerm杂交进行验证.结果扩增消减杂交cDNA文库得到约2 000个克隆,随机选取96个白色克隆进行PCR扩增,用反向Northern杂交法对库中的EST片段进行筛选得到15个阳性克隆,代表12个基因的转录产物,部分基因功能已经明确,涉及细胞骨架、细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,另外还获得一新的cDNA序列.结论SSH法建立了IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库,一次获得多条差异显示EsT片段,基因种类涉及细胞骨架,细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,这些基因可能在肠上皮细胞的辐射损伤反应中起重要作用.     

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库.方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型.取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA,SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定.结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段.结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础.     

肠型放射病时小鼠小肠壁内一氧化氮合酶的动态分布

为证明一氧化氮合酶（ＮＯＳ）在肠型放射病过程中的变化，探索其病理意义。结果提示，受照射小鼠小肠壁内ＮＯＳ活性的增加可能是肠型放射病晚期肠腔过度扩张，血管舒张充血的重要原因之一。     

用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的 利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因.方法 分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果.结果 原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个.荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致.结论 用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据.     

Screening of differentially expressed genes in the hypothalamus of a rat neuropathic pain model following sciatic nerve injury

Background Neuropathic pain is induced by injury or disease of the nervous system. Most studies have so far focused only on a few known molecules and signaling pathways among neurons. However, all signal transmissions involved in neuropathic pain appear to be an integral system at different molecular levels. This study was designed to screen the differentially expressed genes of the hypothalamus in chronic constriction injury （CCI） rats and analyze their functions in developing neuropathic pain. Methods Ten adult female Sprague-Dawley rats （（200±10） g） were used in experimental group and sham group （n=-5 in each group）. Mechanical allodynia tests were performed to ensure that the CCI rat model was constructed successfully. Total hypothalamus RNAs were isolated from each group. Forward suppression subtractive hybridization （SSH） library of rat hypothalamus was constructed and up-regulated cDNA clones at neuropathic pain states were obtained via suppressed subtractive hybridization technique and the functions of these genes were analyzed bioinformatically. Results Mechanical allodynia tests showed that the experimental rats had a significantly reduced mechanical allodynia threshold 3 to 13 days after CCI vs sham surgery rats （P 〈0.01）, indicating that the model was successful. Forward SSH library of the rat hypothalamus was constructed successfully and 26 over-expressed expression sequence tags （ESTs） were obtained from these up-regulated cDNA clones. Conclusion Twenty-six up-regulated genes, involved in the regulation of cell cycle and apoptosis, signal transduction, and neuroprotection, may play key roles in decreasing mechanical withdraw thresholds in CCI rats, which implicates a multidimensional and integrated molecular mechanism at gene level in developing neuropathic pain with the supraspinal contributions.     

白血病原代骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞基因差异表达研究

目的研究白血病骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)诱导Jurkat细胞相关基因表达的变化.方法采用Percoll体外分离正常人、初治急性白血病患者BMSCs;采用抑制性消减杂交技术建立白血病BMSCs诱导Jur-kat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs诱导的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;这些基因功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢有关.结论白血病BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达.