复合聚合酶链反应检测恶性疟原虫及混合感染

目的 应用一种简易、快速的复事ＰＣＲ扩增系统检测恶性疟的虫及混合感染。方法 以间日疟原虫（Ｐ．ｖ）和恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）特定片段为靶基因，设计并合成引物，建立复合ＰＣＲ护增系统。采用煮沸法快速制备ＤＮＡ模板研究本系统的敏感性和特异性，并用于临床血样的检测。结果 从Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ感染血样中分别扩增出分子量大小为７０５ｂｐ和５７５ｂｐ的特定扩增带。而食蟹猴疟     

载脂蛋白E基因多态性检测技术的对比性研究

目的建立并比较载脂蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）基因多态性检测技术,为ＡｐｏＥ基因分型提供良好的方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ单链构象多态性（ＳＳＣＰ）检测技术对１１０例患者及相同人数的正常人进行ＡｐｏＥ基因型检测和分析。结果应用ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ技术测得正常对照组：ε２／２（０,０．０２０）,ε３／３（０．７００,０．７６０）,ε４／４（０,０．０４０）,ε２／３（０．１００,０．０６０）,ε２／４（０,０．０２０）,ε３／４（０．２００,０．１００）,ε２（０．０５０,０．０６０）,ε３（０．８５０,０．８４０）,ε４（０．１００,０．１００）。经χ２检验,ＡｐｏＥ基因型频率和等位基因频率的差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。上两种检测技术与既往两种检测技术（ＩＥＦ,ＷｅｓｔｅｒｐＢｌｏｔｉｎｇ）的结果经χ２检验,其ＡｐｏＥ等位基因频率的差异也无显著意义（Ｐ＞０．０５）,均符合中国汉族人ＡｐｏＥ基因频率分布。结论ＰＣＲＲＦＬＰ方法是一种稳定可靠的ＡｐｏＥ基因多态性分析方法,多重ＰＣＲＳＳＣＰ技术更加简便有效,使ＡｐｏＥ基因多态性的研究更加完善。     

庚型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

分别在庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）基因５′端非编码区（５′－ＵＴＲ）、非结构（ＮＳ）３及区非结构（ＮＳ）５区设计套式引物，建立逆转录套式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）检测血清ＨＧＶ ＲＮＡ。在２９９份不同血汪标本中ＨＧＶ ＲＮＡ阳性者４１例，基于５′－ＵＴＲ、ＮＳ３区及ＮＳ５区引物ＰＣＲ的阳性率分别为８７．８％、８０．５％和９７．６％。本研究结果表明根据中国株ＨＧＶ基因ＮＳ５区部分序列设计引     

碳青霉烯耐药大肠埃希菌的基因组学特点分析

目的 分析碳青霉烯耐药大肠埃希菌（ＣＲＥＣ）的基因组流行病学特征，调查共携带 ｂｌａＮＤＭ和 ｂｌａＫＰＣ的大肠埃希菌在南京 鼓楼医院的流行情况，并分析该类细菌的播散特点。 方法 对 ２０１５ 年从南京 ６ 家医院收集的 １１ 株 ＣＲＥＣ 菌株，进行全基因 组测序组装后，分析耐药基因、毒力因子、多位点序列分型（ＭＬＳＴ）、血清型和 ＦｉｍＨ 型的分布并构建系统发育树。 对于从南京 鼓楼医院 ２０１３—２０１７ 年收集的 ＣＲＥＣ 菌，使用 ＰＣＲ 和 ＤＮＡ 测序法筛选共携带 ｂｌａＮＤＭ和 ｂｌａＫＰＣ的菌株，脉冲场凝胶电泳技术 （ＰＦＧＥ）进行遗传相关性分析；接合试验分析基因的可转移性。 结果 所有的 ＣＲＥＣ 都携带了至少 １ 种碳青霉烯酶编码基因， 其中，９ 株 ＣＲＥＣ 细菌携带 ｂｌａＮＤＭ?５，３ 株携带 ｂｌａＫＰＣ?２，２ 株携带 ｂｌａＮＤＭ?１，３ 株同时携带 ｂｌａＮＤＭ?５和 ｂｌａＫＰＣ?２。 ＭＬＳＴ 分析发现 ７ 种不 同的序列分型（ＳＴ），２ 株细菌为 ＳＴ４１０，其余的 ６ 种 ＳＴ 型依次为 ＳＴ３４８９、ＳＴ１５６、ＳＴ６８３、ＳＴ２９７、ＳＴ１６７ 和 ＳＴ３６１；其次，１１ 株细菌 中鉴定出 ６ 种不同的血清型和 ８ 种 Ｆｉｍ 型；１１ 株细菌的质粒图谱虽然呈多样性，但每株细菌都含有质粒复制子 ＩｎｃＸ３。 系统 发育分析表明，１１ 个 ＣＲＥＣ 分离株之间有很大的遗传多样性；ＰＦＧＥ 显示 ６ 株共携带 ｂｌａＮＤＭ和 ｂｌａＫＰＣ的分离株之间也存在较大 的遗传多样性。 接合试验表明 ｂｌａＮＤＭ可转移，但与 ｂｌａＫＰＣ基因不在同一质粒。 结论 ｂｌａＮＤＭ是 ＣＲＥＣ 中主要的碳青霉烯酶基 因，ｂｌａＮＤＭ?５是主要的 ｂｌａＮＤＭ基因，可能通过 ＩｎｃＸ３ 质粒水平传播。 ＭＬＳＴ、Ｆｉｍ 分型、血清分型和进化树发育表明 ＣＲＥＣ 呈遗传 多样性。     

肾移植HLA-DR血清学分型与PCR-SSP基因分型的比较

目的：比较肾移植供受体ＨＬＡ－ＤＲ血清学分型与ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型方法的差异,以探讨两种方法的优缺点。方法：对已作ＨＬＡ－ＤＲ标准血清学分型的供受体标本,用ＰＣＲ－ＳＳＰ基因分型法作ＨＬＡ－ＤＲ抗原分型。结果：血清学法耗时８０ｍｉｎ,ＰＣＲ－ＳＳＰ法耗时１４５ｍｉｎ;血清学方法误差率为１１．５％（受者１５．１％,供者８．７％）。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ法作ＨＬＡ－ＤＲ分型具有准确、简便、快速等优点。     

应用PCR－SSP对异基因骨髓移植供受者HLA－DQA1位点的基因分型

为探索一种可靠性和灵敏性高的ＨＬＡⅡ类基因的配型方法，根据Ｏｌｅｒｕｐ提出的１６个特异性引物序列，用多聚酶链反应－序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法，对ＤＱＡ＿１基因位点的多态性进行检测和分型，并与多聚酶链反应－序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）及多聚酶链反应－单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检测结果进行比较，获得了一致的分型结果。ＰＣＲ－ＳＳＰ可分辨出ＤＱＡ＿１位点的纯合体和杂合体等位基因，并能检测出单一碱基的点突变；它将ＰＣＲ扩增和检测两个步骤合并为一次完成，操作更简便、快速。并已将ＰＣＲ－ＳＳＰ方法成功地用于１５对异基因骨髓移植的供、受者的分型。ＰＣＲ－ＳＳＰ作为基因分型的有效技术，可为骨髓来源提供直接的科学依据。     

HLA的PCR—SSP分型技术

ＰＣＲ－ＳＳＰ是采用ＰＣＲ技术，针对被检基因设计一系列具有等位基因多态性的序列特异上物扩增被检标本，分析ＰＣＲ产物判定ＨＬＡ型别，ＨＬＡ－ＤＲＩ￣ＤＲ１８可以采用１９对引物检定，采用两步法以７９对引物可以检定ＤＲ全部基因型。ＨＬＡ－ＤＱ采用２０条引物不同组合，陈检定与血清学型别一致的特异性还可分析部份基因型；以２２对引物则可检定ＤＱＢ１全部基因型。ＰＣＲ－ＳＳＰ技术比ＰＣＲ－ＳＳＯＰ及ＰＣＲ－ＲＥ     

多重PCR在幽门螺杆菌检测及分型中的应用

应用多重ＰＣＲ同时扩增１６ＳｒＲＮＡ和ｃａｇＡ基因来检测幽门螺杆菌感染及其分型。ＰＣＲ产物经ＤＮＡ序列测定证实为转异性扩增，敏感度为１０＾２ＣＦＵ／ｍｌ。４８株Ｈｐ菌株中，Ｉ型菌株（ｃａｇＡ＋）２６株（５４．２％）；５５０份胃粘液标本，Ｈｐ阳性（１６ＳｒＲＮＡ基因＋）２１６份（４７．５％），其中Ｉ型Ｈｐ１３９份（５３．３％）。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

PCR—SSP法检测A^1,2BO^1,2血型基因型

目的：为了建立Ａ＾１，２ＢＯ＾１，２血型系统基因分型的方法，以检测人群中Ａ＾１，Ａ＾２，Ｏ＾１，Ｏ＾２基因的频率。方法 采用盐析法进行样品ＤＮＡ的抽提，采取ＰＣＲ－ＳＳＰ法进行Ａ＾１，２ＢＯ＾１，２血型基因分型。结果 １５８例中Ａ＾１，２ＢＯ＾１，２系统基因频率分别是Ａ＾１为１８．７％，Ａ＾２为０．６％，Ｂ为１７．４％，Ｏ＾１为６２．３％，Ｏ＾２为６２．３％，Ｏ＾２为０．９％。结论：该方法可鉴定出     

应用PCR－SSCP法探讨外周血B细胞参与多发性骨髓瘤的发病

为探讨多发性骨髓瘤（ＭＭ）的克隆起源，经形态学及ＡＢＣ法筛选１８例外周血无浆细胞污染的ＭＭ患者，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增免疫球蛋白重链ＣＤＲ３区编码基因，并经单链构象多态性（ＳＳＣＰ）法分析其单链构象多态性。经平行检测患者外周血（ＰＢ）和骨髓（ＢＭ）标本，发现１５例ＢＭ及１１例ＰＢ获得预期的克隆特异性ＰＣＲ产物为８０～１１０ｂｐ，其中９例ＰＢ和ＢＭ获得相同的ＰＣＲ产物，８例为１条扩增条带，其ＳＳＣＰ分析可见２条单链，另１例ＰＣＲ产物为２条扩增条带，其ＳＳＣＰ分析可见３条单链，同一患者ＰＢ与ＢＭ标本的单链泳动速度一致。提示至少６０％ＭＭ患者ＰＢ和ＢＭ不仅ＰＣＲ产物一致，其单链构象也一致，研究结果证实了外周血Ｂ细胞参与ＭＭ的发病。     

细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）加反相杂交技术在细菌ＤＮＡ检测中的应用。方法以１６ＳｒＲＮＡ基因为靶序列，设计引物及寡核苷酸探针，采用ＰＣＲ法加反相杂交检测标准菌株及临床标本的细菌ＤＮＡ。结果对２４株不同标准菌株进行ＰＣＲ扩增，均出现３７１ｂｐ长度的ＤＮＡ片段，敏感性试验可检测出１０－１２ｇ的细菌ＤＮＡ，与人类基因组ＤＮＡ、真菌及病毒无交叉反应；２２例血培养阳性标本及４例脑脊液培养阳性标本均扩增出３７１ｂｐ长度ＤＮＡ条带，反相杂交法区分革兰阳性／阴性细菌与培养结果相符。结论１６ＳｒＲＮＡ基因ＰＣＲ加反相杂交技术检测细菌ＤＮＡ，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为细菌感染的临床诊断提供了科学的依据     

非同位素银染单链构象多态性技术筛查葡萄糖激酶基因突变

目的建立银染单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术筛查葡萄糖激酶基因点突变。方法收集１０个ＮＩＤＤＭ家系的１１２例基因组（ＤＮＡ），经多聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增葡萄糖激酶基因第２～１０号外显子，ＳＳＣＰ电泳，硝酸银染色筛查点突变。结果发现３个家系，９例受试者第５，６号外显子出现异常ＤＮＡ片段条带，经顺序分析证实为第５号内含子１２位碱基Ｃ→Ｇ突变。结论非同位素ＳＳＣＰ技术是一种简便、经济、快速、准确和有效的筛查基因点突变的方法。     

RT—PCR检测肿瘤标志物PGP9.5

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以神经内分泌蛋白基因产物９．５（ＰＧＰ９．５）为肿瘤标志物，评价了这一检测系统的效果。琼脂糖凝胶电泳分析ＲＴ－ＰＣＲ产物发现神经母细胞瘤细胞株均为阳性，正常人外周血阴性，其敏感度达１个瘤细胞／１０＾７外周血多形核细胞。临床上测定３９例患儿外周血、骨髓及组织标本证实ＲＴ－ＰＣＲ检测ＰＧＰ９．５为一敏感特异的测定方法。     

非同位素银染单链构象多态性技术筛查葡萄糖激酶基因突变

目的 建立银染单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术筛查葡萄糖激酶基因点突变，方法 收集１０个ＮＩＤＤＭ家系的１１２例基因组（ＤＮＡ），经多聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增葡萄糖激酶基因第２～１０号外显子，ＳＳＣＰ电泳，硝酸银染色筛查点突变，结果 发现３个家系，９例受试者第５，６号外显子出现异常ＤＮＡ片段条带，经顺序分析证实为第５号内含子１２位碱基Ｃ→Ｇ突变，结论 非同位素ＳＳＣＰ技术是一种简便，经济，快速，准     

聚合酶链反应技术诊断苯丙酮尿症

为早期确诊，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶（ＥＣＯＲＩ、ＥＣＯＲＶ）方法，对初筛出具有高度苯丙酮尿症（ＰＫＵ）可能的６例患儿，行苯丙氨酸羟化酶基因分析。结果确诊３例，还为其中１例患儿母亲再次妊娠的胎儿作产前ＰＣＲ检测，鉴定出与ＰＫＵ致病基因相连锁的遗传特异片段，据此诊断出胎儿为杂合子，并经随访证实，应用ＰＣＲ技术对ＰＫＵ患者早期诊断乃至产前诊断是可靠且可行的。     

东南亚缺失型α地中海贫血的聚合酶链反应快速诊断技术及 …

目的 针对东南亚缺失型α地中海贫血建立一种快速,简便的聚合酶链反应（ＰＣＲ）基因诊断技术,并初步应用于高危胎儿的产前诊断。方法 采用跨越断裂点的ＰＣＲ设计方案,其中一对引物用于扩增－－＾ＳＥＡ缺失基因,另一对引物设计在－－＾ＳＥＡ,－α＾３．７,－α＾４．２的公共缺失区域,用于扩增正常的α珠蛋白基因,两对引物在单管中反应。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的 探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法 设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应－单链橡象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果 以药敏试验结果对照,有１６株ＲＦＰ敏感株为２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性００％。对部     

聚合酶链反应技术诊断苯丙酮尿症

为早期确诊，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶（ＥＣＯＲＩ、ＥＣＯＲＶ）方法，对初筛出具有高度苯丙酮尿症（ＰＫＵ）可能的６例患儿，行苯丙氨酸羟化酶基因分析。结果确诊３例，还为其中１例患儿母亲再次妊娠的胎儿作产前ＰＣＲ检测，鉴定出与ＰＫＵ致病基因相连锁的遗传特异片段，据此诊断出胎儿为杂合子，并经随访证实。应用ＰＣＲ技术对ＰＫＵ患儿早期诊断乃至产前诊断是可靠且可行的。     

血小板同种抗原P1A基因型检测及其与突发性耳聋的关系探讨

建立一种简便，易行，适于一般分子生物学实验室操作的检测血小板同种抗原Ｐ１＾Ａ基因型的方法并对Ｐ１＾Ａ２基因型与突发性耳聋之间的相关性进行初步研究。设计一对引物，用ＰＣＲ方法特异扩增血板ＧＰⅢａ基因上包含造成Ｐ１＾Ａ基因多态性的碱基在内的２４７ｂｐ片段，ＰＣＲ产物用ＭＳＰⅠ酶切。电泳后观察酶切位点的限制性片段长度多态性。用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的方法检测了４０例对照和４０例突发性耳聋患者，结果均为Ｐ１＾Ａ