αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的探讨αB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制.方法构建带6个串联组氨酸的αB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1-aBC),经测序证实后,转染C2C12肌原细胞株,筛选稳定高表达αB-晶状体蛋白的细胞株.采用H2O2(0.5 mmol/L)诱导细胞凋亡,检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光强度作为细胞凋亡早期判断指标.提取细胞线粒体蛋白及胞浆蛋白,采用镍金属亲和层析分离αB-晶状体蛋白与其相互作用蛋白复合物,免疫共沉淀证实其蛋白质相互作用.结果①H2O2处理1 h后,转染αB-晶状体蛋白的细胞线粒体释放细胞色素C和细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻均较对照组明显减少.②经Western blot检测,发现αB-晶状体蛋白与其相互作用蛋白复合物中存在线粒体凋亡相关蛋白p53、核因子κB、细胞色素C和Smac.③经免疫共沉淀证实,H2O2诱导细胞凋亡时,αB-晶状体蛋白与p53、细胞色素C和Smac等促凋亡蛋白相互结合增多,而与抗凋亡蛋白核因子κB相互结合减少.结论αB-晶状体蛋白基因转染可早期抑制氧化应激所致的C2C12肌原细胞凋亡,其机制可能涉及αB-晶状体蛋白与上述凋亡相关蛋白之间的相互作用.     

αB-晶状体蛋白与凋亡相关蛋白相互作用抑制C2C12细胞凋亡

目的 探讨aB-晶状体蛋白抗心肌细胞凋亡的分子机制。方法构建带6个串联组氨酸的aB-晶状体蛋白表达质粒(pcDNA3.1一aBC)，经测序证实后，转染C2C12肌原细胞株，筛选稳定高表达aB-晶状体蛋白的细胞株。采用H2O2(0.5mmol/L)诱导细胞凋亡，检测线粒体细胞色素C释放率和细胞膜磷脂酰丝氨酸细胞色素荧光     

丙型肝炎病毒1b基因型核心蛋白对HepG2细胞Bax与Bcl-2基因表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）1b基因型核心蛋白（C）对HepG2细胞B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）与Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达的影响,以探索1b型HCV C蛋白与HepG2细胞凋亡的关系。方法利用RT-PCR扩增出HCV-1b-C基因,经双酶切后连接pcDNA3.1（-）,成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C。利用脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR及Western Blot检测其mRNA及蛋白的表达,RT-PCR及Western Blot检测转染成功后HCV-1b-C对HepG2细胞Bax与Bcl-2表达的影响,并设转染空质粒组及未处理组作对照。结果成功构建真核表达载体pcDNA3.1（-）/HCV-1b-C;瞬时转染HepG2细胞,成功表达HCV C mRNA及蛋白;转染C基因组的Bax的mRNA及蛋白相对表达量减少,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）;转染C基因组的Bcl-2的mRNA及蛋白相对表达量增多,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）。结论 1b基因型HCV C蛋白转染HepG2细胞会导致Bax表达减少及Bcl-2表达增多,降低Bax/Bcl-2比值,可能是抑制HepG2细胞凋亡的机制之一。     

Kruppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的探讨Kruppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响。方法采用热应激（42．5℃）处理Kruppel样因子4过表达的C2C12细胞1h，37℃恢复12h；采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡；采用Westernblot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果流式细胞术结果发现，两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高，但与转空载体组相比较Kruppel样因子4过表达组升高更明显，凋亡百分率达19．6％；荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变；Kruppel样因子4组细胞经Westernblot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变。结论Kruppell样因子4可以诱导热应激所致（22C12小鼠肌原细胞凋亡。     

氯通道ClC-3反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究ClC3反义寡核苷酸对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测ClC3蛋白表达;形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率和凋亡率及ClC3反义寡核苷酸转染对其影响。结果ClC3反义寡核苷酸转染抑制内源性ClC3蛋白表达后,可加重H2O2诱导大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变及DNA断裂,细胞凋亡率由52.8%±13.6%增至75.7%±5.8%(n=6,P<0.01),而细胞存活率由48.9%±4.3%进一步降低为31.3%±4.3%(n=6,P<0.01)。结论ClC3反义寡核苷酸转染促进H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。     

Krppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的探讨Krppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响。方法采用热应激(42.5℃)处理Krppel样因子4过表达的C2C12细胞1h,37℃恢复12h;采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果流式细胞术结果发现,两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高,但与转空载体组相比较Krppel样因子4过表达组升高更明显,凋亡百分率达19.6%;荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变;Krppel样因子4组细胞经Western blot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变。结论Krppel样因子4可以诱导热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡。     

Krüppel样因子4过表达对热应激所致C2C12细胞凋亡的影响

目的 探讨Krüppel样因子4对热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡的影响.方法 采用热应激(42.5℃)处理Krüppel样因子4过表达的C2C12细胞1 h,37℃恢复12 h;采用流式细胞术、Hoechst33258染色检测细胞凋亡;采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达.结果 流式细胞术结果发现,两组细胞凋亡百分率较热应激前均升高,但与转空载体组相比较Krüppel样因子4过表达组升高更明显,凋亡百分率达19.6%;荧光染色可见细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学改变;Krüppel样因子4组细胞经Western blot能检测到bcl-2、bax蛋白明显改变.结论 Krüppel样因子4可以诱导热应激所致C2C12小鼠肌原细胞凋亡.     

过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的构建过表达大鼠热休克蛋白20(HSP20)基因慢病毒载体,探讨其对H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠HSP20基因pHIV-HSP20过表达质粒慢病毒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其转染效率;包装慢病毒并转染H9C2心肌细胞;72 h后观察其转染效率,RT-PCR法检测细胞HSP20 mRNA表达,CCK-8、Hochest33258染色法检测H2O2诱导后H9C2心肌细胞凋亡情况。结果成功构建了HSP20慢病毒过表达载体,经293FT细胞包装后,其对H9C2细胞72 h的转染效率为95%;与慢性病毒组比较,H9C2细胞转染72 h后HSP20 mRNA水平显著升高,细胞活力下降,心肌细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)。结论过表达HSP20能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

热诱导延迟损伤大鼠心肌细胞凋亡机理的探讨

目的探讨热诱导延迟过氧化氢(H2O2)造成大鼠心肌细胞凋亡机理。方法体外培养大鼠乳鼠心肌细胞同时温度诱导细胞产生热休克蛋白70(HSP70)，用H2O2造成心肌细胞损伤。采用Western Blottmg、流式细胞仪、Bcl-2原位杂交、免疫组化检测Caspase-3等作为检测指标，观察心肌细胞损伤，以及HSP70对心肌细胞的保护作用。结果温度诱导后HSP70在胞浆中大量表达，保护组凋亡率显著低于损伤组，Bcl-2和Caspase-3在损伤组大量表达。结论HSP70可延迟细胞凋亡，对心肌细胞具有保护作用。     

bcl-2反义寡核苷酸与VP16协同抑制小细胞肺癌细胞增殖的研究

目的 研究bcl-2反义寡核苷酸与足叶乙甙（VPl6）联用对小细胞肺癌细胞NCI—H69增殖的影响。方法 通过脂质体将不同寡核苷酸导入NCI—H69细胞中，分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组4组。Western Blot法检测细胞bcl-2蛋白的表达。不同浓度的VP16作用于4组转染后的细胞，MTT法测定细胞存活分数。结果 4组细胞中。与空白对照组相比较，反义寡核苷酸组的bcl-2蛋白表达明显受到抑制。bcl-2反义寡核苷酸转染细胞与VP16作用后，反义寡核苷酸组细胞在各个浓度的存活分数均低于对照组，且有统计学意义（P〈0．01）。结论 bcl-2反义寡核苷酸与VP16能协同抑制小细胞肺癌细胞的增殖。     

hMAM融合HSP70基因真核表达载体的构建及其免疫学活性测定

目的构建融合人乳腺珠蛋白（hMAM）与人热休克蛋白70（HSPT0）基因的真核表达载体pcDNA3．-1hMAM-HSF70,为乳腺癌的基因治疗奠定基础。方法采用PCR法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,与人HSPT0基因克隆人真核表达载体pcDNA3．1,构建重组载体pcDNA3．1-hMAM-HSPT0,采用电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA法检测目的基因的表达。结果成功扩增HSPT0与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSPT0的融合基因,COS-7细胞中可检测到hMAM表达;重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗HSP70抗体。结论hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功;此为进一步进行乳腺癌的基因治疗提供了实验依据。     

氧化应激所致C2C12肌源细胞核仁损伤的分子机制

目的探讨氧化应激诱导细胞核仁损伤的分子机制.方法向传代培养的C2C12肌源细胞中加入0.5mmol/L过氧化氢以模拟氧化应激.结果甲苯胺兰染色发现正常C2C12细胞可见一个位于中央的,浓染致密的核仁颗粒.过氧化氢处理后3h,可见明显的核仁分离,处理6h最为明显.细胞总蛋白质合成能力分析发现过氧化氢处理后6h细胞总蛋白质合成能力显著下降(与正常对照比P＜O.05),并持续至24h.免疫印迹检测核仁素(又称C23)发现,过氧化氢处理1h后可见-80kDa条带,而其110kDa主带明显减弱,过氧化氢处理6h和12h最为明显.用脂质体将核仁素反义核酸导入细胞后24h,免疫印迹发现核仁素表达明显被抑制,同时也可观察到细胞总蛋白合成能力下降及明显的核仁分离.结论氧化应激通过诱导核仁蛋白质核仁素的裂解并使其110kDa全长分子的量减少,而导致C2Cl2细胞核仁损伤.     

弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70复合基因真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒。方法根据HSP70基因序列,设计合成HSP70基因的引物,PCR扩增HSP70基因片段,克隆入pMD18-T载体,再经酶切、连接等,亚克隆至pcDNA3-ROP2-p30表达重组质粒中,并进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 PCR扩增出长度为916bp的HSP70基因片段,将其克隆到pMD18-T中,成功亚克隆获得pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒。测序结果显示,pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒包含了HSP70蛋白基因完整序列。结论成功构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒,为下一步核酸疫苗的研究奠定了基础。     

HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module

AIM: To investigate the possible mechanism by which hepatitis B virus X protein (HBx) mediates apoptosis of HepG2 cells.METHODS: HBx expression vector pcDNA3.1-X was transfected into HepG2 cells to establish an HBx high-expression cellular model as pcDNA3.1-X transfected group. The pcDNA3.1-X and pSilencer3.1-shHBX (HBx antagonist) were cotransfected into HepG2 cells to establish an HBx low-expression model as RNAi group. Untransfected HepG2 cells and HepG2 cells transfected with negative control plasmid were used as controls. Apoptosis rate, the expression of Fas/FasL signaling pathway-related proteins and the phosphorylation levels of MLK3, MKK7 and JNKs, which are upstream molecules of death receptor pathways and belong to the family of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), were measured in each group.RESULTS: Compared with HepG2 cell group and RNAi group, apoptosis rate, the expression of Fas and FasL proteins, and the activation of MLK3, MKK7 and JNKs were increased in the pcDNA3.1-X transfected group. The activation of JNKs and expression of FasL protein were inhibited in the pcDNA3.1-X transfected group when treated with a known JNK inhibitor, SP600125. When authors treated pcDNA3.1-X transfected group with K252a, a known MLK3 inhibitor, the activation of MLK3, MKK7 and JNKs as well as expression of FasL protein was inhibited. Furthermore, cell apoptosis rate was also significantly declined in the presence of K252a in the pcDNA3.1-X transfected group.CONCLUSION: HBx can induce HepG2 cell apoptosis via a novel active MLK3-MKK7-JNKs signaling module to upregulate FasL protein expression.     

Potential involvement of heat shock proteins in pancreaticduodenal homeobox-1-mediated effects on the genesis of gastric cancer: A 2D gel-based proteomic study

AIM To identify functional proteins involved in pancreaticduodenal homeobox-1(PDX1)-mediated effects on gastric carcinogenesis.METHODS A PDX1-overexpressed model was established by transfecting gastric cancer cell line SGC7901 with pcDNA3.1(+)-PDX1 vector(SGC-PDX1). Transfection with empty pcDNA3.1 vector(SGC-pcDNA) served as control. Comparative protein profiles of the two groups were analyzed by two-dimensional electrophoresis basedproteomics(2 DE gel-based proteomics). The differential proteins identified by 2 DE were further validated by qRTPCR and immunoblotting. Finally, co-immunoprecipitation was used to determine any direct interactions between PDX1 and the differential proteins.RESULTS2 DE gel proteomics identified seven differential proteins in SGC-PDX1 when compared with those in SGC-pcDNA. These included four heat shock proteins(HSPs; HSP70 p1 B, HSP70 p8, HSP60, HSP27) and three other proteins(ER60, laminin receptor 1, similar to epsilon isoform of 14-3-3 protein). Immunoblotting validated the expression of the HSPs(HSP70, HSP60, HSP27). Furthermore, their expressions were lowered to 80%, 20% and 24%, respectively, in SGC-PDX1, while PDX1 exhibited a 9-fold increase, compared to SGC-pcDNA. However, qRT-PCR analysis revealed that mRNA levels of the HSP s were increased in SGC-PDX1, suggesting that the expression of the HSP s was post-translationally regulated by the PDX1 protein. Finally, co-immunoprecipitation failed to identify any direct interaction between PDX1 and HSP70 proteins.CONCLUSION This study demonstrates the potential involvement of HSPs in PDX1-mediated effects on the genesis of gastric cancer.     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。     

Kruppel样因子4过表达对C2C12肌原细胞中热休克蛋白25表达的影响

目的观察Kruppel样因子4过表达对热休克蛋白25表达的影响。方法运用稳定转染pcDNA3.1/myc-His(-)和Kruppel样因子4-pcDNA3.1/myc-His(-)两种细胞株,采用逆转录聚合酶链反应观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25 mRNA表达的影响;采用Western blot观察Kruppel样因子4在生理状态和热休克反应时对热休克蛋白25蛋白表达的影响。结果在正常状态下,两种细胞热休克蛋白25 mRNA及蛋白表达水平均较低。生理状态下,热休克恢复1 h及3 h Kruppel样因子4过表达细胞株热休克蛋白25 mRNA表达水平明显高于转空载体细胞;至热休克恢复6 h后两组细胞热休克蛋白25 mRNA表达无明显差异。在生理状态及热休克恢复不同时间后,Kruppel样因子4过表达细胞热休克蛋白25蛋白表达水平均较空载体组明显增加。结论在生理状态下和热休克反应中,Kruppel样因子4过表达均能够促进C2C12肌原细胞中热休克蛋白25高表达。     

弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究

目的 构建弓形虫多基因核酸疫苗, 评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白 （HSP70） 基因片段, 克隆到 pcDNA3?ROP2?p30重组质粒中, 构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠, 检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+ 、 CD8+ , 血清、 脾淋巴细胞培养液中IgG、 IgM、 IgA和IFN?γ、 TNF、 IL?2、 IL?4、 IL?12等, 并进行弓形虫攻击感染实验。结果 应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段, 成功构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70重组体, 其中包含 HSP70 蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫, 实验组小鼠血清抗体滴度高, CD4+ 和 CD8+ 均增殖明显, 组间差异有统计学意义（FCD4+ =45.00, FCD8+ =15.01, P均＜0.01）; 其血清及脾细胞培养液中IFN?γ、 IL?2和IL?12含量均明显升高, 尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示, 实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性, 能产生较好的免疫保护作用。