基于ITS2序列鉴定苗药金铁锁及其混伪品

目的：本研究利用ITS2序列对苗药金铁锁及其混伪品进行鉴定研究,从而确保药材质量,保障临床用药安全。方法：提取金铁锁药材及其混伪品基因组DNA,PCR扩增并双向测序获得ITS2序列。所有序列经过CodonCode Aligner V3.7.1拼接后,采用MEGA5.1软件进行序列比对,计算种内和种间Kimura2-Parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。采用相似性搜索法、最近距离法、邻接（NJ）树法对ITS2序列鉴定能力进行评估。结果：金铁锁药材的ITS2序列长度为229 bp,其ITS2序列种内最大K2P遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P遗传距离;应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定金铁锁药材及其混伪品;基于ITS2序列构建NJ树,金铁锁及其混伪品均表现出良好单系性,均能明显区分。结论：ITS2序列能够稳定、准确地鉴定金铁锁药材及其混伪品,DNA 条形码技术可为金铁锁药材及其混伪品的鉴定提供新的方法。     

沉香DNA的提取及其ITS2-PCR体系的优化

目的:建立沉香的总DNA提取方法及r DNA第二内转录间隔区序列(ITS2)聚合酶链式反应(PCR)扩增体系。方法:分别采用改良的CTAB法、改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法及DNA提取试剂盒法提取沉香总DNA,利用通用引物ITS2P1/ITS2P2扩增r DNA ITS2目的片段,通过正交试验优选沉香的PCR扩增条件并对目的片段进行测序。结果:改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法提取总DNA的A260 nm/A280 nm1.79,质量浓度350 mg·L-1,PCR扩增目的片段产率最高。不同因素水平对沉香ITS2-PCR反应的影响顺序为模板DNA引物Taq DNA聚合酶d NTP。最佳反应体系为20μL体系,DNA模板40 ng,引物0.2 mmol·L-1,d NTP 0.5 mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.5 U。测序获得的目前片段长度230 bp,与Gen Bank中瑞香科沉香属白木香序列相似性100%。结论:CTAB法联合DNA试剂盒法可简单、快速获得高质量沉香总DNA,正交试验可快速获得ITS2目的片段,为沉香的分子鉴定和系统发育分析提供参考。     

中药材半夏及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的：采用ITS2序列对中药材半夏及其混伪品进行DNA条形码鉴定研究,为规范中药材半夏的市场流通,保障临床用药安全及疗效提供参考依据。方法：对半夏及其混伪品共59份样品,通过DNA提取及聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用邻接（NJ）法构建NJ系统聚类树。采用相似性搜索法、最小距离法、NJ 树法考察ITS2序列的鉴定能力。结果：半夏药材的ITS2序列长度为251 bp,应用相似性搜索法表明ITS2序列能够准确鉴定半夏药材及其混伪品;半夏种内最大K2P距离小于半夏与混伪品间的最小K2P距离;NJ树显示半夏药材可与其混伪品明显分开。结论：ITS2序列能准确、稳定鉴定中药材半夏药材及其混伪品。     

党参药材及其混伪品的ITS/ITS2条形码鉴定研究

为简便有效地鉴定党参药材及其混伪品并验证ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码鉴定药材的稳定性和准确性,本研究选用党参药材及其混伪品作为研究对象,对33 份药材样本提取基因组DNA,通过PCR 扩增ITS 序列,采用比对法、最小距离法对序列鉴定能力进行评估。通过序列比对,分析变异位点信息确定不同的单倍型并计算种内和种间K2P 距离。ITS2 序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer（Hidden Markov Model）注释方法获得。结果表明,党参药材3 个基原物种ITS 序列长度为654-655 bp,ITS2 序列长度均为239 bp,ITS/ITS2 序列种内平均K2P 遗传距离均远小于其与混伪品的种间平均K2P 遗传距离,因此ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码能稳定、准确鉴别党参药材及其混伪品,为其鉴定提供新的技术手段。     

基于ITS2 条形码序列鉴定中药材两头尖及其混伪品

目的：本研究利用ITS2 序列对中药材两头尖及其混伪品进行DNA 条形码鉴定,以确保该药材的质量及临床疗效。方法：采用试剂盒法对36 份样品提取DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其ITS2 序列并双向测序,所得序列经过CodonCode Aligner 拼接后,用软件MEGA5.1 进行数据分析,包括变异位点分析、种内种间距离计算及系统发育树构建。结果：两头尖药材的ITS2 序列长度为216 bp,种内最大K2P 距离为0.014,种间的最小K2P 距离为0.021;NJ 树结果显示两头尖与其混伪品可明显区分,表现出良好的单系性。结论：ITS2 序列作为DNA 条形码能稳定、准确鉴别两头尖药材,为其鉴定提供新的技术手段。     

基于DNA条形码的三种沉香属物种鉴定研究

目的:利用5个DNA条形码(ITS、matK、rbcL、psbA-trnH和trnL-trnF)对3个沉香属物种白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre进行分子鉴定,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。方法:使用改良CTAB法提取沉香属植物的总DNA,分别对5个条形码序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增与测序。序列经DNAStar软件拼接,MEGA 7.0软件比对分析及计算相关数据,基于K2P模型构建系统发育树。结果:各条形码序列均被成功扩增与测序,其中trnL-trnF由于含有寡核苷酸重复序列而导致测序序列质量低。ITS及matK均能提供较多遗传信息,但在系统发育树中无法准确区分白木香、马来沉香和Aquilaria crassna Pierre这3个物种,而ITS+matK的组合能准确分辨上述物种。结论:ITS+matK组合序列可以用来鉴别沉香属物种,为沉香属药材的种类鉴定和种间分类地位提供分子生物学依据。     

ITS2序列对牛樟等樟属植物鉴定评估及聚类分析研究

目的:应用ITS2序列及其二级结构对牛樟等樟属植物进行鉴定效率评估及聚类分析研究,以期发现与牛樟亲缘关系较近的物种。方法:比较DNA提取试剂盒和改良CTAB法对牛樟等样品总DNA的提取效果;应用Bio Edit v7.0.9.0与MEGA 6.0软件将以ITS2序列进行PCR扩增的目的序列与Gen Bank中同源性较高的同属序列构建系统进化树,并应用ITS2数据库网站预测其二级结构。结果:改良CTAB法提取的DNA纯度比试剂盒稍低,但浓度较高;针对本研究中16个樟属样品,ITS2对其鉴定成功率为62.5%;基于ITS2序列的种间亲缘关系中最接近牛樟的树种为细毛樟。结论:ITS2序列作为植物鉴定条形码之一,对樟属植物鉴别率略低,可见其通用性有待考证;在对于樟属植物的聚类分析研究中,ITS2序列可结合其二级结构构型,为樟属种间遗传关系和亲缘关系鉴定提供参考。     

基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定

目的：基于内转录间隔区（ITS）序列,运用DNA条形码技术对滇鸡血藤药材及其混伪品进行序列比对分析,根据单核苷酸多态性位点构建滇鸡血藤单倍型数据库,建立快速、准确鉴定滇鸡血藤的分子鉴定方法。方法：以滇鸡血藤及其混伪品为材料,利用DNA提取试剂盒,分别提取滇鸡血藤及其混伪品的总DNA,对ITS序列进行聚合酶链式反应扩增及测序分析,使用DNAMAN软件统计其片段长度及变异位点个数,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算Kimura2-parameter遗传距离,并利用邻接法建立系统发育树进行分析。结果：滇鸡血藤ITS序列片段长度为675 bp,共包括19种单倍型,与其主要混伪品的差异位点为212、223、224 bp,系统发育树显示,ITS序列能够区分滇鸡血藤及其混伪品。结论：ITS条形码可以作为区分鉴定滇鸡血藤及其混伪品的分子条形码,包含19个单倍型的单倍型数据库覆盖了滇鸡血藤全部的单倍型。     

基于ITS2序列鉴定金樱子及其伪品

目的：本文选用金樱子作为研究对象验证DNA 条形码鉴定中药材的稳定性及准确性。方法：通过改良的CTAB 法提取10 份样品的基因组DNA,扩增得到ITS2 片段。将得到的片段进行双向测序,运用软件CodonCode Aligner 进行拼接,其它6 份样品来源于GenBank。将金樱子与混伪品ITS2序列应用MEGA 5.0 软件进行序列比对,计算种内、种间距离,构建邻接树（neighbor-joining tree, NJ Tree）。结果：金樱子药材ITS2 序列长度为219~221 bp,存在两个Poly C 结构。金樱子种内平均Kimura 2-parameter（K-2-P）遗传距离为0.005,远小于与混伪品的种间平均K-2-P 遗传距离0.574。NJ 树结果表明金樱子与混伪品分为两枝,Bootstrap 支持率为99%,表现出良好的单系性。结论：ITS2序列作为DNA 条形码能准确稳定的鉴别金樱子药材,本研究为保证金樱子临床用药安全提供了技术保障。     

基于ITS2序列的杜仲及其主要混伪品的鉴定

目的 分析杜仲及其混伪品的ITS2条形码序列,探讨杜仲及其混伪品鉴定的新方法,为杜绝市售商品药材混乱现象提供技术支撑。方法 提取样品DNA,利用PCR方法对样品进行核基因ITS2 片段扩增,采用DNA克隆测序技术对ITS2基因进行双向测序,所得序列经Seqman程序拼接后,用软件MEGA 4.1进行相关数据分析,并构建邻接（Nighbor-joining, NJ）树。利用网站已建立的ITS2数据库预测ITS2二级结构。结果 杜仲种内最大K2P遗传距离远远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;由构建的系统聚类树图可以看出,不同来源的杜仲样品聚成一支,表现为单性系,并与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,杜仲与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴别杜仲及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物

本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序;同时扩大研究范围,从GenBank上下载川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列。用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,最后利用ITS2序列重构其系统发育树。结果显示川贝母基原植物种内最大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间最小K-2-P距离为0.0583;川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分。研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具。     

基于ITS2序列的中药材苍术种苗DNA条形码鉴定

目的:建立基于DNA条形码技术的中药材苍术种苗鉴定方法。方法:收集中药材苍术及其易混品原植物样品28份,构建苍术种苗鉴定参考核糖体内部转录间隔区2(ITS2)条形码数据库。从河北、山东、山西、内蒙古、辽宁及湖北等苍术主产地收集苍术种苗52份。通过提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增,双向测序获得其ITS2条形码序列。应用PUAP 4.0软件计算种内、种间遗传距离,利用MEGA 7.0软件构建邻接树,对中药材苍术种苗进行DNA条形码鉴定。结果:中药材苍术及其易混品原植物ITS2条形码序列具有稳定的序列差异,邻接树呈现单系性,可以明显区分苍术及其易混品;基于标准参考数据库,42份苍术种苗为朝鲜苍术(80.8%),7份苍术种苗为苍术(13.5%),3份苍术种苗为白术(5.7%)。结论:基于ITS2序列可以准确区分中药材苍术及其混伪品种苗。苍术种苗基原物种鉴定结果以朝鲜苍术为主,提示苍术临床用药存在潜在安全风险。     

基于ITS2序列的东北透骨草及其混伪品DNA分子鉴定

目的应用ITS2条形码鉴定东北透骨草及其混伪品,为东北透骨草药材鉴定提供新方法。方法提取35份东北透骨草及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载13种东北透骨草及其混伪品ITS2序列42条;对提交与下载的77条序列,应用MEGA7.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离,构建Neighber-jioning(NJ)系统进化树,并预测ITS2二级结构。结果东北透骨草3种基原的种内最大K2P遗传距离均远远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;NJ树结果显示东北透骨草及其混伪品药用植物均可明显区分,表现出良好的单系性;比较ITS2二级结构发现,东北透骨草与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别东北透骨草,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定

目的对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法利用PCR测序法,对样品进行核基因ITS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建邻接(NJ)树。利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228 bp,二者种内平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

维吾尔药材新疆圆柏DNA 条形码鉴定研究

目的：本研究采用形态学与DNA 条形码技术,建立维吾尔药材新疆圆柏Juniperus sabina L.及其混伪品的鉴别方法。方法：随机选择不同产地新疆圆柏及其混伪品的叶片和果实,比较外观差异;采用ITS2 序列对新疆圆柏及其混伪品10 份样品进行PCR 扩增并测序,结合GenBank 获得4 条侧柏ITS2序列,比较14 份样品ITS2 序列种内和种间变异,采用K2P 模型构建NJ 系统树。结果：4 种植物叶片和果实外观相态均有相似之处;DNA 条形码ITS2 序列鉴定结果显示,14 份研究样品ITS2 序列长度均为219 bp,种间最大K2P 距离为0.089。结论：ITS2 序列及NJ 树可将新疆圆柏与3 种混伪品植物区分,为维吾尔药材新疆圆柏的标准化奠定基础。     

药用昆虫金环胡蜂及其混伪品DNA条形码鉴别研究

目的：以COI序列作为DNA条形码对药用昆虫金环胡蜂及其混伪品进行物种鉴别,探讨快速、准确鉴别金环胡蜂及其混伪品的方法。方法：以COI条形码序列为基础,对金环胡蜂及其近缘种混伪品黄纹大胡蜂进行总DNA提取、PCR扩增和双向测序,并比对GenBank中金环胡蜂及其混伪品的COI序列,继而用MEGA6.06软件对所有序列进行分析、计算种内及种间遗传距离,并用邻接（Neighbor-Joining,NJ）法构建出系统进化树。结果：金环胡蜂及黄纹大胡蜂COI序列扩增成功。金环胡蜂与其混伪品COI序列种间最小遗传距离为0.152±0.017,远大于金环胡蜂种内的最大遗传距离0.009±0.004。构建出的系统进化树图也明确显示,各物种都形成了独立的分支。结论：基于COI序列的DNA条形码技术可有效鉴别药用昆虫金环胡蜂及其混伪品,为其质量控制和市场监管提供了新的技术手段,保证金环胡蜂相关药材的安全性。     

王不留行种子的ITS2序列分子鉴定研究

目的：基于ITS2序列对中药材王不留行种子及其混伪品进行鉴定研究,为王不留行种子及其混伪品的鉴定提供新方法。方法：对王不留行种子及其混伪品样品提取基因组DNA、PCR扩增、双向测序获得ITS2序列。应用MEGA 6.0软件计算种内、种间遗传距离,构建邻接树,基于自行编写的代码和开源代码 PHP QR Code的编码方式,将王不留行及其混伪品 ITS2序列转换为条形码图片,获得各物种二维DNA条形码图片,并在中药材DNA条形码鉴定系统（www.tcmbarcode.cn）对所获得ITS2序列进行分析鉴定。结果：王不留行药材ITS2序列长度为219-221bp,种内最大K2P遗传距离为0.009,小于其与混伪品的种间K2P遗传距离,王不留行及其混伪品ITS2序列间存在的变异位点较多。NJ树结果表明王不留行与其混伪品分别聚为一支,可明显区分。结论：ITS2序列可以准确鉴别王不留行种子,为其种质资源鉴定和中药材种子质量标准的建立提供了新方法,将获得的ITS2序列转换为二维DNA条形码可为王不留行药材流通管理提供便利,为保障王不留行临床用药安全提供了新的技术手段。