低氧培养增强骨髓源内皮祖细胞的增殖、黏附、迁移和生存能力

目的评估低氧(1%和5%氧浓度)环境对骨髓源内皮祖细胞及其促血管新生相关的增殖、黏附、迁移和生存能力的影响。方法利用密度梯度离心技术分离SD大鼠骨髓单个核细胞,向内皮祖细胞进行诱导分化、扩增、培养和鉴定。然后在不同氧浓度(1%、5%和21%)的环境中继续培养,于第3天和第7天时检测不同氧浓度下培养细胞的增殖能力、黏附能力、迁移能力及生存能力。结果内皮祖细胞在不同氧浓度(1%、5%及21%)的培养箱中培养时,无论是培养至第3天或是第7天时,1%和5%氧浓度下培养细胞的增殖能力、黏附能力、迁移能力及生存能力均明显优于21%氧浓度培养的细胞(均P0.05);除了第3天时5%氧浓度下培养细胞的增殖能力优于1%氧浓度下培养细胞(P0.05)以及第3天的黏附能力及第7天时在1%和5%氧浓度下培养细胞的增殖能力比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余(黏附能力、迁移能力及生存能力)无论是培养至第3天或是第7天均是1%氧浓度下培养细胞优于5%氧浓度(均P0.05)。结论不同氧浓度对骨髓源内皮祖细胞增殖、黏附、迁移以及生存(抗凋亡和死亡)能力产生不同的影响,与21%氧浓度相比,适当时间的相对低氧浓度(1%和5%)培养能够显著增强内皮祖细胞的增殖、黏附、迁移及生存能力。     

衰老对大鼠阴茎海绵体NOS I的表达和NOS活性的影响

目的 :探讨衰老对大鼠阴茎海绵体一氧化氮合酶Ⅰ (NOSⅠ)mRNA、蛋白的表达和NOS活性的影响。　方法 :30只雄性SD大鼠按不同月龄分为成年组、老年组和衰老组 ,应用Western印迹、RT PCR方法分别检测不同年龄组阴茎海绵体NOSⅠ蛋白及mRNA的表达 ;用紫外分光光度计测定不同年龄组阴茎海绵体NOS的活性。　结果 :成年组NOSⅠ 蛋白的表达量最高 ,老年组和衰老组显著降低 ,分别为成年组的 75 .6 %和 6 1.2 % ;NOSⅠmRNA的表达与蛋白表达的变化一致 ;老年组NOS活性与成年组差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,衰老组NOS活性明显降低 ,是成年组的70 .4 % ,并且差异非常显著 (P <0 .0 1)。　结论 :衰老引起NOSⅠ 蛋白及mRNA的表达降低和NOS活性的显著降低 ,可能是老年性阴茎勃起功能障碍的主要机制之一。     

衰老对大鼠阴茎海绵体NOSⅠ的表达和NOS活性的影响

目的 :探讨衰老对大鼠阴茎海绵体一氧化氮合酶Ⅰ (NOSⅠ)mRNA、蛋白的表达和NOS活性的影响。　方法 :30只雄性SD大鼠按不同月龄分为成年组、老年组和衰老组 ,应用Western印迹、RT PCR方法分别检测不同年龄组阴茎海绵体NOSⅠ蛋白及mRNA的表达 ;用紫外分光光度计测定不同年龄组阴茎海绵体NOS的活性。　结果 :成年组NOSⅠ 蛋白的表达量最高 ,老年组和衰老组显著降低 ,分别为成年组的 75 .6 %和 6 1.2 % ;NOSⅠmRNA的表达与蛋白表达的变化一致 ;老年组NOS活性与成年组差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,衰老组NOS活性明显降低 ,是成年组的70 .4 % ,并且差异非常显著 (P <0 .0 1)。　结论 :衰老引起NOSⅠ 蛋白及mRNA的表达降低和NOS活性的显著降低 ,可能是老年性阴茎勃起功能障碍的主要机制之一。     

低氧诱导因子-1α激动剂对内皮祖细胞生物学行为的影响

目的 观察低氧诱导因子-1α( HIF-1α)的激动剂对兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)的增殖和功能的生物学影响.方法 以不同浓度的HIF-1α的激动剂二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)干预EPCs,检测其增殖活性、集落形成能力、一氧化氮(NO)的产量、迁移能力、衰老状态、成血管功能及相关蛋白的表达.结果DMOG能显著激活EPCs中HIF-1α蛋白表达,增加细胞的活性,且成剂量依赖关系,其中浓度500 μmol/L时增殖作用达到峰值.同时DMOG增加EPCs集落形成能力(P＜0.01),抑制细胞的衰老(P＜0.05),并显著提高EPCs的的迁移能力和体外成血管功能.结论 HIF-1α的激活剂能显著提高内皮祖细胞增殖能力、集落形成能力、迁移能力和成血管功能.     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶基因表达和活性的抑制作用及其增殖、凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞端粒酶基因表达、活性的抑制作用及对肾癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的siRNA(100nmol/L)转染肾癌7860细胞,采用RTPCR检测7860细胞端粒酶mRNA表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学TUNEL法检测细胞凋亡。结果hTRsiRNA处理组7860细胞端粒酶mRNA表达(40.7±1.5)%降低,端粒酶活性(32.7±2.3)%降低,细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%增加,凋亡细胞阳性率(39.4±0.6)%增加。分别与阴性siRNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论siRNA能抑制人肾癌细胞端粒酶mRNA表达及活性,进而抑制其增殖、促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

体外诱导小鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化相关基因表达的研究

目的体外培养小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化为成骨细胞,定量分析其骨生成关键标志基因的表达水平。方法体外培养小鼠BMSCs 7、14、21 d,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPIN)和骨唾液酸蛋白(BSP)基因的表达水平。结果小鼠BMSCs体外稳定增殖和分化,Ⅰ型胶原培养14 d和21 d mRNA水平分别是培养7 d时的0．75±0．04倍和(0．34±0．03)倍;ALP、OPN和BSP基因表达水平随着培养时间延长而上升,其中培养21 d时的ALP、OPN和BSP mRNA水平分别是培养7 d时的(19．70±2．36)倍、(150．12±9．31)倍和(7．73±0．58)倍。结论荧光定量RT-PCR可以灵敏地检测成骨细胞关键标志基因表达水平,随着培养时间延长,Ⅰ型胶原的表达水平逐渐下降,而ALP、OPN和BSP的表达水平显著上升。     

体外诱导小鼠骨髓干细胞转化为肝细胞的实验研究

目的模拟体内肝脏发生发育的环境和条件，建立以细胞因子为主的体外诱导培养体系，探讨骨髓干细胞体外转化肝细胞的可行性。方法获取小鼠骨髓干细胞，建立以细胞因子为细胞诱导的培养体系。在细胞培养过程中，观察细胞形态和数量，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测肝细胞特异性基因的表达。Western blot和流式细胞仪检测ALB和CK18在蛋白水平的表达情况。糖元染色法行细胞糖原染色、尿素合成试验检测细胞的合成和代谢功能。结果在诱导培养12d，可以观察到多极性的肝细胞样细胞。且细胞逐渐增多、集落不断增大。诱导细胞在培养7d开始表达AFP mRNA并维持到第21天。此后表达逐渐减弱；培养7天开始表达ALB mRNA和CK18 mRNA。随着培养时间的延长表达不断增强；培养14d开始表达TTR mRNA，随着培养时间的延长表达不断增强。通过Western blot检测，诱导21d的细胞表达ALB和CK18蛋白，流式细胞术分析ALB阳性细胞的比例为60．45％，CK18阳性细胞的比例为67％。诱导培养21d，细胞胞浆内可见红染的糖原颗粒；诱导培养6d，细胞开始合成尿素，尿素合成功能随诱导时间的延长而增强，于第15天达到高峰。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系能促使骨髓干细胞定向转化为肝细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

PAX6基因过表达促进大鼠骨髓内皮祖细胞向角膜内皮细胞分化

目的 通过研究大鼠骨髓内皮祖细胞转染PAX6基因后角膜内皮细胞相关特征性基因的表达,探讨其作为角膜内皮细胞移植的种子细胞的可能性.方法 采用密度梯度离心法分离出大鼠骨髓单核细胞,接种到纤连蛋白铺层的细胞皿,以EGM-2培养液选择培养,获得大鼠骨髓内皮祖细胞.通过免疫荧光染色检测CD31、CD34、CD133、LDL、U...     

辛伐他汀对大鼠骨量及骨髓基质干细胞增殖、分化的影响

目的观察辛伐他汀体内给药对大鼠骨量和骨髓基质干细胞增殖、分化的影响。方法16只9周龄雌性SD大鼠按体重随机分成2组,每组8只：第1组（G1）,对照组,每天蒸馏水灌胃（N）;第2组（G2）,实验组,辛伐他汀灌胃20mg·kg^-1·d^-1（S20）,持续3周,于最后1次灌胃的第2天处死所有大鼠,取右侧股骨行骨密度和骨组织形态计量学测定;取左侧股骨和胫骨骨髓细胞分别向成骨、成脂方向诱导培养,并作如下检测：（1）成骨组：采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测定向成骨分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第16d和28d分别检测碱性磷酸酶（ALP）比活性、ALP染色和von Kossa染色;细胞培养第16d,提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、碱性磷酸酶（ALP）、破骨细胞分化因子（RANKL） mRNA的表达;（2）成脂组：采用CCK-8法检测定向成脂分化中的骨髓基质干细胞的增殖能力;细胞培养第18d,检测LPL比活性,并提取总RNA,采用Real-time RT-PCR检测脂蛋白脂酶（LPL） mRNA的表达。结果辛伐他汀体内给药干扰21d后大鼠骨量和骨密度无显著变化。体外培养骨髓基质干细胞所有检测基因 mRNA水平、细胞增殖能力、矿化能力（von Kossa染色）、ALP比活性、ALP染色、LPL比活性两组间差异均无显著性。结论辛伐他汀体内给药3周对大鼠骨量及骨髓基质干细胞的增殖和分化无显著作用。     

血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对大鼠外周血内皮祖细胞培养的影响

目的 探讨不同培养条件对大鼠外周血来源内皮祖细胞（EPC）生长情况的影响。 方法 密度梯度离心法获得大鼠外周血单个核细胞,根据培养基中是否添加血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及培养板是否预铺纤连蛋白（FN）分组培养。观察记录细胞生长情况并进行统计分析,以免疫组化和免疫荧光法进行鉴定。 结果 大鼠外周血来源的单个核细胞在体外呈现贴壁生长,培养第7天各组细胞数及细胞集落数提示,在相同培养条件下,预铺FN可以促进EPC的贴壁增殖（t = 4.43,P < 0.05;t = 3.70,P < 0.05）。在同样预铺或未铺FN的情况下,在培养液中加入生长因子可促使单个核细胞更好地向EPC分化（t = －10.96,P < 0.01;t = －13.22,P < 0.01）。免疫组化及免疫荧光结果显示,细胞培养第4、7、10天,细胞表面CD34、CD133表达不断增强[（35.7±4.2）%、（60.1±3.8）%、（81.8±6.4）%;（3.2±0.9）%、（18.4±7.3）%、（32±3.8）%],第14天下降[（32.1±5.4）%,（1.9±2.7）%];而Flk-1表达在第4、7、10、14天均不断增强[（31.2±3.5）%、（40.6±5.3）%、（71.2±8.4）%、（81.5±4.1）%]。 结论 FN有利于内皮祖细胞的贴壁生长和增殖。VEGF及bFGF促进其增殖分化。内皮祖细胞的体外成功培养将为其应用于血管组织工程提供足够数量的种子细胞来源,并为外周血干细胞移植治疗多种疾病提供新的思路。     

内皮型一氧化氮合酶基因体外转染对犬内皮祖细胞功能的影响

目的探讨人内皮型一氧化氮合酶基因(heNOS)转染对犬骨髓源内皮祖细胞(EPC)功能的影响。方法用携带heNOS基因的5型腺病毒作为载体(Ad5-heNOS),对体外定向培养扩增的骨髓源犬EPC进行转染,以未转染的犬EPC作为对照。用酶联免疫吸附试验(ELISA)和硝酸还原酶法检测转染后的EPC中heNOS蛋白的表达和NO的产量,并检测转染后EPC的增殖、黏附、迁移、抗衰老和成血管能力等功能。结果 Ad5-heNOS转染48 h后,转染组EPC的eNOS蛋白表达量和NO产量均明显高于未转染组[(2091.67±172.489)pg/mL vs.(158.00±30.914)pg/mL;(49.5±5.16)μmol/Lvs.(39.7±7.24)μmol/L](均P<0.01);转染组EPC的细胞增殖数、黏附数、迁移数均明显高于未转染组(0.52±0.03 vs.0.31±0.02;28.00±1.41 vs.11.83±1.45;109.67±6.95 vs.72.67±6.29)(均P<0.01),而衰老细胞百分数明显低于未转染组(0.22±0.02 vs.0.32±0.01)(P<0.01);转染heN...     

疏肝活血方含药血清对内皮祖细胞数量及功能的影响

目的：观察疏肝活血方含药血清对大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）数量及功能的影响。方法：从大鼠骨髓中获取单个核细胞,体外培养9d后,收集贴壁细胞,加入低、中、高浓度的疏肝活血方及其拆方的含药血清,培养12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数,分别采用黏附能力测定、MTT比色法及改良的Boyden小室实验来观察疏肝活血中药对EPCs黏附能力、增殖能力和迁移能力的影响,用流式细胞仪检测PI-/AnnexinⅤ＋的凋亡细胞。结果：疏肝活血方能明显促进EPCs的分化,提高EPCs的数量,明显改善EPCs的黏附、增殖及迁移能力,减少EPCs的凋亡率,中浓度组培养24h达到作用的高峰（P〈0.01）。结论：疏肝活血方能促进EPCs数量的增加、功能的改善,减少EPCs的凋亡。     

鼠ho-1真核表达载体的构建、鉴定及其在骨髓来源的内皮祖细胞中的表达

目的 制备高效表达的血红素氧合酶(HO)-1基因修饰的骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs).方法 应用基因重组的方法构建ho-1真核表达质粒pCMV-Tag 2B/ho-1,用脂质体将其转入骨髓来源的EPCs,用荧光显微镜和Western blot等方法检测HO-1蛋白的表达.结果 (1)逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)产物电泳结果,质粒菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定结果证实ho-1真核表达质粒构建成功;(2)根据体外培养的骨髓来源的EPCs形态学变化,细胞的CDI33、CD34和VwF免疫组织化学染色鉴定,VEGF诱导后LDL、UEA双染鉴定等证实所分离的细胞为EPCs;(3)vegfa转染P3代EPCs后细胞内荧光明显增强,Western blot检测显示转染细胞HO-1蛋白抗体结合蛋白出现明显印迹条带.结论 成功制备表达外源性基因ho-1的骨髓来源的EPCs,制备方法可行.     

Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro.

Much attention has been given to the influences of bioactive factors on mesenchymal progenitor cell differentiation and proliferation, but few studies have examined the effect of mechanical factors on these cells. This study examined the effects of cyclic hydrostatic pressure on human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells undergoing chondrogenic differentiation. Aggregates of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells were cultured in a defined chondrogenic medium and were subjected to cyclic hydrostatic pressure. Aggregates were loaded at various time points: single (day 1 or 3) or multiple (days 1-7). At 14 and 28 days, aggregates were harvested for histology, immunohistochemistry, and quantitative DNA and matrix macromolecule analysis. The aggregates loaded for a single day did not demonstrate significant changes in proteoglycan and collagen contents compared with the non-loaded controls. In contrast, for the multi-day loaded aggregates, statistically significant increases in proteoglycan and collagen contents were found on both day 14 and day 28. Aggregates loaded for seven days were larger and histological staining indicated a greater matrix/cell ratio. This study indicates that hydrostatic pressure enhances the cartilaginous matrix formation of mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro, and suggests that mechanical forces may play an important role in cartilage repair and regeneration in vivo.     

Endothelial progenitor cell proliferation and differentiation is regulated by erythropoietin

BACKGROUND: Circulating bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) promote vascular reparative processes. In humans, their number correlate with endothelial function and cardiovascular risk. We tested the hypothesis that darbepoetin alfa [i.e., a recombinant analogue of the cytokine erythropoietin (EPO)] stimulates proliferation and differentiation of EPCs. METHODS: We assessed CD34+ circulating stem cells (cSCs) in whole blood using flow cytometry and, in addition, proliferation/differentiation of EPCs in an in-vitro assay during 6 weeks of a standard darbepoetin therapy in eight patients with renal anemia. RESULTS: Darbepoetin treatment caused a significant increase in the number of CD34+ cSCs (week 2, 193%+/- 46%; and week 6, 298%+/- 90%; P < 0.05 vs. baseline). In addition, darbepoetin markedly increased the number of functionally active EPCs (week 2, 256%+/- 48%; and week 6, 299%+/- 59%; both P < 0.01 vs. baseline). The effect of darbepoetin on functional activity of EPCs assessed in a tube formation assay was dose dependent. Administration of darbepoietin caused activation of protein kinase B (Akt) in cultured EPCs. CONCLUSION: A standard treatment with darbepoetin markedly enhances EPC proliferation and differentiation in renal patients. The use of recombinant EPO analogues may be a novel and safe therapeutic approach in patients with vascular pathology.     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3~4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

环孢素A对抑制外周血内皮祖细胞增殖活性的作用

目的 观察环孢素A(CsA)对培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖和凋亡的影响.方法 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,贴壁培养获得EPCs.比色法测定EPCs增殖能力;TUNEL染色检测EPCs凋亡情况;逆转录聚合酶链法检测EPCs凋亡相关基因的表达.观察不同浓度的CsA对EPCs增殖能力的作用;用10 mg/L的CsA干预24 h和48 h对EPCS增殖能力的影响,以及干预48 h对EPCs凋亡以及凋亡蛋酶-3(easpase-3)、凋亡调控基因bcl2和bax表达的影响.结果 100μg/L的CsA能明显抑制EPCs的增殖,CsA在10～10000μg/L浓度范围内,抑制作用成浓度依赖性.10 mg/L的CsA明显增加EPCs的凋亡和caspase-3基因表达,抑制bcl2基因表达而减小bcl2/bax比值.结论 CsA能明显抑制培养的人外周血EPCs增殖、增加其凋亡;抑制bcl2基因表达是其诱导EPCs凋亡的机制之一.