腺相关病毒介导的小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1及基质金属蛋白酶13表达的影响

目的 观察以腺相关病毒(AAV)为载体含有针对金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1具有较强抑制作用的小干扰RNA(siRNA)感染大鼠星状细胞系HSC-T6后TIMP-1及基质金属蛋白酶13(MMP13)的表达情况.方法 将对大鼠TIMP-1基因具有最强抑制作用的一对siRNA,在体外构建为短发夹siRNA表达载体后,将其包装为重组AAV-rAAV/siRNA-TIMP-1/neo并感染HSC-T6,于感染后4周及12周应用荧光定量PCR方法及Western blot方法分别检测TIMP-1及MMP13 mRNA及蛋白质表达情况.结果 经PCR、酶切及序列测定证实抑制作用最强的1对siRNA在体外构建的shRNA表达载体成功克隆.将重组质粒包装成病毒后感染HSC-T6细胞,与对照组细胞相比,rAAV/siRNA-TIMP-1/neo感染组在感染后4周及12周细胞TIMP-1 mRNA及蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01),而MMP13 mRNA及蛋白质表达水平明显增高(P＜0.01).结论 化学合成的siRNA在短时期内可有效地抑制TIMP-1基因的表达,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可长期有效地抑制TIMP-1基因表达.     

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。     

肾母细胞瘤过度表达基因对大鼠肝星状细胞MMP-1和TIMP-1表达的作用研究

目的 构建能表达靶向肾母细胞瘤过度表达基因（NOV）的小干扰RNA（siRNA）的重组质粒，研究NOV对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达的影响。方法 以NOV为目的基因，以质粒psiRNA-hH1 neo为载体，构建能在真核细胞中表达的靶向NOV的siRNA的重组质粒psiRNA（psiRNA1、2、3）和阴性对照重组质粒pconsiRNA。限制性酶切和测序鉴定构建成功后，脂质体介导重组质粒转染HSC，依据转染质粒的不同将HSC分为psiRNA1组、psiRNA2组、psiRNA3组、阴性对照pconsiRNA组，并以未转染重组质粒的HSC为空白对照组。半定量RT-PCR检测HSC的NOV、MMP-1、TIMP-1 mRNA表达情况，MTT法检测细胞增殖。结果限制性酶切和测序鉴定表明成功构建了NOV siRNA表达质粒；与阴性对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC内NOV的mRNA表达水平下降（P〈0．05），MMP-1mRNA表达水平下降不明显（P〉0．05），而TIMP-1 mRNA表达水平明显下降（P〈0．05）。与空白对照组相比，转染外源重组质粒psiRNA2的HSC增殖活性显著降低（P〈0．05）。psiRNA1组、psiRNA3组的HSC内NOV、MMP-1和TIMP-1 mRNA的表达及HSC增殖活性均无明显下降（P均〉0．05）。结论NOV可促进HSC增殖及表达TIMP-1增加，而对MMP-1表达影响不大，提示NOV可以作为肝纤维化基因治疗的一个新的靶位点。     

乙型肝炎病毒X蛋白对MMPs及TIMPs的影响

目的全面分析乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis Bvirus Xprotein，HBx）对基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）及组织金属蛋白酶抑制物（Tissue Inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs）的影响，探讨其在肝细胞癌的侵袭转移中的可能作用。方法PCR扩增HBVX基因并克隆人真核表达载体pcDNA3．1／HisC，重组载体及空载体分别以Lipofectamine2000转染HepG2细胞并以800μg／mlG418筛选抗性细胞克隆。以Western blot检测抗性细胞HBx表达。抽提细胞总RNA，半定量RT-PCR检测MMPs及TIMPs。收集细胞培养液上清，以明胶酶谱检测MMP2及MMP9活性，反相明胶酶谱检测TIMPs活性。结果构建了HBx重组载体pcDNA3．1-XB。该重组载体及对照空载体转染HepG2细胞后，G418筛选，分别获得抗性细胞克隆HepG2-XB及HepG2-HIS，前者经Westernblot证实可表达HBx。半定量RT—PCR显示HBx可促进MMP2、7、13、14、16、17、19、23、24及TIMP1、4基因的转录，抑制MMP1、3、8、9、10、11、12、15、20及TIMP2、3基因的转录。明胶酶谱检测显示HBx可促进酶原MMP2（Pro—MMP2）及活性MMP9（Active—MMP9）表达，抑制酶原MMP9（Pro—MMP9）表达；反相明胶酶谱显示HBx可促进TIMP1、TIMP4的表达，同时抑制TIMP2及糖基化TIMP3的表达。结论HBx蛋白对MMPs、TIMPs转录表达的影响是多方面的，但这种影响在HBx促进肝癌细胞侵袭转移过程中的确切机制有待进一步阐明。     

超声微泡联合超声辐射介导基质金属蛋白酶抑制因子-1 siRNA抗大鼠肝纤维化的作用

基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）对MMPs的抑制是导致ECM在肝纤维化过程中过度沉积的关键，理论上抑制TIMP-1基因在肝组织中表达有利于MMPs降解过度沉积的胶原及防止肝窦毛细血管化。我们用RNA干扰（RNAi）技术构建了定点干扰TIMP-1表达的pRNAT-U6．2／Lenti siRNA病毒表达载体，体外实验证明该载体抑制TIMP-1表达的效果显著。为使目的基因在肝组织中释放而不影响其他器官TIMP1基因的正常表达，我们用超声造影剂微泡混合TIMP-1 siRNA表达载体，同时超声辐照大鼠肝脏，观察该方法定位释放靶基因到靶器官的有效性。[第一段]     

利用RNA干扰技术治疗慢性心衰大鼠的研究

目的利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制心衰大鼠受磷蛋白（phospho—lamban，PLN）mRNA的表达，改善心脏功能。方法构建表达PLN shRNA的重组腺相关病毒载体（rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2）；通过经腹心包穿刺术将rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2注入心衰大鼠心包内，基因导入后10d，30dRT—PCR法检测RNAi对心肌细胞PLN mRNA的抑制效应，并测定肌浆网Ca^2＋-ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca^2＋-ATPase，SERCA2a）活性，比较血流动力学的变化。结果rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2心包注射后，与心衰组比较，10d时PLN mRNA分别降低18．76％／16．36％，SERCA2a活性及血流动力学指标无明显改善；30d时rAAV2-phRi1及rAAV2-phRi2对PLN mRNA的抑制效率为85．32％／67．65％，SERCA2a活性增加104％／74％，血流动力学显著改善（P〈0．05），达到假手术组水平（P〉0．05）；rAAV2-phRi1的抑制效率，对心功能的改善显著优于rAAV2-phRi2（P〈0．05）。结论在体水平上，RNAi能够抑制心衰大鼠PLN mRNA表达，改善心脏功能，rAAV2-phRi1优于rAAV2-phRi2。     

纤溶酶原激活物抑制剂-1 小干扰RNA对肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）小干扰RNA（siRNA）对肝星状细胞（HSC）PAI-1基因表达及生物学特性的影响。方法将化学合成抗PAI-1 siRNA以Lipofectamine包裹，转染HSC—T6细胞，设阴性对照和空白对照，抽提细胞总RNA及蛋白质，收集培养上清液，应用逆转录-聚合酶链反应和免疫细胞荧光法检测细胞PAI—1表达。应用MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期变化，应用酶联免疫吸附法检测培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。结果转染siRNA的HSC—T6细胞PAI-1基因表达水平明显下调，HSC—T6细胞增殖抑制明显，48h和72h时培养上清液中Ⅰ型胶原表达水平显著减少，分别比阴性对照下降（20．71±8．40）％和（37．97±6．40）％（F=42．69。P=0．0001），Ⅲ型胶原含量于72h时降低（35．98±4．60）％（F=105．52，P=0．0001）。结论化学合成抗PAI-1 siRNA能高效抑制HSC—T6PAI-1表达，抑制HSC—T6细胞增殖，显著减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌，具有预防及治疗肝纤维化的潜力。     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

慢病毒载体介导的结缔组织生长因子基因沉默对下游基因的影响

目的利用RNA干扰技术,以慢病毒为载体,介导结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默,并观察其对下游基因表达的影响。方法用构建的CTGF小干扰RNA(siRNA)慢病毒转移质粒与包装质粒、包膜蛋白质粒共转染293T细胞,包装成介导CTGF基因沉默的慢病毒载体;感染肝星状细胞系HSC-T6,应用Real-time PCR和Western免疫印迹法筛选基因沉默效率最高的慢病毒载体;再根据绿色荧光蛋白(GFP)表达水平检测感染效率;应用Real-time PCR法检测CTGF基因沉默后HSC-T6中金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2和I型胶原mRNA表达水平。结果包装的慢病毒载体感染HSC-T6细胞的效率高于50%;感染HSC-T6细胞后,CTGF的表达在mRNA和蛋白水平均受到明显抑制,其中TS1具有最佳的抑制效率;HSC-T6细胞CTGF基因沉默后,其TIMP-1、TIMP-2和I型胶原mRNA水平也显著降低。结论包装的慢病毒载体在HSC-T6中具有较好的感染效率和CTGF基因沉默效果,基因沉默后可进一步抑制HSC-T6细胞TIMP-1、TIMP-2和I型胶原的基因表达,这在抗纤维化的研究中具有积极的意义。     

结缔组织生长因子和金属蛋白酶组织抑制因子-1 RNA干扰靶位的筛选

目的筛选能有效抑制肝纤维化形成的结缔组织生长因子（CTGF）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的RNA干扰靶位。方法根据大鼠CTGF和TIMP-1基因序列,分别设计3个RNA干扰候选靶位,化学合成双链RNA（dsRNA）,各自转染或不同组合后转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞（HSC）,48h后抽提RNA并逆转录成cDNA,采用荧光定量PCR法测定并计算CTGF和TIMP-1、Ⅰ型前胶原（procol-α1）mRNA的相对表达量与抑制率,采用RIA法检测HSC培养上清液肝纤维化指标。结果在进行单独针对CTGF基因干扰时,CTGF-3组对CTGF mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.09%与65.03%）,在单独针对TIMP-1基因干扰时,TIMP-1-3组对TIMP-1 mRNA及其下游产物Procol-α1 mRNA的转录抑制作用最佳（抑制率分别达68.55%与62.84%）;在联合干扰时,CTGF-3/TIMP-1-3组联合对CTGF mRNA和TIMP-1 mRNA的抑制最强（抑制率分别达76.60%与79.03%）,而以CTGF-2/TIMP-1-3组联合对Procol-α1 mRNA的抑制作用最强（抑制率达85.79%）。结论成功筛选出针对CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位,联合干扰较单独干扰效果更强。     

携TIMP-1基因RNAi慢病毒载体感染大鼠HSC-T6细胞抑制目的基因表达

目的：验证构建成功的携基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）基因特异性小干扰RNA的慢病毒载体对目的基因表达的抑制效应。方法以慢病毒质粒感染HSC-T6细胞,在感染6天和8天后,观察慢病毒感染效率;采用定量PCR法检测TIMP-1 mRNA水平变化;采用免疫印迹法检测TIMP-1蛋白表达变化。结果在慢病毒载体感染6天时,TIMP-1 mRNA水平较正常对照组下降约0.668倍[2-ΔΔCt为（0.668±0.046）],下降程度明显高于阴性对照组[2-ΔΔCt为（1.001±0.041）,（P＜0.05）];在慢病毒感染6天和8天时,RNAi组对TIMP-1蛋白表达具有明显的抑制作用,且以感染第6天为显著。结论构建成功的携TIMP-1基因特异性RNAi慢病毒载体能有效感染HSC-T6细胞,并抑制目的基因的表达。     

Halofuginone to prevent and treat thioacetamide-induced liver fibrosis in rats

Hepatic fibrosis is associated with activation of hepatic stellate cells (HSC), the major source of the extracellular matrix (ECM) proteins. The predominant ECM protein synthesized by the HSC is collagen type I. We evaluated the effect of halofuginone-an inhibitor of collagen synthesis-on thioacetamide (TAA)-induced liver fibrosis in rats. In the control rats the HSC did not express smooth muscle actin, collagen type I gene, or tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2), suggesting that they were in their quiescent state. When treated with TAA, the livers displayed large fibrous septa, which were populated by smooth muscle actin-positive cells expressing high levels of the collagen alpha1(I) gene and containing high levels of TIMP-2, all of which are characteristic of advanced fibrosis. Halofuginone given orally before fibrosis induction prevented the activation of most of the stellate cells and the remaining cells expressed low levels of collagen alpha1(I) gene, resulting in low levels of collagen. The level of TIMP-2 was almost the same as in the control livers. When given to rats with established fibrosis, halofuginone caused almost complete resolution of the fibrotic condition. The levels of collagen, collagen alpha1(I) gene expression, TIMP-2 content, and smooth muscle actin-positive cells were as in the control rats. Halofuginone inhibited the proliferation of other cell types of the fibrotic liver in vivo and inhibited collagen production and collagen alpha1(I) gene expression in the SV40-immortalized rat HSC-T6 cells in vitro. These results suggest that halofuginone may become an effective and novel mode of therapy in the treatment of liver fibrosis.     

Effects of different ingredients of zedoary on gene expression of HSC-T6 cells

AIM: To investigate the effects of four different ingredients of zedoary (Curcuma aromatica oil, Curcumol, p-elemence, and Curcumin) on the gene expressions of hepatic stellate cells (HSCs), and to explore the molecular mechanism of zedoary against hepatic fibrosis at gene network level. METHODS: We detected the mRNA sequences of 50 liver fibrosis-related genes in GenBank and designed oligonucleotide probes. We synthesized oligonucleotides with PE8909 DNA synthesizing instrument, and carried out oligonucleotide microarray with OGR-04 dropping instrument and aldehyded glass chip. Cultured HSC-T6 cells were treated with different concentrations of Colchicine, Curcuma aromatica oil, Curcumol, β-elemence, and Curcumin. According to the experiment of cell toxicity, we took the appropriate concentrations of medicines that resulted in over 50% of cell survival as experiment concentrations. We collected the cells at 1, 6, 12, and 24 h, and extracted total RNA with TRIzol reagent, then labeled cDNAs with Cy3-dUTP and Cy5-dUTP. These labeled cDNAs were hybridized to an oligonucleotide microarray which was washed several times and scanned by scanner GenePix 4000B. Different gene expressions of HSC-T6 cells were analyzed by ImaGene 4.2 software. RESULTS: After HSC-T6 cells were cultured in a medium containing 6.25 μg/mL Colchicine for 12 h, expression of TIMP-1 decreased 2.2-folds. After HSC-T6 cells were cultured in a medium containing 78.125 μg/mL of Curcuma aromatica oil for 24 h, the expression of TIMP-2 and IL-6 decreased 2.3- and 2.2-folds, respectively. Moreover, after HSC-T6 cells were cultured in a medium containing 1.5625 μg/mL of Curcumol for 12 h, the expression of TGFβ1 and P450a decreased 2.3- and 2.1-folds, respectively. CONCLUSION: Our results may show the possible molecular mechanism of Curcuma aromatica oil and Curcumol against hepatic fibrosis.     

Recombinant AAV2 transduction of primitive human hematopoietic stem cells capable of serial engraftment in immune-deficient mice

A recombinant AAV2 (rAAV2) vector encoding antisense RNA to HIV-1 transactivating region (TAR) was evaluated for transduction of human cord blood CD34+CD38- hematopoietic stem cells (HSC) capable of serial engraftment in nonobese diabetic (NOD)/severe combined immunodeficient (SCID) mice. Results revealed long-term multilineage marking in primary and secondary recipients, and significantly, an enrichment of transduced cells in secondary hosts, indicating efficient transduction of multipotential self-renewing HSC. These results were confirmed by the persistence of rAAV marking of clonogenic progenitors in serial analyses of recipient marrow. Upon HIV-1 challenge, the macrophage progeny of transduced CD34+ cells expressed antisense RNA and exhibited sustained and significant inhibition of virus replication as compared with controls in every donor tested, without selective pressure. This study represents a clear in vivo demonstration of efficient rAAV2 transduction of human HSC.     

基质金属蛋白酶抑制剂-1基因的RNA干扰载体构建及其抑制效应

目的构建含有基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)基因特异性RNA干扰序列的慢病毒vshRNA载体,筛选有效靶点序列。方法通过在线软件设计TIMP-1基因的RNA干扰(RNAi)序列,按siRNA设计的优化原则筛选靶序列,构建含有TIMP-1基因特异性慢病毒vshRNA载体。将重组pEGFP-N1-3FLAG-TIMP-1质粒和慢病毒质粒pGCSIL-GFP-shRNA共转染293T细胞,转染48 h后收集细胞,抽提总蛋白进行Western Blot检测,筛选抑制效应较好的质粒。结果依次通过在线软件设计序列、优化筛选、BLAST比对等方法,选择4条作为靶序列,又经Western Blot检测筛选出抑制效应较好的1条序列,其在TIMP-1基因的173～192 nt处。结论成功构建了具有抑制效应的TIMP-1基因特异性RNA干扰序列的慢病毒vshRNA载体,筛选出抑制TIMP-1表达的序列,为抗肝纤维化研究奠定了基础。