腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率为５００时细胞的转导效率达到１００％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

重组腺病毒ADV-TK 基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建

目的：构建定点整合型基因治疗腺病毒载体。方法：以逐步亚克隆法将腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列与neo基因表达盒克隆至pAdE1CMV，其中HCMV启动子控制下的neo基因表达盒位于腺病毒伴随病毒两个末端倒转重复序列之间，将得到的转移载体pAdE1CMVITREXneoDNA和pJM17DNA以脂质体法共转染293细胞，G418法连续筛选重组腺病毒。以病毒核酸酶切及感染293细胞的CPE（cytopathiceffect　）观察鉴定是否获得重组腺病毒。结果：获得有腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列和位于其间的neo基因表达盒的重组腺病毒vAd－AAV。结论：重组腺病毒vAd－AAV的构建成功将为基因治疗提供定点整合型腺病毒载体。     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

ROR-γt干扰腺病毒载体抑制Th17细胞功能

目的：设计和构建ROR-γt特异性干扰腺病毒载体，观察其对大鼠脾脏来源的辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）功能的影响。方法：设计ROR-γt编码区干扰序列，DNA聚合酶作用下形成双链序列，与线性化pSES-HUS质粒连接。转入BJ5183，转染病毒包装体系293细胞系，收集细胞，得到病毒液。反复感染4次得到高滴度pSES-HUS-ROR-γt病毒液。将其感染大鼠脾脏来源的Th17细胞，检测其对Th17细胞功能的影响。结果：成功构建和包装pSES-HUS-ROR-γt干扰腺病毒液，Th17细胞感染pSES-HUS-ROR-γt干扰病毒后，其分泌细胞因子白介素（interleukin，IL）-17、IL-6和TNF-γ水平下降。结论：pSES-HUS-ROR-γt干扰腺病毒能够有效抑制Th17细胞功能，可能对肾移植慢性排斥反应具有抑制或者延缓作用。     

重组腺病毒载体含人抑瘤素的扩增及纯化

目的：构建含人抑瘤素(HOSM)基因的重组腺病毒载体，观察其对肿瘤细胞生长的影响。方法：用脂质体介导质粒DNA同源重组方法构建HOSM基因的重组缺陷型腺病毒载体，用聚合酶链反应(PCR)法鉴定所构建的ad-HOSM载体，在人胚肾细胞(293细胞)中扩增病毒。CsCl梯度超速离心纯化病毒，噬斑法测定病毒的滴度。结果：获得了高纯度、高滴度的重组腺病毒载体。结论：细胞内质粒DNA同源重组法能有效构建重组腺病毒载体，293细胞能有效扩增病毒。CsCl梯度超速离心法能制备高纯度的病毒，为进一步研究重组腺病毒介导HOSM基因对肿瘤细胞的生物学活性的影响打下基础。     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

hTERT启动子调控的CD基因对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究

目的探讨由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒对卵巢癌细胞的选择性杀伤作用。方法将自行构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的重组腺病毒分别感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,通过MTT法检测受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对细胞的杀伤作用。结果用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力。     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率（MOI）为500时细胞的转导效率达到100％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异药物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建

目的：构建定点整合型基因治疗腺病毒载体。方法：以逐步亚克隆法将腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列与ｎｅｏ基因表达盒克隆至ｐＡｄＥ１ＣＭＶ，其中ＨＣＭＶ启动子控制下的ｎｅｏ基因表达盒位于腺病毒两个末端倒转重复序列之间，将得到的转移载体ｐＡｄＥ１ｅｍｖｉｔｒｅｘｎｅｏ ＤＮＡ和ｐＪＭ１７ ＤＮＡ以脂质体法共转染２９３细胞、Ｇ４１８法连续筛选重组腺病毒，以病毒核酸酶切及感染２９３细胞的ＣＰＥ观察鉴定是     

重组Lac-Z、反义c-myc腺病毒载体的增殖及鉴定

目的：建立重组反义c-myc腺病毒载体（Ad-AS-c-myc）、LacZ腺病毒（AD-Lac-Z）的增殖的方法。方法：对培养的293细胞转染重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体,使重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体在293细胞内大量复制,及时收集病变细胞,反复冻融以释放293细胞中的病毒载体,过滤除细胞碎片,利用倍比稀释法测定病毒载体滴度。PCR技术对扩增重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体进行鉴定。结果：利用293细胞扩增重组腺病毒载体,获得的Ad-AS-c-myc滴度为：2.3×109pfu/ml;Ad-LacZ滴度为：1.2×1010pfu/ml。在Ad-LacZ可见在800bp出现一特异性PCR扩增条带,为腺病毒特异扩增带。Ad-AS-c-myc在800及608bp处出现两条特异扩增条带,分别为腺病毒及反义c-myc特异扩增条带。结论：对转染的293细胞冻融后收集重组腺病毒载体具有高效、可靠、简便、相对经济实用的优点,有推广价值。     

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的 :观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 :将带有报告基因 Lac Z的 5型缺陷性腺病毒载体 Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 :随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对 Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论 :腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

汉滩病毒76-118株G2S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及表达产物鉴定

目的：在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G2片段与S基因0．7kb片段嵌合基因的重组腺病毒．方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的转移载体pShuttle-G2S0．7，然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连，电转化E．coli JM109并用PCR方法进行筛选和鉴定，获得重组腺病毒Adeno-G2S0．7DNA，转染HEK293细胞得到重组腺病毒．进一步对重组腺病毒滴度和表达产物进行鉴定．结果：构建了含G2S0．7嵌合基因重组腺病毒，滴度可达10^13～10^15pfu／L；该重组腺病毒感染HEK293细胞后，表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白．结论：利用腺病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础．     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的 探讨VEGF启动子驱动的CD／TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFp-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用。方法 分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞，给予前药5-FC、GCV，测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应。结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比，Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用，并可见较明显的旁观者效应：而与CMV启动子的双自杀基因相比，其作用无显著性差异。结论 VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用，其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统似。     

重组腺病毒rAd-MK-TNFα对人乳腺癌细胞的体外抑制作用

 目的 初步观察重组腺病毒rAd-MK-TNFα对乳腺癌细胞的抑制作用。方法 体外转染系列重组腺病毒，观察rAd-MK-TNFα在乳腺癌细胞Bcap37中TNFα的表达以及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用，并比较其与对照病毒对乳腺癌细胞及人成纤维细胞生长的抑制作用的不同。结果 rAd-MK-TNFα感染Bcap37细胞后，可检测到TNFα的表达；rAd-MK-TNFα对Bcap37乳腺癌细胞存在生长抑制作用，且与其病毒浓度呈正相关；rAd-MK-TNFα对人成纤维细胞的抑制作用小于非靶向腺病毒（rAd-CMV-TNFα）。结论rAd-MK-TNFα可能通过靶向表达TNFα对乳腺癌细胞产生抑制细胞生长的作用。     

黄心胶囊（分散片）的体外抗病毒作用

目的观察黄心胶囊（分散片）在体外对腺病毒和合胞病毒的直接作用。方法在体外测得药物对He1a细胞及HeP-2细胞的最大无毒浓度,再将此浓度作倍比稀释进行试验,观察对腺病毒和合胞病毒的直接抑制作用。结果黄心胶囊（分散片）10mg/mL～1.25mg/mL对Hela细胞和Hep-2细胞仅引起轻度的皱缩外,余无显著的毒性反应,0.625mg/mL对2种细胞无任何毒性反应。100～1.25mg/mL的浓度明显抑制腺病毒3型（Adv3）和舍胞病毒（RSV）致细胞病变的作用,～egm,10mg/mL～2.5ng/mL能抑制腺病毒7型（Adv7）致细胞病变作用。结论黄心胶囊（分散片）对腺病毒3型（Adv3）、7型（Adv7）和台胞病毒（RSV）具有明显的抑制作用。     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。