聚乙烯亚胺-聚乙二醇-siRNA纳米复合物的制备和理化性质的研究

目的 探索聚乙烯亚胺-聚乙二醇(PEI-PEG)-siRNA纳米复合物的制备方法及其理化性质,以提高siRNA的细胞转染率.方法 设计合成了PEI-PEG共聚物基因载体,使其与针对细胞表面受体CD44v6的siRNA形成纳米复合物.通过粒径与电位测定、凝胶阻滞电泳、扫描电镜、流式细胞仪测定等方法,观察不同N/P比的纳米复合物的复合效果、表面形态和大小、基因转染率等.结果 电镜下纳米复合物呈近球形、大小较一致、分散良好的纳米颗粒.N/P=5、10时复合物粒径分别为(174.6±1.2)nm,(267.7±1.8)nm.当N/P超过10时纳米复合物粒径减小,zeta电位为正值且增大.此时,siRNA被PEI-PEG完全复合,产生一种荧光淬灭作用.流式细胞仪结果表明纳米复合物的基因转染率随着N/P的增加而增大.当N/P比为30时,其转染率为(75.6±9.2)%.结论 PEI-PEG是一种有潜力的阳离子基因载体,它的制备为下一步体外实验及动物实验提供了条件.     

LHRH-MPG△NLS/CDK2-siRNA对HepG2细胞生长的抑制作用研究

目的 考察小干扰RNA（siRNA）载体促黄体激素释放激素-MPG△NLS（LHRH-MPGNLS）负载针对细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）的siRNA所形成纳米粒的粒径和Zeta电位,观察不同溶剂对纳米粒粒径的影响,研究其对肝癌细胞HepG2的抑制效果.方法 将LHRH-MPG△NLS与CDK2-siRNA按氨磷比（N/P）为10/1、20/1、40/1混合,通过自组装形成纳米粒,用动态光散射仪检测纳米粒的粒径和Zeta电位,考察焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水、质量分数为10％葡萄糖溶液和生理盐水对纳米粒粒径的影响,用CCK8试剂盒测试纳米粒对HepG2细胞生长的抑制作用.结果 LHRH-MPG△NLS/CDK2-siRNA纳米粒的平均粒径均在200 nm以下,N/P为10/1、20/1、40/1时的Zeta电位分别为（70±5）、（120±5）、（130±5） mV.生理盐水中纳米粒粒径明显增大,说明强电解质对纳米粒粒径产生较大影响.纳米粒终浓度为200 nmol/L时,N/P为10/1的纳米粒对HepG2细胞的生长具有明显抑制作用.结论 LHRH-MPG△NLS/CDK2-siRNA纳米粒的平均粒径在200 nm以下,容易被细胞摄取,Zeta电位显示纳米粒可以在水溶液中稳定存在,但强电解质会影响纳米粒的稳定性,使其粒径增大.纳米粒终浓度为200 nmol/L时,N/P为10/1的纳米粒对HepG2细胞生长的抑制效果显著.     

Persephin基因转染对缺氧诱导的神经干细胞凋亡的影响

目的:探讨重组腺病毒介导Persephin基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法:体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类Persephin基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blotting法分析Persephin蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数,显微镜观察凋亡小体;流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。结果:转染pAdPersephin的C17.2神经干细胞成功表达Persephin蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡指数为(25.54±4.30)%,而转染pAdPersephin后的细胞凋亡指数显著减少至(10.04±1.32)%(P<0.01),而转染pAdCMVPersephin Persephin反义寡核脱氧核酸细胞凋亡指数为(24.05±3.05)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论:腺病毒介导的Persephin基因能高效表达Persephin;外源性Persephin对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性。     

碱性成纤维细胞生长因子对放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抑制放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的作用。方法:用直线加速器进行总剂量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立放射损伤细胞模型,将处理后的C17.2神经干细胞悬液以1×108/L的浓度接种于96孔板中,每孔加细胞悬液200μl,然后分别加入bFGF 0(对照),25,50和100μg/L干预24 h处理。用4-甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:随bFGF浓度增加,放射诱导后的C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P0.01),呈现明显剂量-效应关系(r=0.628,P0.01)。在一定放射剂量下,随着bFGF浓度增加C17.2神经干细胞生存曲线右移,表明bFGF能够提高神经干细胞的放射耐受性(r=0.569,P0.01)。bFGF为100μg/L时,C17.2神经干细胞活性最强,且无细胞毒性作用。流式细胞仪测定的对照组C17.2神经干细胞凋亡率明显高于bFGF 25和50μg/L(P0.01)处理组,并且凋亡率在bFGF 25,50和100μg/L组间也存在显著差异(P0.01)。结论:bFGF能显著抑制放射诱导的小鼠C17.2神经干细胞凋亡,其机制有待进一步研究。     

免疫纳米微粒靶向胰腺癌细胞输送siRNA的方法研究

 目的：构建一种向胰腺癌细胞安全、高效输送siRNA的免疫纳米载体。方法：检测纳米载体IONP-PEI（非靶向组）及其与siRNA复合物的表征;通过琼脂糖凝胶电泳检测siRNA结合力、MTS法检测细胞活力和流式细胞术检测转染率以确定其复合siRNA的最佳N/P比值;细胞免疫荧光和普鲁士蓝染色观察scFvCD44v6偶联IONP-PEI的靶向纳米载体（靶向组）在细胞内分布;流式细胞术、荧光显微镜观察、real-time PCR和Western blotting检测靶向组和非靶向组的转染率和转染siKRAS后的干扰效果。结果：IONP和PEI的最适质量比为0.75;纳米载体复合siRNA的最佳N/P比值为20;IONP-PEI/siRNA复合物的电位为（21.73±8.07）mV,粒径为（51.3±2.2）nm。荧光显微镜显示,非靶向组和靶向组转染后均在细胞内,靶向组的转染率为（89.75±1.81）%,高于非靶向组的（59.87±4.52）%,且靶向组的荧光强度高于非靶向组。靶向组的KRAS mRNA的相对表达量为（34.02±615）%,低于非靶向组的（51.09±6.70）%;Western blotting显示靶向组的KRAS蛋白表达量低于非靶向组。结论：非靶向组和靶向组均能够将siRNA转染进细胞内,且靶向组具有更高的转染效率和更好的干扰基因表达效果。本课题构建的scFvCD44v6-IONP-PEI是一种高效、安全和靶向识别胰腺癌细胞的免疫纳米载体。     

新型阳离子磷酸胆碱聚合物可作为反义寡核苷酸基因的运输载体

背景:病毒类基因载体虽然具有较高的转染效率,其安全性一直受到人们的质疑。目的:以阳离子磷酸胆碱聚合物作为基因药物运输的载体,研究其对人类c-myc反义寡核苷酸(AS-ODN)的负载和运输能力,并对其安全性和有效性进行评价,方法:应用原子转移自由基聚合法合成具有高度生物相容性的双嵌段磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70,并对其溶液进行表征。用DNA凝胶电泳法对MPC30-DEA70与针对AS-ODN生成不同N/P比值的基因复合物进行表征。将MPC30-DEA70/AS-OD基因复合物转染至体外培养的HEK293细胞,检测其细胞相容性、转染效率和细胞内转运机制。结果与结论:MPC30-DEA70在pH=4.0-11.0范围内的0.01 mol/L PBS中显示出高度水溶性,其正电性随pH值降低而增强。MPC30-DEA70/AS-ODN基因复合物在DNA凝胶电泳中显示出不同程度的电泳迟滞,随电性增强而显著。MTT法检测显示MPC30-DEA70对HEK293细胞株的毒性呈剂量依赖性,高浓度下细胞毒性显著增强。流式细胞术检测发现复合物的转染随N/P比值增加而显著增强;共聚焦显微镜观察到AS-ODN分子在细胞核内的转运,提示其有效的核定位。证实新型阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输反义寡核苷酸,是一种高效安全的非病毒类转基因载体。     

叶酸修饰的聚乙烯亚胺聚合物载PD-L1 siRNA体外靶向胃癌细胞的研究

目的:构建高效的siRNA纳米载体靶向SGC-7901胃癌细胞,并下调胃癌表达的程序性死亡配体1(PD-L1)。方法:检测叶酸(FA)-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体与siRNA复合后的粒径、电位等表征;体外实验检验siRNA的结合能力、复合物细胞毒性、细胞摄入能力及转染效率;磁共振(MR)成像检测示踪能力;检验胃癌细胞PD-L1下调效应及共培养T细胞的细胞因子水平。结果:N/P比值为10时,FA-PEG-SS-PEI-SPION完全复合siRNA,形成电位为(9.14±0.80)m V、粒径为(116.7±2.5)nm的多聚复合物。靶向组的转染率为(95.06±0.44)%,与非靶向组的(93.87±1.05)%相当;平均荧光强度为1 892.67±81.51,高于非靶向组的1 324.33±186.58(P0.05)。普鲁士蓝染色和激光共聚焦显微镜成像证实了复合物的细胞摄入。体外MR成像验证了聚合物的MR造影成像能力。靶向组PD-L1的mRNA最低相对表达量为9.07%±0.79%,Western blot显示PD-L1的表达显著降低。共培养实验显示IFN-γ和TNF-α的分泌水平增加,IL-10的分泌水平降低(P0.05)。结论:本研究构建了FA-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体,并证明了其体外靶向细胞及载siRNA下调PD-L1表达的能力和MR示踪的能力,是一种高效和安全的靶向治疗纳米载体。     

胰岛素样生长因子-1拮抗c17.2神经干细胞的放射损伤

目的：评价IGF-1（胰岛素样生长因子-1）对放射引起的c17.2神经干细胞凋亡或坏死所产生的拮抗作用。方法:c17.2神经干细胞培养，免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin（巢蛋白）及X-gal（吡喃半乳糖苷衍生物）染色检测 lac-z基因的表达。将IGF-1重组腺病毒转染c17.2神经干细胞，免疫组化法鉴定IGF-1蛋白的表达。建立放射引起体外培养的c17.2神经干细胞损伤的模型,流式细胞术及TUNEL法（原位末端标记）评判细胞的凋亡或坏死。观察胰岛素样生长因子-1重组腺病毒转染对细胞凋亡或坏死程度的影响。结果:绝大部分细胞nestin抗原染色阳性，X-gal染色阳性。免疫组化检测结果表明转染病毒的c17.2神经干细胞有IGF-1蛋白的表达，相同照射剂量下转染重组腺病毒的细胞凋亡率及坏死率较未转染细胞低 。结论：重组腺病毒介导的IGF-1转染可减少放射引起的c17.2神经干细胞的坏死和凋亡。IGF-1基因对神经干细胞有保护作用。     

聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒的制备及介导体外转染关节软骨细胞

背景：壳聚糖对软骨细胞具有良好的生物相容性和可降解性,但存在基因转染效率偏低的缺陷。 目的：构建负载增强型绿色荧光蛋白基因的聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒,检测其理化性能,以及体外对关节软骨细胞的基因转染效率。 方法：将聚乙烯亚胺共价连接于壳聚糖骨架上构建聚乙烯亚胺-壳聚糖复合物,再将聚乙烯亚胺-壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒DNA以复凝聚法制成纳米粒,以扫描电镜检测纳米粒形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察聚乙烯亚胺-壳聚糖和质粒DNA的结合力。以聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒、裸质粒DNA、脂质体2000及壳聚糖/DNA纳米粒转染体外培养的兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测基因转染率;激光共聚焦显微镜检测DNA的入核情况。 结果与结论：聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒多呈球形,粒径为(154.6±18.6) nm,表面Zeta电位为(24.68± 6.82) mV,可有效保护质粒DNA免受 DNaseⅠ的降解。体外转染实验证明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能介导增强型绿色荧光蛋白基因转染关节软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(23.80±1.74)%,转染率高于裸质粒DNA组及壳聚糖/DNA纳米粒组(P < 0.05),与脂质体2000组无显著差别(P=0.522)。表明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能有效保护质粒DNA免受核酸酶降解,对关节软骨细胞有良好的基因转染能力。     

阳离子脂质体-DNA复合物与脂质-鱼精蛋白-DNA复合物体外细胞转染率比较

采用薄膜-挤压法制备空白阳离子脂质体后,再分别制得阳离子脂质体-DNA复合物和脂质-聚阳离子-DNA复合物(Lipid-polycation-DNA lipopolyplexes,LPD);用凝胶阻滞实验,确定阳离子脂质体与质粒DNA的配比;用透射电镜观察阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态,用激光粒度仪测定它们的粒径和zeta电位;用酶标仪测定它们对张氏(Chang)肝细胞、HepG2肝癌细胞的转染率。结果表明阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态均近似于球体,但LPD的粒径明显较小;LPD对张氏(Chang)肝细胞和HepG2肝癌细胞的转染率均高于阳离子脂质体-DNA复合物。LPD是基因治疗的临床应用中一种更具前景的载体系统。     

阴离子化高分子包覆非病毒载体提高有血清环境下RNA干扰效率的研究

大多数阳离子化高分子载体在血清环境中会大量吸附血清蛋白而导致转染效率低下,因而难以应用于临床。设计合成羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修饰富勒烯(C60-Dex-COOH)两种阴离子化高分子,并将其包覆在精胺化普鲁兰(Ps)与siRNA形成的复合物(PS/siRNA)外层,以减少复合物对血清蛋白的吸附。采用DLS/ELS检测阴离子包覆前后复合物的颗粒粒径及Zeta电位;用QCM-D验证阴离子包覆层的形成,并评价包覆层对牛血清白蛋白(BSA)吸附的影响;同时应用cck-8试剂、流式细胞术,检测包覆前后及不同包覆比例下复合物的细胞毒性、进入细胞的情况及对Hela-EGFP细胞的干扰效率。结果表明,Dex-COOH与C60-Dex-COOH能够在PS/siRNA外部形成稳定的负电性包覆层,有效阻止BSA的吸附,并在无血清的条件下显著降低复合物的细胞毒性;在有血清的环境中,表面包覆了阴离子化高分子的复合物可以不受血清蛋白的影响而被细胞大量摄取。对包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA复合物转染组施加光照,可促使复合物从溶酶体中逃逸,将血清条件下PS/siRNA的干扰效率提高20%。该策略可有效提高阳离子化高分子载体介导的RNA干扰效率。     

mPEG-CS纳米粒介导livin shRNA基因纳米复合物的制备及转染效率

背景：作为非病毒基因转染载体,由可降解的高聚物形成的纳米载体目前被广泛由于基因转染,因为他们具有良好的缓释性,靶向性和生物相容性。 目的：制备mPEG-CS纳米粒,探讨mPEG-CS作为Livin shRNA基因转染载体的可行性。 方法：通过离子交联法制备mPEG-CS纳米粒,利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性,通过静电吸附法制备载livin shRNA的基因纳米复合物。Zeta-size分析仪和透射电镜检测空白纳米粒和载livin shRNA的基因纳米复合物的形态、粒径和zeta电位,测定基因纳米复合物的包封率,凝胶电泳阻滞实验和DNase I酶消化实验验证纳米粒对基因的保护作用。利用最佳条件下制备的基因纳米复合物,转染大肠癌HT-29细胞,考察转染效率。 结果及结论：成功制备出约60 nm的mPEG-CS纳米粒,当纳米粒与基因体积比为3∶1时,得到的基因纳米复合物形较规则,粒径100 nm左右;其包封率为(94.32±0.35)%。凝胶电泳阻滞实验表明纳米粒能够紧密结合DNA,对基因具有良好的基因保护作用。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的转染效率高,持续作用时间长。mPEG-CS纳米粒作为基因转染载体,对基因具有保护作用,能够将livin shRNA重组质粒高效转染入大肠癌细胞,能够在大肠癌细胞内长时间表达,克服了RNA干扰在基因治疗肿瘤中基因作用时间较短的缺点。     

腺病毒介导的KGF基因修饰促进表皮干细胞增殖

目的　构建KGF腺病毒表达载体并转染表皮干细胞,观察其对表皮干细胞增殖的影响。 方法　 RT-PCR自人成纤维细胞中扩增KGF基因片段,pAD-easy I腺病毒系统构建KGF腺病毒表达载体,以MOI=50感染表皮干细胞;MTT法检测表皮干细胞增殖,流式分析细胞周期变化。 结果　　RT-PCR成功扩增KGF基因片段,成功构建的KGF腺病毒质粒经Pac I内切酶酶切获得4.5 kbp的特异条带,MOI=50的病毒转染效率超过90%;KGF基因修饰后的表皮干细胞增殖效率与对照组比较有显著差异（P<0.05）,并且G2/M期细胞数量明显增多。 结论　成功构建腺病毒KGF表达载体,腺病毒载体介导的KGF基因修饰促进了表皮干细胞的增殖。     

β雌激素受体沉寂表达载体的构建及表达

目的构建雌激素受体β(ERβ)亚型沉寂表达载体,并观察其转染成骨细胞后抑制ERβ基因表达的效果。方法参考人ERβ基因mRNA序列,设计、合成ERβ-shRNA的DNA Oligo后行PCR扩增,获得的shRNA双链DNA片段与pLVTHM-GFP质粒双酶切后连接,转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞。取鉴定正确的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA重组质粒转染人成骨hMG63细胞,实验分空白载体组、空白对照组和ERβ-siRNA组,转染48h后于倒置荧光显微镜下观察各组细胞的转染效果,并采用流式细胞术检测转染效率。抽提各组细胞的总RNA,经RT-PCR生成cDNA,Realtime-PCR检测ERβ基因的抑制效率。结果倒置荧光显微镜下观察显示,ERβ-siRNA组hMG63细胞90%以上呈现绿色荧光。流式细胞术检测ERβ-shRNA转染hMG63细胞的转染效率为92.3%。Realtime-PCR检测结果表明,ERβ-siRNA组ERβ表达量(0.17±0.01)仅约为空白载体组(1.00±0.01)的17.3%(P0.001),ERβ-siRNA对hMG63细胞ERβ基因的抑制效率约为83%。结论成功建立了人ERβ沉寂表达的成骨细胞模型,慢病毒载体介导的ERβ-siRNA能有效抑制成骨细胞ERβ基因的表达,满足了研究成骨细胞中ERβ相关功能的需要。     

纳米粒子-siRNA复合物抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达的实验研究

目的:构建复合纳米粒子载体,传递siRNA序列,抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达.方法:构建PEI包覆的以SiO2和Fe3O4为主要成分的复合纳米粒子载体,以LipofectamineTM2000为对照,琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒子-siRNA的结合效率;荧光显微镜和流式细胞术检测纳米粒子-SOCS1-siRNA序列被细胞摄入的效率;Western blot检测纳米粒子-siRNA复合物转染脐血树突状细胞后对SOCS1基因表达的抑制.MTT法检测纳米粒子-SOCS1-siRNA处理的脐血DCs对肿瘤细胞的杀伤活性.结果:纳米粒子可以高效结合siRNA序列,纳米粒子-SOCS1-siRNA序列可被脐血树突状细胞摄取,但是单独的纳米粒子抑制SOCS1基因表达效率比较低,在外加磁场的作用下,基因沉默作用显著增强,抗肿瘤作用也相应提高.结论:纳米粒子载体传递siRNA安全性好,效率高,可以高效沉默脐血树突状细胞SOCS1基因表达,能为设计更有效的以树突状细胞为基础的抗肿瘤疫苗提供新思路和实验依据.     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化

背景：近年来,研究表明外源性神经营养因子或化学诱导剂可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化,但外源性诱导剂诱导作用短暂且化学性物质不可避免的对细胞活力造成负面影响,一定程度上限制了骨髓间充质干细胞的基础研究与临床应用空间。 目的：以载胶质细胞源性神经营养因子和绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)转染大鼠骨髓间充质干细胞,观察目的基因在靶细胞内的表达、对细胞的营养作用及对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响。 方法：转染组中以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数分别为10,50,80,100,150,200;对照组加入等量的培养液作为对照。转染后12 h,倒置荧光显微镜观察2组中绿色荧光蛋白的表达情况;转染后72 h,流式细胞仪测定转染组中转染效率;MTT法测定2组中细胞活力;转染后5,10 d,PCR检测转染组中胶质细胞源性神经营养因子mRNA的表达;转染后5 d免疫荧光鉴定2组中神经元烯醇化酶的表达情况,转染后10 d鉴定微管相关蛋白2的表达。 结果与结论：转染后12 h,细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达,随时间延长荧光强度逐渐加强。以感染复数=100时绿色荧光蛋白的表达强度、稳定性较好,转染后3 d,转染效率近90%;转染后转染组细胞活力增加;转染5 d后,骨髓间充质干细胞表达神经元烯醇化酶,细胞伸出神经样细胞突起;转染10 d后,胶质细胞源性神经营养因子mRNA表达显著增强,骨髓间充质干细胞表达神微管相关蛋白2,细胞突触样结构明显且相互连接成网,呈现典型神经样细胞形态。说明以Ad-rGDNF-GFP转染骨髓间充质干细胞,感染复数=100时,可获得较高的转染效率,胶质细胞源性神经营养因子表达后明显提高了骨髓间充质干细胞活力,并诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞定向分化。     

重组rAAV2/eGFP、rAAV2/NGF病毒转染神经干细胞的研究

目的　观察重组rAAV2 /eGFP(含报告基因 )和rAAV2 /NGF(含目的基因 )病毒转染神经干细胞的转染效率 ;探讨神经干细胞治疗神经系统疾病的新途径。方法　分离、培养和鉴定神经干细胞后 ,用重组rAAV2 /eGFP和rAAV2 /NGF病毒转染神经干细胞 ,用荧光显微镜和免疫细胞化学检测GFP和NGF在体外的表达。结果　GFP和NGF于 2 4h后在体外开始表达 ;5d后表达效率高达 89% ,并可持续稳定表达 35d以上 ;MOI(v g/cell)不同 ,表达效率不同。 结论　重组rAAV2 /eGFP和rAAV2 /NGF病毒可转染神经干细胞 ,神经干细胞可稳定表达GFP和NGF ,可用于基因治疗神经系统疾病。     

LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物的制备及稳定性观察

目的设计并合成新型小干扰RNA(siRNA)载体促黄体激素释放激素-MPG△NLS(LHRH-MPG△NLS),考察不同N/P情况下LHRH-MPG△NLS与siRNA结合情况并探索稳定的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物的制备方法。方法将LHRH-MPG△NLS与针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA按N/P比为4∶1、6∶1、10∶1、12∶1的比例通过静电作用结合,制备多肽/siRNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳检测多肽与siRNA的结合情况。分别在pH值为7.0、7.5、8.0、8.5的溶液中制备N/P为20∶1的多肽/siRNA复合物,另在pH为7.0时按N/P为10∶1、15∶1、20∶1制备多肽/siRNA复合物,BI-9000AT激光光散射仪分别检测其16 d和20 d内粒径大小变化情况,考察其稳定性。结果LHRH-MPG△NLS与siRNA在N/P大于10∶1时形成完全结合的复合物,即siRNA被多肽完全包裹。不同pH值溶液中形成的多肽/siRNA复合物稳定性没有明显的差别,且粒径均在100~280 nm,16 d内未发生明显聚集。在pH为7.0时按N/P比为10∶1、15∶1、20∶1制备的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物在20 d内粒径在150～450 nm分布,且未发生明显聚集,较为稳定。结论实验研究设计了一种新型siRNA载体LHRH-MPG△NLS,当N/P大于10∶1时其可将siRNA完全包裹;pH为7.0时N/P为10∶1、15∶1、20∶1时该载体与siRNA均可形成稳定的纳米级复合物,其中N/P为15∶1和20∶1的复合物粒径稳定性优于N/P为10∶1的复合物;在pH 7.0～8.5的溶液中形成的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物均较稳定,没有明显差异。     

β-arrestin 2抗基因RNA对小鼠C17.2神经干细胞μ阿片受体脱敏感化的影响

背景:前期实验中采用新型基因沉默方法——抗基因RNA下调了细胞内β-arrestin 2基因的表达,实现细胞水平的基因敲除效应。目的:在前期实验基础上,观察抗基因RNA下调小鼠C17.2神经干细胞β-arrestin 2基因表达后其对DAMGO诱导μ阿片受体脱敏感化的影响。方法:小鼠C17.2神经干细胞应用含体积分数为10%胎牛血清、10mg/L青霉素和10mg/L氨苄青霉素的DMEM培养基,置于37℃,体积分数为5%CO2培养箱进行培养。待细胞长至80%汇合,用0.25%胰蛋白酶消化传代,每五六天传代1次。通过RT-PCR和免疫细胞化学法检测C17.2细胞μ阿片受体的表达。在脂质体介导下,将已被证实具有基因沉默效应的抗基因RNA片段转染C17.2细胞,荧光显微镜下观察转染24h后绿色荧光蛋白的表达。应用μ阿片受体选择性激动剂DAMGO和[35S]GTPγS结合实验检测C17.2细胞μ阿片受体与G蛋白的耦联能力。结果与结论:RT-PCR结果证实C17.2细胞内有μ阿片受体存在,而免疫细胞化学结果显示μ阿片受体主要在细胞膜和细胞浆中表达。荧光显微镜下观察可见转染质粒pGPU6/GFP/Arrb9的C17.2细胞中有绿色荧光蛋白的表达。[35S]GTPγS结合实验结果显示:未应用DAMGO进行处理的细胞中,[35S]GTPγS结合的刺激比率为(253±17)%;应用DAMGO预先对细胞进行处理后,刺激比率降为(113±14)%(P0.05);而转染β-arrestin 2抗基因RNA的细胞在DAMGO刺激下,[35S]GTPγS结合的刺激比率则仍维持在(239±15)%,表明抗基因RNA下调β-arrestin 2的表达,可抑制μ阿片受体脱敏感的产生。     

TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法

目的探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法。方法利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒。用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中。用W estern b lot、免疫荧光和MTT法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性。结果成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求。pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC。在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强。结论以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能。