聚乙烯亚胺-聚乙二醇-siRNA纳米复合物的制备和理化性质的研究

目的 探索聚乙烯亚胺-聚乙二醇(PEI-PEG)-siRNA纳米复合物的制备方法及其理化性质,以提高siRNA的细胞转染率.方法 设计合成了PEI-PEG共聚物基因载体,使其与针对细胞表面受体CD44v6的siRNA形成纳米复合物.通过粒径与电位测定、凝胶阻滞电泳、扫描电镜、流式细胞仪测定等方法,观察不同N/P比的纳米复合物的复合效果、表面形态和大小、基因转染率等.结果 电镜下纳米复合物呈近球形、大小较一致、分散良好的纳米颗粒.N/P=5、10时复合物粒径分别为(174.6±1.2)nm,(267.7±1.8)nm.当N/P超过10时纳米复合物粒径减小,zeta电位为正值且增大.此时,siRNA被PEI-PEG完全复合,产生一种荧光淬灭作用.流式细胞仪结果表明纳米复合物的基因转染率随着N/P的增加而增大.当N/P比为30时,其转染率为(75.6±9.2)%.结论 PEI-PEG是一种有潜力的阳离子基因载体,它的制备为下一步体外实验及动物实验提供了条件.     

聚乙烯亚胺-聚乙二醇-siRNA纳米复合物的制备和理化性质的研究

Objective To investigate the preparation method and characteristics of polyethyleneimine- polyethylene glycal (PEI- PEG) siRNA nanocomplex to improve the cell transfection efficiency of siRNA. Methods PEI-PEG copolymer was synthesized as gene carrier and complexed with siRNA targeting to CD44v6 to form PEI-PEG-siRNA nanoparticle. The size and zeta potential was measured. The morphology of the complex was observed by scanning electron microscopy. The complex abilities of the nanocomplex were validated by gel retardation assay. And the transfection efficiency of nanocomplexes at different N/P ratios was measured by flow cytometry. Results The nanoparticles appeared spherical,uniform in size, and well-dispersed. When N/P ratio was over 10, the size of nanocomplex decreased as N/P value increased. Meanwhile, the zeta potential was positive and increased. At this time, siRNA was completely complexed with PEI-PEG, producing a fluorescence quenching phenomenon. The flow cytometry showed that the transfection efficiency of nanocomplexes was improved as N/P value increasied. When N/P was 30, the transfection efficiency was (75.6±9.2)%. Conclusion PEI-PEG may be a promised gene carrier and can provide evidences for related research of PEI-PEG-siRNA nanoparticles in animals and in vitro experiments.     

纳米粒子-siRNA复合物抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达的实验研究

目的:构建复合纳米粒子载体,传递siRNA序列,抑制脐血树突状细胞SOCS1基因表达.方法:构建PEI包覆的以SiO2和Fe3O4为主要成分的复合纳米粒子载体,以LipofectamineTM2000为对照,琼脂糖凝胶电泳检测纳米粒子-siRNA的结合效率;荧光显微镜和流式细胞术检测纳米粒子-SOCS1-siRNA序列被细胞摄入的效率;Western blot检测纳米粒子-siRNA复合物转染脐血树突状细胞后对SOCS1基因表达的抑制.MTT法检测纳米粒子-SOCS1-siRNA处理的脐血DCs对肿瘤细胞的杀伤活性.结果:纳米粒子可以高效结合siRNA序列,纳米粒子-SOCS1-siRNA序列可被脐血树突状细胞摄取,但是单独的纳米粒子抑制SOCS1基因表达效率比较低,在外加磁场的作用下,基因沉默作用显著增强,抗肿瘤作用也相应提高.结论:纳米粒子载体传递siRNA安全性好,效率高,可以高效沉默脐血树突状细胞SOCS1基因表达,能为设计更有效的以树突状细胞为基础的抗肿瘤疫苗提供新思路和实验依据.     

质粒介导的RNAi技术对大鼠CⅡTA和MHCⅡ基因表达抑制的检测

目的 研究应用质粒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对大鼠MHC Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclass Ⅱ transactivator,C Ⅱ TA)和MHC Ⅱ基因表达的抑制作用.方法 根据大鼠CⅡTA基因信息,设计合成3条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)并构建质粒载体,于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞(DC)及体内转染大鼠脾脏,采用实时定量RT-PCR技术检测转染后DC和脾脏的C Ⅱ TA及MHCⅡ的mRNA表达变化,流式细胞术检测转染后MHCⅡ蛋白表达变化.结果 成功构建shRNA质粒载体,3个shRNA质粒转染组的DC和脾脏转染后的CⅡTA和MHC Ⅱ的mRNA表达水平及MHC Ⅱ抗原表达水平均明显减低(P<0.01),其中第1条shRNA的质粒转染组抑制效果最侍,C ⅡTA与MHCⅡ基因表达呈正相关.结论 应用C Ⅱ TA靶向shRNA质粒载体在体内外均能显著抑制C Ⅱ TA和MHC Ⅱ基因表达,为进一步基因治疗研究奠定实验基础.     

LHRH-MPG△NLS/siRNA纳米复合物的制备及稳定性观察

目的设计并合成新型小干扰RNA(siRNA)载体促黄体激素释放激素-MPG△NLS(LHRH-MPG△NLS),考察不同N/P情况下LHRH-MPG△NLS与siRNA结合情况并探索稳定的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物的制备方法。方法将LHRH-MPG△NLS与针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的siRNA按N/P比为4∶1、6∶1、10∶1、12∶1的比例通过静电作用结合,制备多肽/siRNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳检测多肽与siRNA的结合情况。分别在pH值为7.0、7.5、8.0、8.5的溶液中制备N/P为20∶1的多肽/siRNA复合物,另在pH为7.0时按N/P为10∶1、15∶1、20∶1制备多肽/siRNA复合物,BI-9000AT激光光散射仪分别检测其16 d和20 d内粒径大小变化情况,考察其稳定性。结果LHRH-MPG△NLS与siRNA在N/P大于10∶1时形成完全结合的复合物,即siRNA被多肽完全包裹。不同pH值溶液中形成的多肽/siRNA复合物稳定性没有明显的差别,且粒径均在100~280 nm,16 d内未发生明显聚集。在pH为7.0时按N/P比为10∶1、15∶1、20∶1制备的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物在20 d内粒径在150～450 nm分布,且未发生明显聚集,较为稳定。结论实验研究设计了一种新型siRNA载体LHRH-MPG△NLS,当N/P大于10∶1时其可将siRNA完全包裹;pH为7.0时N/P为10∶1、15∶1、20∶1时该载体与siRNA均可形成稳定的纳米级复合物,其中N/P为15∶1和20∶1的复合物粒径稳定性优于N/P为10∶1的复合物;在pH 7.0～8.5的溶液中形成的LHRH-MPG△NLS/siRNA复合物均较稳定,没有明显差异。     

2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究

为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stem cell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP),以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响。并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率。结果显示,转染10d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强。转染21d后荧光强度达高峰并维持在高水平。流式细胞仪检测结果表明:MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为26.34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08。转染组和未转染组细胞培养7、14、21d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异。本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC。     

siRNA下调astrocyteelevatedgene-1对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的: 探讨siRNA下调astrocyte elevated gene-1( AEG-1 )表达对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法: 用设计合成的AEG-1 siRNA转染神经母细胞瘤细胞株M17和SK-N-SH,采用荧光定量RT-PCR技术观察AEG-1 siRNA对 AEG-1 基因表达的影响;用MTT法和克隆形成实验观察AEG-1 siRNA对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用;用流式细胞术检测下调 AEG-1 表达对神经母细胞瘤细胞凋亡及细胞周期的影响。结果: 用AEG-1 siRNA转染人神经母细胞瘤细胞,RT-PCR结果证实AEG-1 siRNA能显著基因下调 AEG-1 表达,与对照组相比有显著差异(P<0.01);MTT法和克隆形成实验结果证明下调 AEG-1 表达可显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖;流式细胞术检测结果表明下调 AEG-1 表达可促进神经母细胞瘤细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G₀/G₁期。结论: AEG-1 siRNA可下调基因在神经母细胞瘤细胞中表达,并抑制神经母细胞瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。     

Mas基因沉默对血管紧张素-(1-7)拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响

 目的： 探讨Mas基因沉默后对血管紧张素-(1-7) ［Ang-(1-7)］拮抗血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化的影响。方法：（1）有效Mas siRNA的筛选：设计合成3对不同序列针对Mas基因的siRNA,瞬时转染大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）,实验分5组：Mas siRNA序列1、Mas siRNA序列2、Mas siRNA序列3、阴性siRNA序列及正常对照组。转染后48 h,分别用半定量RT-PCR及Western blotting检测Mas mRNA和蛋白的表达水平。（2）研究有效Mas siRNA对Ang-(1-7)拮抗AngⅡ的影响：实验分6组：正常对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)组、阴性siRNA对照组和Mas siRNA转染组。分别培养72 h后,细胞免疫化学法检测细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,ELISA法检测上清液中细胞外基质成分Ⅰ型胶原（ColⅠ）的含量。结果：（1）与组相比,Mas siRNA各组Mas基因的表达均下降,其中以Mas siRNA序列2最明显（P<0.05）。 （2）有效Mas siRNA转染组在加AngⅡ+Ang-(1-7)干预72 h后,较非转染组和阴性siRNA转染组α-SMA及ColⅠ表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：Mas siRNA能有效抑制Mas的表达,使Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的大鼠肾间质成纤维细胞活化作用明显减弱。     

B7-1和B7-2基因转染神经母细胞瘤细胞免疫原性的研究

目的比较免疫共刺激信号B7-1和B7-2以腺病毒为载体转染神经母细胞瘤（NB）SH-SY5Y细胞株,观察其对肿瘤细胞免疫原性的影响。方法以携带绿色荧光蛋白的腺病毒质粒（Ad-GFP）转染SH—SYSY细胞,通过流式细胞仪（FCM）判断转染效率,确定合适的感染倍数（MOI）。分别以空病毒质粒（Ad）及携带B7-1或B7-2的腺病毒质粒转染SH-SYSY细胞,即对照组和B7-1或B7-2组;并以未转染的肿瘤细胞为空白对照（空白组）。采用流式细胞仪（FCM）检测B7-1分子和B7-2蛋白表达,Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞,分别以效靶比5∶1和10∶1进行混合淋巴细胞培养后,测定放射性核素闪烁计数（cpm）/min,同时检测上清液中细胞因子IFN-γ及IL-2的分泌水平。结果腺病毒对SH-SY5Y细胞有较高的转染效率,转染后目的基因B7-1和B7-2得到了有效表达。B7-1组、B7-2组cpm值及上清液IFN-γ、IL-2水平明显高于Ad组、SH组（P〈0.01）;B7-1组与B7-2组比较,cpm值及细胞因子水平增高无明显差别（P〉0.05）。效靶比5∶1时,与10∶1相比,cpm值及IFN-γ、IL-2含量的增加更明显（P〈0.05）。结论 B7-1和B7-2分子可促进T淋巴细胞的增殖及活化T细胞分泌IFN-γ、IL-2,而B7-1与B7-2两组间cpm值及细胞因子水平无明显差别。     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

载基因 PGenesil-TGF-β1壳聚糖纳米粒的制备和性能研究

制备负载重组质粒 PGenesil-TGF-β1的壳聚糖纳米粒,并研究其结构特征和性能特点。采用复凝聚法制备壳聚糖-PGenesil-TGF-β1（报告基因）纳米微粒体,通过投射电镜测定其形态、粒径;采用全光谱分光光度计测定该复合物的包封率;凝胶电泳阻滞实验分析纳米粒载体与质粒的结合能力;DNase I 消化实验观察壳聚糖纳米粒保护质粒抵抗核酸酶的能力。制备的壳聚糖-PGenesil -TGF -β1纳米粒均呈球形,微粒直径在100～200 nm 之间,平均约（127．37±19．75）nm;其包封率为（94．38±0．45）％;凝胶电泳阻滞实验结果表明壳聚糖纳米粒能通过静电作用有效结合质粒,将其包裹在内;DNase I 消化实验显示壳聚糖纳米粒能有效地保护质粒免受核酸酶的降解。用复凝聚法成功制得壳聚糖-PGenesil -TGF -β1纳米粒,为后续研究基因药物奠定了实验基础。     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾细胞因子的变化

目的:探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫后再以Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法:将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c小鼠后8周,用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染。感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,并收集脾细胞培养上清液,用试剂盒检测脾细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4的水平,同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果:疫苗接种组的IFN-γ和TNF-α水平升高,IL-4水平降低;皮下注射组的TNF-α水平高于鼻腔内接种组。结论:多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗可诱导小鼠产生Th1型细胞应答,抵抗Em原头节的攻击感染。疫苗皮下注射途径优于鼻腔内接种。     

血小板膜仿生纳米载体的制备和表征及其体外跨胎盘屏障转运效率研究

利用血小板膜(PM)包覆聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒(PLGA NPs),制备成血小板膜仿生纳米粒(P-PLGA NPs)作为药物载体,评价载体的体外跨胎盘屏障转运效率。分别通过超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备P-PLGA NPs。利用粒径仪、透射电镜、能谱仪、SDS-PAGE和Elisa对P-PLGA NPs的理化特性表征,确定最优的制备方法。MTT法考察纳米载体对人绒毛膜癌细胞(BeWo b30)的毒性;流式细胞术探究BeWo b30摄取纳米载体的途径;利用Transwell构建体外胎盘屏障模型,考察纳米载体体外跨胎盘屏障效率。结果显示,PLGA NPs粒径为(174.1±23.4)nm,电势为(-32.3±5.6)mV,PM电势为(-24.5±1.8)mV;超声复合法、物理共挤法和共价连接法制备的P-PLGA NPs粒径分别为(269.1±32.9)、(425.0±36.6)、(823.4±73.1)nm,电势分别为(-24.1±3.8)、(-26.4±2.3)、(-23.5±2.9)mV,均显著高于PLGA NPs(P<0.05),接近PM电势;表面膜蛋白条带完整且...     

薄荷脑通过miR-1247-3p/PI3K/Akt通路影响LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应的分子机制研究

目的：探讨薄荷脑对脂多糖（LPS）诱导的Ⅱ型肺泡上皮（AT-Ⅱ）细胞凋亡和炎症反应的影响及分子机制。方法：以5、10、15 mg/L的LPS处理AT-Ⅱ细胞,CCK-8法检测细胞活性;将AT-Ⅱ细胞随机分为对照（NC）组、15 mg/L LPS组、1、5、10μmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组、anti-miR-NC+15 mg/L LPS组、anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS组、miR-NC+10μmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组、miR-1247-3p+10μmol/L薄荷脑+15 mg/L LPS组;采用流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平;Western blot检测蛋白表达;RT-qPCR检测miR-1247-3p表达水平。结果：不同浓度LPS处理后AT-Ⅱ细胞活性降低（P<0.05）。LPS诱导的AT-Ⅱ细胞中Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率升高,TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高,miR-1247-3p表达水平升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低（P...     

多聚赖氨酸修饰γ-Fe2O3纳米颗粒标记不影响神经母细胞瘤干细胞的活化和增殖

BACKGROUND: Retinoic acid is the most promising inducer for neuroblastoma minimal residual lesion, and it can induce cell differentiation in vivo, accompanied by reducing tumor cell proliferation. OBJECTIVE: To study the effect of nanoparticle labeling on biological characteristics of neuroblastoma stem cells, and the role of 13-cis retinoic acid to induce differentiation of neuroblastoma stem cells. METHODS: Neuroblastoma stem cells were isolated and cultured in vitro using serum-free suspension culture method, labeled with polylysine-modified γ-Fe2O3 nanoparticles and induced in culture medium containing 13-cis retinoic acid. RT-PCR was used to detect the expression of Oct-4 before and after labeling as well as before and after induction. Immunofluorescence method was used to detect the expression of nestin before and after labeling as well as before and after induction. RESULTS AND CONCLUSION: Neuroblastoma stem cells were successfully cultured in the bone marrow samples from 5 of 20 cases. Polylysine-modified γ-Fe2O3 nanoparticle labeling did no influence the viability and proliferation ability of neuroblastoma stem cells, and also had no effect on Oct-4 mRNA and nestin expression. After cultured in the culture medium containing 13-cis retinoic acid, the cell shape changed and the growth rate slowed down. Moreover, the expression of Oct-4 mRNA and nestin was gradually reduced. These findings indicate that polylysine-modified gamma-Fe2O3 nanoparticles can be used to label neuroblastoma stem cells, and 13-cis retinoic acid can induce the differentiation of neuroblastoma stem cells.      

大鼠前连合核神经元对渗透压和血管紧张素Ⅱ刺激的神经性反应——脑片电生理研究

在大鼠下丘脑离体脑片上,用电生理细胞外记录法研究了前连合核神经元的放电频率及其波形。实验观察到的前连合核自发放电神经元有不规则或规则的连续性放电活动,少数神经元有短阵性放电或不放电。这些神经元中的绝大部分可因脑片浸浴液中给予血管紧张素Ⅱ而被兴奋(放电频率增加),约1/3—1/2神经元对高渗透压刺激呈抑制性反应(放电频率减少),也有少数神经元可因高渗透压刺激而兴奋或无反应。前连合核的这些电生理特性大致与视上核、室旁核相似,也有一些与视上核、室旁核不同之处。对记录后的脑片进行组织化学及免疫组织化学染色的结果表明,记录部位在前连合核内,该部位有许多催产素样免疫阳性社经元。上述研究结果提示:前连合核的大细胞神经分泌神经元在水平衡的调节中起重要作用。