stathmin基因的RNA干涉抑制人白血病K562细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA 干涉(RNA interference,RNAi)抑制stathmin基因表达后对人白血病K562细胞体外增殖的作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体.酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入K562细胞,RT-PCR检测其对mR-NA的干涉效果;MTT 比色法检测K562细胞体外增殖能力.结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒.RT-PCR显示所构建的干涉载体成功地抑制了目的基因的转录,同时细胞增殖活性降低.结论:RNA干涉成功抑制stathmin基因表达并使人白血病K562细胞体外增殖活性明显降低.     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的：探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法：合成针对人stathmin基因的siRNAcDNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4．1-CMVneo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序，用EcoRI和BamHl分别双酶切，连接至经相同内切酶消化的载体，获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体，酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒人HeLa细胞，G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因，检测其对stathmin基因表达的干涉效果；流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果：经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒；RT—PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达；流式细胞仪分析结果显示，Hale细胞在stathminsiRNA作用下G2／M期细胞的比例明显增加。结论：survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2／M期，为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa细胞中stathmin基因的干涉作用

目的:探讨survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin基因表达的肿瘤特异性封闭作用。方法:合成针对人stathmin基因的siRNA cDNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体。PCR扩增suvivin基因启动子并测序,用EcoRI和BamHI分别双酶切,连接至经相同内切酶消化的载体,获得survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选。RT-PCR扩增stathmin基因,检测其对stathmin基因表达的干涉效果;流式细胞仪分析转染后HeLa细胞增殖周期的改变。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒;RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达;流式细胞仪分析结果显示,Hale细胞在stathmin siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。结论:survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达并使HeLa细胞阻断于G2/M期,为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

膜结合型干细胞因子促进白血病细胞K562的增殖和集落形成

目的:探讨膜结合型干细胞因子（membranebound stem cell factor,mSCF）在白血病细胞中的作用。方法：克隆并构建携可溶型干细胞因子（soluble stem cell factor,sSCF）前体的真核表达质粒pTARGETs,采用Overlap PCR法去除外显子6序列,进一步构建mSCF的表达质粒pTARGETm,DNA测序鉴定。通过脂质体介导分别将上述载体和空载体pTARGET转染白血病K562细胞,用G418筛选稳定表达细胞株,并用RTPCR、Western blotting法鉴定。通过CCK8细胞增殖实验以及集落形成实验观察不同细胞株体外增殖特点。结果：成功构建了sSCF和mSCF的真核表达载体,获得了稳定转染细胞株K562V、K562S、K562M。U底培养条件下,K562M增殖能力明显高于K562V和K562S（均P<0.01）。K562M集落形成率显著高于K562V 和K562S (均P<0.01),且集落形态大于其他两种细胞。结论： mSCF与Ckit之间的并置性作用显著促进白血病细胞的增殖。     

siRNA靶向EDAG-1基因对K562细胞株生长的影响

背景与目的：胚胎发育相关基因-1（EDAG-1）是造血系统发育相关的新基因，定位于9q22。本研究探讨抑制EDAG-1基因的表达对白血病细胞株生长的影响及其机制。方法：将靶向EDAG-1基因的特异序列连接到逆转录病毒载体中，脂质体介导的重组质粒转染包装病毒细胞（PT67），收集细胞上清感染K562细胞株，经嘌呤霉素筛选稳定抑制EDAG-1基因表达的细胞株，RT-PCR检测EDAG-1基因的抑制情况，应用MTT、流式细胞仪检测转染细胞的增殖能力及细胞周期。结果：成功构建了靶向EDAG-1基因的逆转录病毒重组质粒，建立了抑制EDAG-1基因表达的K562细胞株。抑制EDAG-1基因表达的细胞株增殖速度、增殖指数（PI）、增殖活性（SPF）相应降低，其G0／G1期细胞比例明显升高。结论：EDAG-1基因的沉默可以抑制白血病细胞株的增殖，使其阻滞在G0／G1期，提示EDAG-1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

表达的siRNA对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因的干涉作用

目的:构建针对人survivin基因的siRNA真核表达载体,检测其对人乳腺癌SKBr-3细胞中survivin基因表达的干涉作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒稳定转染入SKBr-3细胞,RT-PCR、Western blot印记杂交和细胞免疫化学法检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果:经酶切鉴定及基因测序证实,重组质粒中已插入目的基因片段.RT-PCR显示两个干涉载体均抑制了目的基因的转录;Western blot印记杂交和细胞免疫化学检测结果显示pSUPER-S1对蛋白表达的抑制作用更强.结论:成功地构建了针对人survivin基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,并在人乳腺癌细胞株SKBR-3中有效发挥了对survivin基因的干涉作用.     

人类前列腺凋亡反应因子4基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的人类前列腺凋亡反应因子4（Par-4）基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Par-4,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Par-4质粒为模板,PCR扩增Par-4基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞总蛋白,Western blotting检测Par-4表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Par-4载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,Western blotting证实转染细胞中存在Par-4蛋白的表达。结论　pIRES2-EGFP/Par-4表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的：运用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果：重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0.01）。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论：成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

BLCAP基因cDNA的克隆及siRNA表达载体的构建

目的：克隆BLCAP基因cDNA并构建和鉴定针对于BLCAP基因的siRNA真核表达载体.方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得BLCAP基因.将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定.将合成的siRNA核酸片段退火形成双链后连接到经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1真核表达载体,命名为pSilencer4.1-B1以及pSilencer4.1-B2,并进行酶切及测序鉴定.脂质体法转染SOSP-9607细胞系,G418筛选以及RT-PCR验证构建的真核表达载体对目的基因的干涉情况.结果：经酶切及测序鉴定,所获得的目的片段序列BLCAP基因完全相符.重组质粒中含有与理论值相符的插入片段,其测序结果与设计序列一致.经脂质体法转染后pSilencer4.1-B2可明显抑制SOAP-9607细胞的BLCAP表达.结论：成功克隆了BLCAP基因并cDNA构建和验证了其siRNA真核表达载体.     

RNAi沉默结肠癌细胞LOVO中livin基因的表达

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断结肠癌细胞系LOVO中livin基因的表达,并研究livin基因沉默后对LOVO细胞增殖和克隆形成产生的影响。方法:用真核转录载体pSilencerTM4.1-CMV neo构建针对livin基因的重组RNAi真核转录载体pSilencer4.1-L1和pSilencer4.1-L2,脂质体法转染结肠癌细胞系LOVO,通过RT-PCR、免疫印迹实验检测livin的表达变化,并用克隆形成实验、MTT法检测转染后LOVO细胞在细胞增殖、克隆形成等方面的变化。结果:重组载体pSilencer4.1-L1有效地阻断了LOVO细胞中livin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.01)。pSilencer4.1-L1转染LOVO细胞后,与对照组相比细胞生长速度明显变慢,其细胞数在72h时与对照组相比减少约30%;克隆形成率仅为15%,与对照组相比下降了约70%。结论:成功构建了可有效沉默livin基因的RNAi干涉载体,初步证明livin基因在结肠癌细胞的分化增殖等方面所起的重要作用,为进一步阐明livin基因与结肠癌的关系以及以livin基因为靶点的结肠癌基因治疗研究奠定了基础。     

用RNAi沉默survivin基因表达对前列腺癌细胞系PC3的影响

目的：运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术阻断前列腺癌细胞系PC3中survivin基因的表达，并研究survivin基因沉默后对PC3细胞产生的影响。方法：用真核转录载体pSilencer^TM3．1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体pSilencer3．1-SVVl、pSilencer3．1-SVV2和pSilencer3．1-SVV3，并用脂质体法转染前列腺癌细胞系PC3，通过RT—PCR、蛋白印迹实验检测survivin的表达变化，并用流式细胞术、MTT法检测转染后PC3细胞的凋亡、细胞周期、细胞生长速度、对顺铂的敏感性等方面的变化。结果：重组载体pSilencer3．1-SVV2和pSilencer3．1-SVV3有效地阻断了PC3细胞中survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达（P〈0．01）。重组载体转染PC3细胞后，与对照组相比，细胞的凋亡增加了10％～15％；细胞生长速度明显变慢，其细胞数在84h时与对照组相比减少约30％；G1期细胞增加了10％。G2期和S期细胞减少了5％以上。加入顺铂后，pSilencer3．1-SVV2、pSilencer3．1-SVV3重组质粒转染的PC3细胞的存活数下降了35％～45％，细胞凋亡则增加了10％-14％。结论：初步证明了survivin基因在前列腺癌细胞分化增殖、抗凋亡等方面所扮演的重要角色，为进一步阐明survivin基因与前列腺癌的关系以及以survivin基因为靶点的前列腺癌基因治疗研究奠定了基础。     

siRNA沉默HepG-2细胞B7-H3对细胞行为学影响的研究

目的:探讨siRNA方法沉默HepG-2细胞中B7-H3基因表达对细胞周期、增殖及迁移能力的影响.方法:设计合成针对B7-H3基因的siRNA及无关干涉siRNA序列,并分别构建干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/B7-H3及无关干涉载体pSilencer4.1-CMV neo/NC;采用脂质体LipofectamineTM 2000转染对数生长期肝癌细胞HepG-2,经G418筛选后获得相应细胞模型;利用RT-PCR和Western blot方法分别检测空白对照组(WT)、无关干涉组(si-NC)和B7-H3干涉组(si-B7-H3)细胞中B7-H3 mRNA及蛋白表达水平;利用CCK-8细胞增殖实验及克隆形成实验评价各组细胞增殖情况;利用碘化丙锭(PI)染色流式细胞术检测各组细胞周期分布情况;利用细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力.结果:成功构建了pSilencer4.1-CMV neo/B7-H3干涉载体.RT-PCR及Western blot结果显示,B7-H3干涉组较空白对照组、无关干涉组mRNA及蛋白水平明显下降;CCK-8增殖、克隆形成实验、细胞划痕实验及流式结果表明B7-H3干涉组增殖受到明显抑制,克隆较小且克隆数减少,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞迁移能力受抑制.结论:利用siRNA靶向干涉B7-H3表达可抑制HepG-2细胞增殖并诱导细胞周期阻滞,降低细胞迁移能力,实验结果为开发针对B7-H3靶点的肝癌免疫治疗提供了初步实验及理论基础.     

未知基因KH的真核表达载体构建及其对细胞增殖的影响

目的 构建未知基因KH的开放阅读框架(KH-ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH对细胞增殖的影响。方法 采用DNA重组技术构建KH-ORF的表达载体pCI-neo-KH-ORF,通过脂质体法转染COS-7细胞和K562细胞,RT-PCR检测目的基因的表达。采用流式细胞术检测：KH-ORF对COS-7细胞和K562细胞周期的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KH-ORF对COS-7细胞增殖速度的影响,生长曲线与乳酸脱氢酶(LDH)活性测定检测KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响。结果 (1)KH-ORF在COS-7细胞与K562细胞中获得表达。(2)KH-ORF对COS-7细胞的细胞周期与增殖速度无明显影响。(3)流式细胞术检测显示,KH-ORF使K562／pCi-KH-ORF细胞周期中S期细胞增多;生长曲线显示,KH-ORF促进K562／pCI-KH-ORF细胞增殖;LDH活性测定结果表明,K562／pCI-KH-ORF细胞LDH比活性上升,高于对照组细胞。结论 KH基因可能是一个与K562细胞增殖有关的白血病未知基因。     

stathmin基因SiRNA对人宫颈癌细胞的生长抑制作用

目的探讨S iRNA封闭stathm in基因表达对人宫颈癌细胞生长抑制作用。方法用Amb ion公司pS ilencer4.1CMV构建针对stathm in基因的S iRNA真核表达载体,以高表达stathm in基因的人宫颈癌Hale细胞系为靶细胞,脂质体法转染S iRNA表达载体,RT-PCR分析转染细胞stathm in基因表达;MTT试验观察stathm in S iRNA对Hale的生长作用影响;流式细胞仪分析细胞增殖周期的改变。结果stathm in S iRNA可有效封闭stathm in基因表达且明显抑制了宫颈癌Hale细胞的生长;Hale细胞在stathm in S iRNA作用下,细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡。结论stathm in基因对宫颈癌细胞的生长可能起十分重要的作用,它有望成为宫颈癌治疗的新靶点。     

反义 hTERT 基因对 K562 细胞凋亡及周期的影响简

目的：探讨反义hTERT基因抑制K562细胞端粒酶活性对其细胞周期及增殖的影响。方法：用脂质体介导反义hTERT基因和空载体质粒转染K562细胞株,绘制生长曲线,MTT法检测细胞活性,血清饥饿法同步化细胞周期,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率变化。结果：反义hTERT基因转染后,细胞生长明显受到抑制。细胞同步化后,流式细胞仪检测显示：KA组细胞出现早期凋亡峰,细胞阻滞于S期。但正常培养48h,各组细胞无明显凋亡,周期无显著差异。结论：反义hTERT基因可明显抑制K562的增殖,细胞同步化后具有促凋亡作用。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。