ESTABLISHMENT OF A CELL MODEL CONTAINING A DEFECTIVE FACTOR Ⅸ GENE

用电穿孔法将质粒Ａ（ｐＫＧ５－ｈＦⅨΔ３’ＮｅｏΔ５’）和选择基因（ｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１－ＴＫ）同时向体外培养的ＬＴＫ细胞内转移，再借助ＨＡＴ培养基选择系统和ＰＣＲ技术筛选出了五个细胞基因组上转入了质粒Ａ的ＬＴＫ细胞克隆，并建立了五个带有缺陷Ⅸ因子基因的ＬＴＫ细胞株，即凝血因子Ⅸ定点整合细胞模型     

抗人小细胞肺癌T细胞受体嵌合基因的克隆

目的克隆人小细胞肺癌抗体／Ｔ细胞受体嵌合基因。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术将人小细胞肺癌单克隆抗体的变区ＶＨ、ＶＫ与Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）恒区Ｃα、Ｃβ进行拼接，构建成ＶＨＣβ、ＶＫＣα嵌合ＴＣＲ，并分别克隆至ｐＭＡＭ、ｐＸＴ１真核表达载体。结果应用ＰＣＲ中重叠延伸剪接（ＳＯＥ）方法，能简化基因拼接步骤；该嵌合基因的克隆有助于对肿瘤免疫治疗新途径的探索。     

免疫聚合酶链反应技术的建立及其对胃癌细胞上MG_7－Ag的检测

作者首次报道将聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术用于检测非核酸物质－胃癌相关抗原，建立了免疫－ＰＣＲ技术。首先制备胃癌单抗及重组ＤＮＡ的嵌合体即ＭＧ７—ｐＸＪ１９，以将抗原抗体反应的专一性同ＰＣＲ技术的高敏感性相结合，构建一种集ＡＢＣ及ＰＣＲ一体的双重放大系统。利用这种技术检测胃印戒细胞癌株ＫＡＴＯⅢ肿瘤相关抗原，并与ＥＬＩＳＡ法比较其敏感性。结果表明应用免疫－ＩＣＲ技术ＫＡＴＯⅢ细胞数目在２０个时即可出现阳性结果，敏感性较ＥＬＩＳＡ法高出１０４倍。若以０．２５％戊二醛固定相同数量（２×１０６／ｍｌ）ＫＡＴＯⅢ细胞后加入不同浓度的ＭＧ７－ｐＸＪ１９嵌合体，则免疫－ＰＣＲ检测结果呈阳性时所需ＭＧ７－ｐＸＪ１９为３．８×１Ｏ－１４ｍｏｌ，而ＥＬＩＳＡ法需３．０×１０－１１ｍｏｌ。研究结果表明，免疫－ＰＣＲ技术可用于肿瘤相关抗原的检测，具有高敏感性，高特异性，结果稳定且重复性满意。     

人His6—IFNhγ／TNFβ（His6—γTNFβ）融合蛋白（包涵体）的 …

应用ｐＥＴ２８（含Ｔ７ｌａｃ启动子和Ｈｉｓｔ－ｔａｇ）质粒，将人γＴＮＦβ融合基因之组建成ｐＥＴγＬＴ表达质粒，并转化于Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。本文对ｐＥＴγＬＴ／ＢＬ２１（ＤＥ３）工程菌的Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ重组产物进行了诱导表达，分离纯化的研究。结果表明，该工程菌用ＬＢ培养基在３７℃扩增至ＯＤ５９０为０．５左右，加ＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导５小时，此时Ｈｉｓ６－γＴＮＦβ的     

大蒜素和亚硒酸钠对结肠癌细胞微卫星序列不稳定的抑制作用

目的：以ＲＥＲ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒ）表型的结肠 主靶细胞,研究大蒜素（ｄｉａｌｌｙｌｉｒｉｓｕｌｆｉｄｅ,ＤＡＴ）和亚硒酸钠对肿瘤细胞微卫星序列（ｍｉ＃ｅｒｏｓａｔｅｌｌｉｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ,ＭＳ）突变的影响。方法：将含有外源性ＭＳ,（ｃａ）１４,的穿梭质粒ｐＣＭＶ－ＣＡＲ转染ＲＥＲ＾＋或ＲＥＲ－结肠癌细胞株ＲＫＯ或ＳＷ４８０。外源性（ｃａ）１４的突变可使质料标记基因ＬａｃＺ恢     

p14ARF基因抑制肿瘤细胞增殖的研究

目的：从正常人肝细胞系Ｌ０２细胞中扩增人的肿瘤抑制基因Ｐ１４＾ＡＲＦ,以研究其对人的多种肿瘤细胞生长的影响。方法：应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从培养的下沉人肝细胞系Ｌ０２细胞中扩增出０．４Ｋｂ的Ｐ１４＾ＡＲＦＣＤＮＡ片段,测序正确后郫具核表达载体ｐｃＤＮＡ３上的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点,命名为ｐｃＤＮＡ３ＡＲＦ。此质粒同脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ＾ＴＭ介导转染肿瘤细胞Ｈｅｐ２、ＫＢ、ＫＢ－ｖ２０     

肺癌p14ARF和p16INK4a基因协同表达缺失及其意义

目的：研究抑癌基因位点ＩＮＫ４ａ－ＡＲＦ在肺肿瘤细胞中的表达状况,揭示ｐ１４ＡＲＦ和ｐ１６ＩＮＫ４ａ协同表达缺失与肺癌发生发展的相关性。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ对６株肺癌细胞（ＳＰＣ－Ａ－１,Ｃａｌｕ－１,Ｈ４４６,ＳＨ７７,Ａ５４９,Ｈ４６０）的ＩＮＫ－４ａ－ＡＲＦ基因位点在ｍＲＮＡ、蛋白水平上进行检测,对ＰＣＲ产物进行纯化和测序分析。结果：６株肺癌细胞中,有３株细胞（Ｈ４     

儿童急性淋巴细胞白血病中p15基因缺失及转录异常的研究

目的：探讨ｐ１５基因缺失及表达异常在儿童急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）发病中的作用。方法;采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测了５３例儿童ＡＬＬ骨髓样品中ｐ１５基因的缺失;用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ０检测了２９例样品中ｐ１５ ｍＲＮＡ的转录。结果：全部被检样品中ｐ１５基因缺失１１例,缺失率为２０．８％,其中,９例Ｔ细胞型ＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ）中５例显示有ｐ１５基因缺失,缺失率５５．６％;而     

细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒

目的：采用细菌内同源重组法高效制备含ＣＤ、ＴＫ融合自然基因重组体腺病毒。方法：ＣＤ、ＴＫ融合基因ＣＤｇｌｙＴＫ自载体ｐＷＺＬｎｅｏＣＤｇｌｙＴＫ中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒ｐＡｄｔｒａｃｋＣＭＶ－ＣＤｇｌｙＴＫ,将之Ｐｍｅｌ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒ｐＡｄｅａｓｙ０１共转化ＢＪ５１８３菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒ＤＮＡ,Ｐａｃｌ酶切后转染２９３细胞包装成腺病毒颗粒,采用ＰＣ     

真核生物水稻的苯丙氨酸氨解酶基因在原核生物大肠杆菌BL21DE3中的表达

目的：研究真核生物水稻的苯丙氨氨氨解酶基因在原核生物大肠杆菌中表达及其规律，为酶替代疗法治疗苯丙酮尿症及某些肿瘤治疗奠定基础。方法：根据水稻苯丙氨酸氨解酶基因序列，在ＡＴＧ下游１３１－１１２碱基处设计引物：５’ＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＴ３’，对质粒ｐＵＣ１９－ｒＰＡＬ－１－ｃＤＮＡ（日本国立农业生物研究所Ｅｉ－ｉｃｈｉＭｉｎａｍｉ惠赠）中的ｒＰＡＬ－１－ｃＤＮＡ进行反向测序，根据ｃＤＮＡ测序结果及质粒ｐＥＴ－２８系列中阅读框架结构选定ｐＥＴ－２８ｃ作为载体，用ＥｃｏＲＩ酶将其从多克…     

人CEA启动子调控ADP核糖化毒素基因治疗大肠癌

目的 应用ＡＤＰ核糖化细菌毒素基因探讨对ＣＥＡ阳性大肠癌的组织特异性基因疗法。方法 从铜绿假单孢菌基因组ＤＮＡ和质粒ｐＥＴ１５ｂ－ＤＴ中分别克隆假单孢菌外毒素Ⅱ＋Ⅲ区基因（ＰＥＡ）和白喉外毒素Ａ链（ＤＴＡ）基因，引入Ｋｏｚａｋ序列，终止信号和酶切位点，测序后置于ＣＥＡ启动子调控下克隆到逆转录病毒载体中。研究体外表达和裸鼠体内抗肿瘤能力。结果 体外荧光素酶共转染试验证明ＣＥＡ启动子调控的毒性基因在Ｃ     

重组腺病毒介导入野生型p53,GM-CSF和B7-1基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响

目的：探讨重组腺病毒分导入野生型ｐ５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因对肿瘤化疗耐药细胞生物学行为的影响,为临床使用该重组腺病毒治疗多药耐药的肿瘤提供实验基础。方法：选用ｐ５３异常的ＫＢ－ｓ（ＶＣＲ敏感）和ＫＢ－ｖ２００（ＶＣＲ耐药）细胞作为肿瘤化疗药物敏感和耐药的模式细胞,感染携带人野生型ｐ５３,ＧＭ－ＣＳＦ和Ｂ７－１基因的重组腺病毒后,观察这两种转基因癌细胞的生物学行为（包括药物敏感性）的变化。结果：药物敏感和耐药细胞都对腺病毒易感,重组腺病毒携带的三个外源基因（ｐ５３、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１基因）在两种细胞中都能得到有效表达,并且能抑制它们的生长及诱导其凋亡。耐药细胞 ＫＢ－ｖ２００在转染该重组腺病毒 ４８ｈ后,其细胞膜上 Ｐｇｐ糖蛋白的泵出药物的功能却受到显著影响,表现为罗丹明１２３在其细胞内的积累增加。ＭＴＦ的实验结果也显示出其对ＶＣＲ药物敏感性的增加,裸鼠体内实验证实了感染上述重组腺病毒的ＫＢ－ｖ２００细胞的致瘤性降低,同时能增加对化疗药物ＶＣＲ的敏感性。结论：实验研究结果提示,使用该重组腺病毒并结合化疗药物,对临床治疗多药耐药的肿瘤可能会更有效。     

多聚阳离子对非病毒载体转移效率的影响*

目的：制备Ｔ淋巴瘤ＴＣＲＶβ核酸疫苗。方法：利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出人Ｔ淋巴瘤细胞Ｊｕｒｋａｔ的ＴＣＲ　Ｖβ基因片段,并将其重组入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３。用重组表达载体转染ＳＰ２／０细胞,在ｍＲＮＡ水平上检测其表达。再用ｐｃＤＮＡ３和重组载体分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,收集抗血清,用免疫组化技术检测抗体产生情况。结果：扩增出ＴＣＲ Ｖβ的基因片段,测序结果证实其序列与已发表的一致。并构建出重组表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＴＣＲ Ｖβ。该质粒转染到 ＳＰ２／０细胞,可在ｍＲＮＡ水平上检测到其表达。在用ｐｃＤＮＡ３－ＴＣＲＶβ免疫的小鼠抗血清中检测到抗Ｊｕｒｋａｔ细胞 ＴＣＲ Ｖβ的抗体。免疫组化结果表明,该血清不与表达 ＴＣＲγδ的人Ｔ淋巴瘤细胞发生反应,而与转染该基因的ＳＰ２／０细胞产生强阳性反应。正常小鼠血清与ｐｃＤＮＡ３免疫的小鼠血清与Ｊｕｒｋａｔ细胞不产生显色反应。结论：所制备的Ｔ淋巴瘤ＴＣＶβ核酸疫苗能有效地诱导机体产生体液兔疫反应。     

高转移人肺巨细胞癌细胞67—KD层粘连蛋白受体基因表达

在逆转录ＰＣＲ特异扩增６７－ＫＤ层粘连蛋白受体（简称ＬＮ－Ｒ）ｃＤＮＡ片段并制备成探针的基础上，观察了高转移人肺巨细胞癌（简称ＰＧ）细胞和低转移人肺腺癌（简称ＰＡａ）细胞６７－ＫＤＬＮ－Ｒ ｍＲＮＡ表达水平。结果表明，两种细胞存在大小相同的特异转录体，约１．７ｋｂ左右；高转移ＰＧ瘤细胞比低转移ＰＡａ瘤细胞表达较高水平的６７－ＫＤＬＮ－Ｒ ｍＲＮＡ，同时ＰＧ瘤细胞存在明显的该基因扩增；不同剂量６７－     

利用Genescan分析TCR Vβ亚家族CDR3长度的方法检测AML的T细胞克隆性

目的 分析急性髓性白血病（ＡＭＬ）的Ｔ细胞克隆性，方法 利用反转－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法分析５例ＡＭＬ，８例正常人的外周血单个核细胞和Ｔ细胞株Ｊｕｒｋａｔ的Ｔ细胞受体ＴＣＲＶβ２４个亚家族的互补决定区３（ＣＤＲ３）长度，ＰＣＲ产物进一步进行基因扫描（ｇｅｎｅｓｃａｎ）和核苷酸序列分析，结果 ＲＴ－ＰＣＲ分析显示８例正常人外周血单个核细胞除Ｖβ２０外，存在各Ｖβ亚家族的Ｔ细胞，而５例病人则仅     

Ad—p53与Ad—p16联合对人肺腺癌GLC—82细胞作用的研究

目的：探讨腺病毒介导的ｐ５３与ｐ１６基因联合对人肺腺癌ＧＬＣ－８２疗效提高的可能性。方法：将分别携有ｐ５３基因、ｐ１６基因重组腺病毒（Ａｄ－ｐ５３与 Ａｄ－ｐ１６）联合使用,通过细胞生长和存活实验、克隆形成实验、流式细胞分析、ＴＵＮＥＬ检测、ＲＴ－ＰＣＲ分析、免疫组织化学实验,观察其对人肺腺癌ＧＬＣ－８２细胞的作用。结果：在总感染强度相同的前提下,Ａｄ－ｐ５３与Ａｄ－ｐ１６联合导入ＧＬＣ－８２细胞,对细胞生长存活及克隆形成能力的抑制、以及所造成的凋亡效果比施用单种基因的效果强,表明ｐ５３基因与ｐ１６基因在体外疗效上互为协同。结论：Ａｄ－ｐ５３与Ａｄ－ｐ１６联合,可以提高对人肺腺癌ＧＬＣ－８２细胞的疗效。     

bcl-2反义基因调控对人宫颈癌裸鼠移植瘤体内治疗的探讨

ｂｃｌ－２基因与宫颈癌关系密切，本研究采用回体转移法（Ｅｘ ｖｉｖｏ）和活体直接转移法（Ｉｎ ｖｉｖｏ）观察反义ＯＤＮ及反义ＲＮＡ作用于移植瘤的治疗效果。１材料与方法１．１一般资料 硫代磷酸修饰ｂｃｌ－２脱氧寡核苷酸（上海生工生物工程有限公司），反义链（ＡＯＤＮ）５＇－ＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＣ—３＇；无义链（ＮＯＤＮ）５＇－ＴＣＧＣＣＡＣＴＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＧ—３＇。含反义 ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ部分序列（６２２ｂｐ）的质粒ｐＤＯＲ－ＡＢ（７．１２ｋｂ）由第四军医大学王成济教授惠赠…     

p14^ARF对照射后肺癌细胞加速再群体化抑制效应

目的 探讨抑癌蛋白ｐ１４＾ＡＲＦ功能恢复对照射后肺癌细胞加速再群体化的影响。方法以ＡＲＦ基因纯合缺失但表达野生型ｐ５３的人肺腺癌Ａ５４９和Ｈ４６０细胞为靶细胞，应用Ｆｕｇｅｎｅ６对照射后的细胞进行ｐＣｌ－ｎｅｏ－ｐ１４＾ＡＲＦ表达载体基因转染，检测照射前后和转染前后细胞潜在倍增时间（Ｔｐｏｔ）、细胞周期分布及克隆存活率变化。结果 ６ＧｙＸ射线照射后９６ｈ处，Ａ５４９和Ｈ４６０细胞Ｔｐｏｔ分别缩短２     

非小细胞肺癌p16基因突变的初步研究

为了解非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ｐ１６基因突变的情况,本研究应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测了２４例ＮＳＣＬＣ肿瘤组织中ｐ１６基因外显子２的突变情况,现将结果报告如下。１　材料与方法２４例ＮＳＣＬＣ肿瘤组织及同一病例非肿瘤肺组织均为住院病例手术切除标本,并经病理证实。按常规方法提取ＤＮＡ。ＰＣＲ反应在ＰＥ９６００热循环仪中进行,扩增ｐ１６基因第２外显子,引物序列：　　ＰＳ１：５′－ＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣ－３′ＰＳ２：５′－ＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧ－３′循…     

幽门螺杆菌及其cagA因子对胃粘膜中原癌基因蛋白表达的影响

目的：探讨幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染告别是其细胞毒素相关基因（ｃａｇＡ因子）与胃粘膜中ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、ｐ２１－ＷＡＦ１、ｐ１６－ＭＴＳ１蛋白表达异常的关系。从而从分子水平初步探讨ｃａｇＡ是否为一致癌因子及其可能的一致癌的机理。方法：１、利用血抗Ｈｐ－ＩｇＧ、ＲＵＴ、ＰｃＲ－Ｈｐ－ＤＮＡ３种方法２７０例病人的ＨＰ感染情况及ｃａｇＡ＊Ｈｐ感染情况。２、利用免疫组化Ｓ－Ｐ法检测胃癌演化系列胃粘膜中ｂｃｌ