体外构建尿路上皮细胞-胶原膜的组织工程复合物

目的：将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到聚乙烯醇改良的牛Ⅰ型胶原膜上，观察体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性。 方法：实验于2005-03／05在广东省人民医院医学研究中心完成。①猪膀胱移行上皮细胞的原代及传代培养。②测定膀胱移行上皮细胞在胶原膜浸提液中增殖率：取第2，3代细胞用角化细胞无血清培养基将细胞制成悬液，分为对照组（正常角化细胞无血清培养基）和实验组（浸提液）进行培养，分别于第1，3，7天，采用四甲基偶氮唑盐法观察细胞增值率（实验组A490值／对照组A490值&;#215;100％），并参照美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系对材料进行毒性评级。③通过组织学观察和扫描电镜观察，了解细胞在胶原膜支架上的黏附和生长情况。 结果：①猪膀胱移行上皮细胞可在体外培养至第9代。②第1，3，7天实验组细胞相对增殖率分别为：94．59％，100．95％和82．42％，与对照组（100％）比较差异无显著性（P〉0．05）。胶原膜细胞毒性为Ⅰ级（无细胞毒性）。③细胞在胶原膜上黏附、生长和增殖良好。 结论：该方法可成功培养扩增猪膀胱移行上皮细胞，胶原膜与膀胱移行上皮细胞生物相容性良好。该细胞可与胶原膜复合构建成可移植的组织工程膀胱黏膜替代物，有望用于新膀胱的移行上皮改造。     

膀胱脱细胞基质片的制备及其与尿路上皮细胞的联合培养

目的:将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到自制的膀胱脱细胞基质(BAM)片上,探讨此法体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性.方法:取新鲜猪膀胱制备BAM片,将原代猪膀胱移行上皮细胞进行体外培养、扩增后接种到BAM片上,培养成多层细胞结构的组织工程复合物.通过组织学观察,了解所制备的BAM结构及细胞在BAM片支架上的黏附及生长情况.结果:此法制备的BAM片具有较完整的胶原结构.细胞在BAM片上黏附、生长和增殖良好,可形成多层细胞的组织工程复合物.结论:该方法可成功培养猪膀胱移行上皮细胞.制备的BAM片生物相容性良好.膀胱移行上皮细胞与BAM片联合培养构建成具有多层细胞的组织工程膀胱黏膜替代物,有望用于新膀胱的移行上皮重建.     

纳米银猪脱细胞真皮敷料的细胞毒性评估

背景:传统的猪皮敷料具有保护创面的作用,但不具有主动抗感染功能.目的:评估自制纳米银猪脱细胞真皮敷料的体外细胞毒性,评价其作为新型敷料的可行性.方法:用四甲基偶氮唑盐比色法检测自制纳米银猪脱细胞真皮敷料100%和50%的浸提液对小鼠成纤维细胞(L-929细胞)相对增殖率的影响,并评价其细胞毒性.倒置显微镜观察各组细胞形态变化,培养2,4,7d后用酶联免疫检测仪测定溶液吸光度值来评估细胞毒性.结果与结论:L-929细胞在自制纳米银猪脱细胞真皮敷料的浸提液中增殖良好,其细胞毒性实验显示细胞毒级为1级,实验组与阴性对照组之间的吸光度值差异均无显著性意义(P＞0.05).说明自制纳米银猪脱细胞敷料无细胞毒性,作为新敷料具有可行性.     

兔膀胱移行上皮细胞的体外培养

目的:对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,探索用于泌尿系统组织工程的膀胱移行上皮种子细胞的最佳培养方法。方法:实验于2005-09/2006-01在吉林大学药学院生物工程实验室完成。①取1月龄新西兰大耳白兔,耳缘静脉行空气栓塞处死,超净台内无菌取膀胱。②采用中性蛋白酶分离膀胱各层组织。③胰蛋白酶消化获得膀胱移行上皮细胞。④将获取的膀胱移行上皮细胞分别接种到含体积分数为0.01,0.05,0.1血清的DMEM-F12培养液进行培养。④每日在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况;分别在第1,3,5,7,9天以四甲基偶氮唑盐法作细胞生长曲线。结果:①原代移行上皮细胞于接种后34～48h贴壁,培养六七天时可达80%融合,呈典型铺路石状。②传代后的细胞生长稳定快速,24～36h贴壁,五六天可达80%融合。③应用四甲基偶氮唑盐法检测不同体积分数血清对移行上皮细胞增殖的影响,显示膀胱移行上皮细胞在含有体积分数为0.05血清的DMEM-F12培养中生长状态最佳。结论:采用中性蛋白酶与胰蛋白酶联合消化法,对兔膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养,是一种稳定、快速的膀胱移行上皮细胞的培养方法。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的:探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术;观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。方法:实验于2005-04/07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板(对照组)和纤维蛋白凝胶包被的培养板(实验组),于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板,在不同融合度(70%,100%)时将细胞消化传代,以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板,比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞,以相同密度接种于96孔板,以含不同浓度抑肽酶(0,37.5,75,150,300kIU/mL)的keratinocyte-SFM培养,4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况(不含抑肽酶者为对照组)。结果:①移行上皮细胞生长良好,多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好,4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[(8.67±1.45)%,(9.33±1.76)%,P>0.05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力,且70%融合组传代细胞克隆形成率显著高于100%组[(18.2±1.08)%,(12.8±1.35)%,P<0.05]。④抑肽酶在300kIU/mL时对细胞生长有显著抑制作用;而在其他浓度时则不明显。结论:①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠,多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好,传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

新型抗钙化牛颈静脉管道材料的体外细胞毒性评价

背景:TritonX-100、环氧氯丙烷联合改性处理戊二醛固定的牛颈静脉管道是一种新型抗钙化右心管道材料,其生物相容性方面的研究较少。目的:评价新型抗钙化牛颈静脉管道的体外细胞毒性。方法:通过CCK-8法检测新型抗钙化牛颈静脉管道(实验组)及单纯戊二醛处理牛颈静脉管道材料浸提液(对照组)对L-929小鼠成纤维细胞的毒性作用,以第2,4天为检测时间点,计算细胞相对增殖率、对材料毒性进行分级。结果与结论:CCK-8法细胞毒性试验显示新型抗钙化牛颈静脉管道材料浸提液第2,4天L-929细胞增殖率均在85%以上,毒性分级为1级,无细胞毒性,且显著优于对照组(P<0.05)。提示经戊二醛、TritonX-100、环氧氯丙烷联合处理制备的新型抗钙化牛颈静脉管道材料无细胞毒性。     

纳米Ag-SiO2导尿管对人体外尿道黏膜细胞的毒性

背景：纳米Ag-SiO 2目的：将人前列腺部尿道上皮细胞置于纳米Ag-SiO导尿管抗菌作用突出，明显减少了长期留置尿管所致的泌尿系感染。在追求纳米银医疗产品优异抗菌性的同时，人们也越来越重视其生物安全性。2导尿管浸提液中培养，评价纳米Ag-SiO 2方法：分别以普通导尿管浸提液、纳米Ag-SiO导尿管的生物学安全性。2结果与结论：纳米Ag-SiO导尿管浸提液及普通细胞培养液培养前列腺增生症患者前列腺部尿道上皮黏膜细胞，培养2，5，7 d，通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT），用酶标仪测定各培养间期各组体外细胞的吸光度值，计算细胞相对增殖率，同时通过倒置显微镜观察细胞的形态、生长和增殖情况，定量和定性地进行毒性评价及比较。2导尿管浸提液细胞毒性为1级，普通导尿管浸提液细胞毒性为0、1级，细胞相对增殖率组别效应无统计学差异（F=0.544，P=0.475）；细胞相对增殖率时间效应有统计学差异（F=3.031， P=0.086）；组间与时间之间交互作用无统计学差异（F=0.130，P=0.879）。结果表明纳米Ag-SiO2导尿管对不同培养间期细胞的生长繁殖影响微弱，符合医疗器械生物学评价标准。     

纳米载银磷酸锆抗菌聚氨酯的细胞毒性检测

背景:聚氨酯是一种研究热门的医用高分子材料,并在许多人工器官和医疗装置中发挥着至关重要的作用.目的:制备并观察纳米载银磷酸锆抗菌聚氨酯生物材料对L929细胞增殖活性的影响及细胞毒性反应.方法:采用MTT法检测各组抗菌聚氨酯对传代培养小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,L929细胞接种于96孔板,随机分为3组进行培养,实验组用抗菌聚氨酯浸提液处理,阳性对照组用苯酚溶液,阴性对照组用高密度聚乙烯浸提液,于24,48,72 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态,通过MTT比色法检测各组细胞的相对增殖率,并评价材料的细胞毒性.结果与结论:实验组作用于小鼠成纤维细胞24,48,72 h后,相对增殖率分别为94.3%~97.9%,94.5%~99.8%和90.8%~96.3%,材料细胞毒性评级为Ⅰ级.提示添加低浓度纳米载银无机抗菌剂RHA-2(添加比例<5%)的热塑性聚氨酯,无细胞毒性,符合医用生物材料安全标准.     

骨粉/聚乳酸内固定材料的细胞毒性试验

[目的]分析骨粉/聚乳酸内固定材料的细胞毒性,为临床应用做前期准备.[方法]应用四唑盐比色法检测骨粉/聚乳酸内固定材料浸提液的细胞毒性,光学显微镜观察细胞在浸提液中的形态变化;扫描电子显微镜观察材料膜上细胞的黏附.[结果]骨粉/聚乳酸材料浸提液没有细胞毒性,成纤维细胞能在复合材料上黏附.[结论]骨粉/聚乳酸内固定材料无细胞毒性,细胞相容性良好.     

胶原海绵支架体外构建组织工程膀胱黏膜

背景:组织工程膀胱黏膜层的构建在组织工程膀胱修复中占有重要的地位,但目前并没有最合理的构建方法。目的:探讨胶原海绵支架复合猪膀胱尿路上皮细胞体外构建膀胱黏膜结构的可行性。方法:刮取猪膀胱黏膜层后用酶消化方式进行猪膀胱尿路上皮细胞原代培养,并进行尿路上皮细胞标志物免疫荧光和RT-PCR鉴定。制备疏松多孔的胶原海绵支架材料,将第3代尿路上皮细胞接种在胶原海绵支架上,体外培养4～8d后观察尿路上皮细胞和胶原海绵材料的复合情况。结果与结论:原代培养的猪膀胱尿路上皮细胞呈"多角形"、"铺路石"样,以克隆团形式生长。免疫荧光鉴定AE1/AE3阳性,RT-RCR检测uroplakin-ⅠA、uroplakin-Ⅱ阳性。胶原海绵复合尿路上皮细胞体外培养4～8d后,细胞在胶原海绵支架上生长良好,覆盖胶原材料的表面并长入材料内部,保持了尿路上皮细胞的特性。体外培养6d时,尿路上皮细胞与胶原支架复合效果最好,同时细胞数量也最多。结果初步表明了胶原海绵复合膀胱尿路上皮细胞可以构建组织工程膀胱黏膜,且体外培养6d为最佳时间点。